Summary
In diesem Artikel zeigen wir wie die absorbierenden Microbiopsy-Technik durchgeführt wird und wie die Probe für die RNA-Extraktion für einfache und gleichzeitige Probenahme von Haut und Blut in einer minimal-invasive Weise verwendet werden kann.
Abstract
Konventionelle Hautbiopsie schränkt die klinische Forschung, die kosmetisch empfindlichen Gebieten oder pädiatrischen Anwendungen aufgrund ihrer Invasivität beinhaltet. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Verwendung einer absorbierenden Microneedle-basierten Gerät, saugfähige Microbiopsy für minimal-invasive Probenentnahme von Haut und Blut-Gemisch. Unser Ziel ist es, rasche Fortschritte in der klinischen Forschung, die Einrichtung von Biomarkern für Hautkrankheiten und Verringerung des Risikos für die klinische Forschungsteilnehmer erleichtern. Im Gegensatz zu herkömmlichen Haut Biopsie-Techniken die saugfähige Microbiopsy kann innerhalb von Sekunden durchgeführt werden und erfordert keine Intensivtraining durch ihr schlichtes Design. In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung von saugfähigen Microbiopsy, einschließlich Beladung und Anwendung auf freiwilliger. Dann zeigen wir wie Sie RNA aus der absorbierten Probe isolieren. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von quantitativen reversen Transkription PCR (RT-qPCR), mRNA Ausdruck Niveaus von Blut (CD3E und CD19) und Haut (KRT14 und TYR) zu quantifizieren. Die Methoden, die wir beschreiben, nutzen aus dem Regal-Kits und Reagenzien. Dieses Protokoll bietet einen minimal-invasiven Ansatz für simultane Abtastung von Haut und Blut innerhalb der gleichen absorbierenden Microbiopsy-Matrix. Wir haben menschliche Ethik-Kommissionen, Kliniker und Freiwillige zu unterstützen dieses Ansatzes für die dermatologische Forschung gefunden.
Introduction
Hautbiopsie ist eines der wichtigsten Techniken in der Dermatologie für die Probenahme der Haut und nachfolgende Diagnose von Hauterkrankungen durch histopathologische Beurteilung. Die Biopsie Technik beinhaltet eine medizinische Fachkraft, die mit einer Klinge oder Punch Biopsie um die verdächtige Läsion auf der Haut des Patienten für Prüfung1zu entfernen. Obwohl die Technik wirksam ist, ist sehr invasiv und klinischen Forschung begrenzt, da der Endpunkt in der Regel molekularbiologischen Techniken2,3beinhaltet. Molekulare Analyse von Hautkrankheiten hat das Potenzial, histopathologische Analyse kann nicht, und erleichtert so Drug Discovery und Krankheit Diagnose4,5, hochspezifische biologische Informationen bereitstellen. Außerdem kann die Probe-Nachfrage in den molekularen Techniken ist vergleichsweise gering und führen zu einem Rückgang der Tiernutzung und erlauben eine größere Anzahl von Wiederholungen. Deshalb gibt es eine klare Notwendigkeit eine alternative Technik, die molekulare Analyse in der klinischen Forschung ermöglicht und senkt Risiko für die Teilnehmer.
Um ein solches Bedürfnis im Bereich zu begegnen, hat unsere Gruppe entwickelt eine neuartige Microneedle-basierte Diagnoseplattform, saugfähige Microbiopsy, die die Sammlung von einer winzigen Menge an Haut vermischt mit Blut in eine einfache und minimal-invasive Weise6ermöglicht. Diese Publikation dient zum saugfähige Microbiopsy als Sampling Tool für molekulare Analyse durch RNA-Extraktion in der klinischen Forschung beschreiben.
Bisher haben wir die erste Version des Microbiopsy, Haut Microbiopsy, beschrieben, besteht aus einer Mikronadel machte eine Stahlplatte Dreischicht-Design, winzige Stückchen Haut Gewebe7zu extrahieren. Die Neuheit dieses Gerätes kommt durch mehrere Kontaktstellen von der Microneedle, die effiziente Gewebe Extraktion3ermöglicht. Im Gegensatz dazu eine kreisförmige Haut Stanzbiopsie bietet nur eine Anlaufstelle und einfach reißt die Haut ohne jede Probe in einigen Fällen erfassen. Basierend auf der Haut Microbiopsy, entwickelten wir vor kurzem die saugfähige Microbiopsy, die Blut und Haut sampling-Funktionen hat. Das Gerät hat sich gezeigt, zur Verwendung in ressourcenarmen Bereichen in einem jüngsten epidemiologischen Studie6realisierbar.
Aufgrund des einfachen Designs saugfähige Microbiopsy kann innerhalb weniger Sekunden durchgeführt werden und erfordert keine Schulung. Zusätzlich örtlicher Betäubung ist nicht erforderlich, und die Applikationsstelle verursacht keine Narben. Dieses Protokoll ermöglicht Forscher oder Mediziner ohne relevante Sampling training, gezielte Hautdaten für die molekulare Analyse zu erhalten. Wir erwarten Microsampling Geräte in Zukunft zur Routine in der Hautforschung.
Obwohl die Microbiopsy in anderen Haut-Krankheit-Studien berichtet worden ist, die molekularen Diagnosetechniken6,8,9,10, wie HPV-DNA-Nachweis, dieses Protokolls beteiligt ist die erste, der die Details der Probe Gewinnung und Verarbeitung Techniken für saugfähige Microbiopsy zu demonstrieren. Darüber hinaus ist dies der erste Bericht beschreibt die relative gen Ausdruck Profilierung von Haut und Blut Zellen in Microbiopsy Proben.
Protocol
Die Studie wurde von Metro South menschliche Forschung Ethik-Kommission und der University of Queensland menschlichen Forschungsethikkommission (HREC-13-QPAH-551 und UQ2013001551) und der University of South Australia menschliche Ethik-Kommission (200607) genehmigt.
(1) saugfähige Microbiopsy Fertigung
- Laser schneiden Microneedle Teile von 50 µm medizinischem Edelstahlblech und absorbierende Schicht (Filterpapier) bzw. (Abbildung 1).
Hinweis: Andere Teile, einschließlich der Kolben und das Gehäuse des Gerätes werden mit Rapid-Prototyping-Techniken, wie der 3D-Druck hergestellt. - Alle Teile, außer der absorbierenden Schicht, in 70 % igem Ethanol (EtOH) für 5 min einweichen und Luft trocknen für 30 min danach.
- Montieren Sie den Dreischicht-Microneedle mit der absorbierenden Schicht in der Mitte (Abb. 1a).
- Legen Sie die montierte Microneedle in den Schlitz des Kolbens.
- Die Feder setzen Sie auf und legen Sie den Kolben in das Gehäuse (Abbildung 1 c). Vermeiden Sie die Microneedle etwas in der Montage Verfahren zur Gewährleistung der Qualität der Nadel zu berühren.
- Versiegeln der montierten saugfähige Microbiopsy in einem Paket für γ-Strahlung Sterilisation vor der Verwendung.
2. Probenahme mit der absorbierenden Microbiopsy
- Tragen Sie Einweg-Handschuhe und Spray Hände und Werkzeuge wie Zangen, mit 70 % EtOH.
- Desinfizieren Sie die Applikationsstelle mit Alkohol.
- Entfernen Sie die Microbiopsy aus dem γ-Strahlung sterilisiert Paket ohne die Microneedle dabei zu berühren.
- Laden Sie das Gerät durch Ziehen an den Kolben zum Komprimieren von Frühjahr bis gibt es "Klick" Ton und die Kolben Sperren im Ort.
- Ziel ist das Gerät auf die Haut abgetastet werden, um sicherzustellen, dass die Probenahme befindet sich in einer festen Position.
- Stellen Sie sicher, dass das Gerät etwa senkrecht auf die Haut, dann ≥1 kg Kraft auf das Gerät auf die Haut anwenden.
Hinweis: Kraftaufwand nach unten in die Haut ist erforderlich, um ausreichend Eindringen von der Microneedle sicherzustellen. - Drücken Sie den Auslöser und halten Sie das Gerät im Platz für mindestens 10 s für die Blutprobe aufgenommen werden.
Hinweis: Wenn das Gerät zuvor 10 freigeschaltet ist s, gibt es weniger Probe gefangen genommen.
(3) RNA-Extraktion
Hinweis: Die RNA-Extraktionsverfahren wurden von Hersteller Protokoll für optimale Isolierung von RNA aus Microbiopsied Probe geändert. Alle Reagenzien und Spalte in RNA-Extraktion verwendet sind im Kit enthalten, sofern nicht anders angegeben.
- Herausziehen der Kolben und saugfähige Microneedle aus dem Gehäuse mit den Händen sanft. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Microneedle beim Entfernen nicht mit nichts in Berührung kommt.
- Entfernen Sie saugfähige Microneedle aus den Kolben. Die beiden Löcher an der Microneedle mit einer sterilen Pinzette festhalten Sie und ziehen Sie ihn heraus.
- Setzen Sie die intakte Microneedle in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch (nicht aus dem RNA-Isolierung-Kit; siehe Tabelle of Materials) vorausgefüllt mit 50 µL Extraktionspuffer, mit der Nadel-Seite nach unten in Richtung zur Unterseite. Zur Minimierung von Probenverlust lassen Sie den Schlauch auf Trockeneis für 5 min vor der Verarbeitung der Probenmaterials.
- Vortex kurz (3-5 s), einige der ausgewählten Materialien von der Spitze zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Microneedle in das Rohr auf einer Wippe für 30 min bei 42 ° c
Hinweis: Die Pufferlösung wird in der absorbierenden Schicht sofort aufgenommen werden. - Legen Sie den oberen Teil der Mikronadel (der gegenüberliegenden Seite von der Nadel) Ebene mit der Oberkante der 2 mL Microfuge Röhre mit sterilen Pinzette.
- Schließen Sie den Deckel des Rohres, so dass oben die Microneedle zwischen GAP und die Röhre stattfindet.
- Drehen Sie das Rohr auf 16.000 x g oder mit maximaler Geschwindigkeit für 30 s, um die ausgewählten Materialien aus der absorbierenden Schicht des Geräts entfernen.
- Entfernen der Microneedle sorgfältig mit der Pinzette, ohne zurück in die Pufferlösung getaucht. Halten Sie das Rohr und verwerfen Sie die Microneedle zu.
- Zentrifugieren Sie Proben bei 3.000 x g für 2 min. Pipette mit der extrahierten RNA sorgfältig in einen neuen Microcentrifuge Schlauch überstand.
- 250 µL Puffer Konditionierung auf die Filtermembran Reinigung Spalte hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Spalte in dem Sammelrohr an 16.000 x g oder mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min.
- Fügen Sie 50 µL 70 % EtOH in die gesammelten Probe aus Schritt 3,9. Mischen Sie gut durch sanft auf und ab pipettieren.
- Übertragen Sie die Mischung (~ 100 µL) in die Spalte vorkonditionierten Reinigung.
- Zentrifuge für 2 min bei 100 X g sofort, gefolgt von einer Zentrifugation bei 16.000 x g für 30 s, um den Durchfluss zu entfernen.
- Fügen Sie 100 µL Wash Buffer 1 (W1) in die Reinigung Spalte und Zentrifuge für 1 min bei 8.000 x g.
- Bereiten Sie DNase Lösung durch Zugabe von 5 µL DNase ich Lager-Lösung für 35 µL Puffer RDD in einem separaten Microcentrifuge Schlauch für jede Probe. Mischen Sie, indem Sie sanft zu invertieren.
Hinweis: Die DNase-Behandlung auf der Spalte "Reinigung" statt in der PCR Platte danach aufgrund der Menge der Probe durchgeführt werden soll. - 40 µL DNase Inkubation Mischung direkt in die Reinigung Spalte Membran hinzufügen. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
- 40 µL W1 in die Membran Reinigung Spalte hinzufügen. Zentrifuge bei 8.000 x g für 15 s.
- Pipette 100 µL Wash Buffer 2 (W2) in der Spalte Reinigung nach der DNase-Behandlung und Zentrifuge für 1 min bei 8.000 x g.
- Fügen Sie ein weiteres 100 µL W2 in der Reinigung-Spalte und Zentrifugieren für 2 min bei 16.000 x g. Check der Reinigung-Spalte für jede verbleibende Waschpuffer. Neu bei 16.000 x g für 1 min Zentrifugieren Sie, bleibt jeder Waschpuffer.
- Übertragen Sie die Reinigung Spalte zu einem neuen 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch im Kit enthalten.
- Pipette 11 µL RNase-freies Wasser (nicht mitgelieferten RNA Isolierung), anstelle von Elution Buffer (EB), direkt auf die Membran der Reinigung Spalte. Berühren Sie sanft die Spitze der Pipette an der Oberfläche der Membran unter Verzicht auf die RNase-freies Wasser um maximale Absorption der RNase-freies Wasser in die Membran zu gewährleisten. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Spalte für 1 min bei 1000 X g, verteilen die RNase-freies Wasser in die Spalte, dann für 16.000 x g bei 1 min an RNA eluieren zentrifugieren.
Hinweis: RNA Quantifizierung wird aufgrund der geringen Menge der Probe nicht empfohlen. - Nummer #1 zu stoppen: die Gesamtstichprobe RNA bei-80 ° C zu speichern, wenn cDNA Synthese nicht sofort ausgeführt wird.
Hinweis: Vermeiden Sie einfrieren, wenn nicht notwendig angesichts der niedrigen Konzentration von RNS-Probe.
(4) cDNA Synthese
- Tauen Sie das eingefrorene Samenprobe auf Eis (aus Schritt 3.25).
- CDNA von Gesamt-RNS mit cDNA Synthese Kit nach dem folgenden Verfahren zu synthetisieren.
- Bereiten Sie die Reaktion Mischung: 11 µL Gesamt-RNS, 4 µL 5 x TransAmp Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase, 4 µL DNase/RNase-freies Wasser. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren.
- Reversen Transkription auf einem Thermocycler Apparat laufen: 25 ° C für 10 min, 42 ° C für 15 min, gefolgt von einer endgültigen Reverse Transkriptase Inaktivierung Schritt bei 85 ° C für 5 min.
- Stoppen Sie Punkt #2: reverse Transkription Probe bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
5. qPCR Reaktion und Datenanalyse
Hinweis: Die Primer für qPCR Reaktionen wurden entwickelt, um span Intron-Grenzen um die Verstärkung der genomischen DNA mit Hilfe NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) zu vermeiden. In dieser Studie verwendeten Referenz-gen ist RPLP0 (siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Informationen).
- Tauen Sie das eingefrorene Samenprobe auf Eis (aus Schritt 4.5).
- Durchführen Sie qPCR mit qPCR-master-Mix-Kit nach dem folgenden Verfahren.
- Master-Mix enthält die folgenden pro Reaktion vorzubereiten: 5 µL 2 X qPCR Reaktion Mix, 0.4 µL 10 µM forward Primer, 0.4 µL 10 µM-rückwärts-Primer, 2.2 µL DNase-freies Wasser. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren. Richten Sie die Proben in Triplicates.
- Pipette 8 µL des master-Mix in jede Vertiefung ein 384-Well PCR Platte erste und dann 2 µL cDNA von jeder Probe (insgesamt 10 µL pro Well).
Hinweis: Keine Vorlage-Kontrolle (NTC) und keine Reverse-Transkriptase-Kontrolle (-RT) werden als Negativkontrollen. - Die Dichtplatte mit Klebefolie und Zentrifugieren Sie kurz.
- Führen Sie die Verstärkung Reaktion auf eine Echtzeit-Thermocycler: 95 ° C für 2 min (Polymerase Aktivierung), gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s (Denaturierung), 60 ° C für 10 s (Tempern) und 72 ° C für 10 s (Erweiterung).
- Berechnen Sie die RNA-Konzentration der Proben durch Interpolation von eine Standardkurve aus Vorlagen mit bekannten Konzentrationen vorbereitet.
- Erstellen Sie ein Neues Experiment in der Software.
- Klicken Sie auf definieren und Festlegen von Standards serielle Verdünnung für Platten einzurichten.
- Auswählen und Anordnen der Brunnen für Standards und Proben. Klicken Sie auf anwenden.
- Klicken Sie auf analysieren in der Registerkarte "Ergebnis" die Standardkurve zu beurteilen. Bestätigen die Neigung,2 -R-Wert, Verstärkung Effizienz und Fehler der experimentellen Kriterien erfüllen.
- Überprüfen Sie die Mengen der unbekannten Proben visuell auf der Standardkurve, basierend auf den Ct-Werten.
Hinweis: Der Bau der Standardkurve, einschließlich der Auswahl der Verdünnungsfaktor, erfolgt nach veröffentlichten Protokolle11,12,13.
- Führen Sie gen Expressionsanalyse von mRNA mithilfe der ΔCt-Methode (Ct ist zu einem Referenzmodell gen normalisiert aus).
- Subtrahieren Sie den Ct-Wert der Target-gen aus der Ct-Wert der Referenz-gen zu den ΔCt-Wert zu erhalten.
- Durchschnittliche ΔCt Werte der technischen repliziert.
- Plotten und analysieren die Genexpression mit Statistik Software11,14 (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Alternativ erfolgt die Genanalyse Ausdruck nach veröffentlichten Protokolle13.
Representative Results
Wir haben bereits berichtet, dass Microneedle der Haut Microbiopsy dringt in die Haut ca. 500 µm Tiefe7. Das Microneedle-Design der Haut Microbiopsy ist sehr ähnlich dem auf saugfähige Microbiopsy (Abbildung 2a). Während der absorbierenden Microbiopsy aus einer absorbierenden Schicht in der Mitte für Blut Absorption bestand, enthielt die Haut Microbiopsy einen Kanal für die mechanische Aufnahme des Hautgewebes. Absorbierende Schicht führte auch zu Abweichungen in der Microneedle Dimension (saugfähig: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm Vs Haut: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).
Abbildung 2 b zeigt die Einsatzorten 5 min nach saugfähig und Haut Microbiopsies auf dem linken volar Arm des männlichen Freiwilligen angewendet wurden. Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen den zwei Microneedle-Designs waren die Anwendung von beiden Geräten mit kleineren Erythem vergleichbar. Beide Seiten der Anwendung waren nicht nach 48 h mit keine Narben links hinter erkennbar. Dies unterstützt die Hypothese, dass diese minimal-invasiven Gerät verfügt über das Potenzial, um mehreren Einsatzorten Bildschirm oder in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden.
Abbildung 2 c zeigt ein repräsentatives Bild von der absorbierenden Schicht des absorbierenden Microbiopsy nach dem Auftragen der volar Arm eines männlichen Freiwilligen. Wie in der Abbildung gezeigt, ein paar winzige Stückchen Haut nahe der Spitze der Microneedle erfasst wurden, und etwas Blut in das Filterpapier aufgenommen wurde. Dies bedeutet, dass das Gerät die Haut eingedrungen und Haut und Blut gleichzeitig innerhalb der selben saugfähige Microbiopsy Matrix erfasst. Abb. 2d zeigt eine Post-Probenahme Haut Microbiopsy, der vorherigen Generation von Microbiopsy, zum Vergleich. Der Kanal von der Haut Microbiopsy gefangen genommen, ein kleines Stück Haut, aber die Menge des Blutes auf die Microneedle war klein im Verhältnis zu den absorbierenden Microbiopsy. Beide Seiten der Anwendung waren nicht erkennbar innerhalb von 48 h. Im Experiment galt die saugfähige Microbiopsy mit einer Haltezeit von 10 s nach Anwendung, während die Haut Microbiopsy wurde sofort nach dem Auftragen durch den Unterschied im Design veröffentlicht.
Wie in Abbildung 3adargestellt, zwei Gruppen von absorbierenden Microbiopsy in diesem Experiment basierend auf dem Anwendungsprotokoll beteiligt waren: "Sofortige Freilassung" und 10 s halten ". Für die "Sofortige Freilassung"-Gruppe wurde das Gerät angewendet, mit dem gleichen ursprünglichen Haut Microbiopsy Protokoll, mit dem Gerät sofort nach dem Auftragen von der Applikationsstelle entfernt wird. Der 10-s-Holding "-Gruppe, wurde das Gerät in Position gehalten, nach der Anwendung für 10 s, Entnahme von Proben zu verbessern. Die beiden Gruppen von absorbierenden Microbiopsy wurden eingerichtet, um zu demonstrieren, wie die Anwendung Ansatz die Probenmenge auswirken könnte. Die Haltezeit von 10 s wurde als klinisch vernünftigen Zeit gewählt, zu zeigen, dass die Anwendungszeit erzielbaren Probenmenge betrifft.
Die Menge an RNA erholte sich von den beiden saugfähige Microbiopsy Gruppen wurden 0,33 ± 0,39 ng "Sofortige Freilassung" und 1.43 ± 0,88 ng 10-s gewartet "(Abbildung 3a, n = 20), schlägt einen 4-facher Anstieg mit der zusätzliche Haltezeit. Dies bedeutet, dass die Anwendung der absorbierenden Geräts mit 10-s Haltezeit führte zu mehr RNA extrahiert. Der Unterschied kann durch das Vorhandensein von erhöhten Blutprobe in der absorbierenden Schicht (Abb. 3 c) sein. In der Tat, die "Sofortige Freilassung" Gruppe (Abb. 3 b) ausgefallen, eine ähnliche Menge an Blut mit der absorbierenden Schicht im Vergleich zu dem 10-s-Betrieb zu sammeln "Gruppe (Abb. 3 c). Anzumerken ist, dass am besten sofort freigegeben Microbiopsies in der Nähe der x-Achse waren, was darauf hindeutet, sie waren negative Ereignisse oder eine sehr geringe Menge an RNA angezeigt. Deshalb, das Ergebnis bestätigt die Hypothese, die die Haltezeit eine Auswirkung auf die Leistung des Geräts hätte, wie es das Blut durch die absorbierende Schicht absorbiert werden dauern kann.
Da das Gerät für Blut und Haut Probenahme entwickelt wurde, war qPCR verwendet, um den Ausdruck von Haut und Blut Biomarker für beide Geräte zum Vergleich zu erkennen. Wir benutzten Tyrosinase, TYR, als ein Biomarker für die Melanozyten und KRT14 als Biomarker für die Keratinozyten in der lebensfähigen Epidermis. Microbiopsy Hautproben wurden in dem Experiment zum Vergleich einbezogen. Wie in Abbildung 4dargestellt, wenn Haut und saugfähige Microbiopsies aufgrund der Unterschiede im Design, unterschiedlich angewandt wurden Ausdruck Ebenen für beide Biomarker TYR Haut und KRT14 waren vergleichbar für beide Geräte wie durch die Daten. Weißen Blutkörperchen Biomarker (CD3E, T-Zellen und CD19, B-Zellen) wurden gefunden, um in saugfähige Microbiopsy Proben als in Microbiopsy Hautproben weiter verbreitet werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die saugfähige Microbiopsy besser in der Blutentnahme durchgeführt aber noch die Kapazität gepflegt für die Aufnahme der Haut im Vergleich zu den Haut-Microbiopsy (n = 5).
Abbildung 1: Die Herstellung von absorbierenden Microbiopsy. (a) die drei-Schicht-Microneedle. (b) alle Teile des Geräts. (c) die montierten absorbierenden Microbiopsy. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Die saugfähige Microbiopsy war in der Lage, Haut und Blut Proben gleichzeitig zu erfassen, ohne eine Narbe auf dem linken volar Arm des männlichen Freiwilligen. (a) einen Vergleich zwischen den Mikronadeln saugfähig und Haut Microbiopsies. (b) Anwendung Websites Links von saugfähigen und Haut Microbiopsies 5 min nach dem Auftragen. (C, d) Mikronadeln saugfähig und Haut Microbiopsies nach der Anwendung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Die saugfähige Microbiopsy gefangen genommen, mehr Blut und RNS-Probe als 10 s. beantragt (a) die Post-Anwendung Haltezeit von 10 s führte zu eine höhere Menge an RNA als das Gerät sofort loslassen (n = 20). Fehlerbalken darzustellen S.D. vom Mittelwert (***p< 0,0001). (b, C) Repräsentative Bilder von absorbierenden Microbiopsies nach Anwendung mit "Sofortige Freilassung" und 10 s Holding "Ansätze. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Der Vergleich von mRNA Expression Ebenen zwischen Haut und saugfähige Microbiopsies (n = 5). Der Genexpression hatte mit Referenz-gen RPLP0normalisiert worden. Fehlerbalken darzustellen S.D. vom Mittelwert (*p< 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Diese Ergebnisse zeigen, dass die saugfähige Microbiopsy als Werkzeug für einfach und minimal-invasive Probenentnahme von Haut und Blut-Gemisch für molekulare Charakterisierung verwendet werden kann. Geräteanwendung gemäß unserem Protokoll ist Voraussetzung für zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, wie gezeigt durch die Betragsdifferenz RNA erholte sich mit verschiedenen Anwendungsprotokolle (Abbildung 3). Sobald die Probe entnommen wird, ist die anschließende Probe Verarbeitung Schritt für RNA-Extraktion etablierte Protokolle15,16sehr ähnlich. Außerdem von den ersten Schritten in der RNA-Extraktion, die für die saugfähige Microbiopsy geändert werden, ist eine weitere wichtige Änderung die Verwendung von RNase-freies Wasser zur Verbesserung der Ergebnisse für downstream-Anwendungen. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass in dieser Studie verwendeten Referenz-gen RPLP0. RPLP0, dessen Funktion für andere Zelle und Gewebe-Typen17bekannt ist, wurde als geeignete Referenz-gen für den Einsatz in nicht-Melanom-Hautkrebs und präkanzerösen Läsionen18berichtet.
Eine der wichtigsten Einschränkungen des Geräts ist die Entfernung von der Microbiopsy aus dem Gerät, das ist zeitaufwändig und potenziell erhöht die Wahrscheinlichkeit von Probenverlust, speziell für empfindliche Proben wie RNA. Allerdings kann das Problem durch Vorkühlung sterile Verarbeitung alles, wie die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis überwunden werden.
Die Verwendung von absorbierenden Microbiopsy ist einfach und erfordert keine intensiven Trainings. Konventionellen Biopsie ist nicht notwendig, da Microbiopsy molekulare Charakterisierung mit etablierten molekulargenetische Diagnostik-Techniken, wie RT-qPCR erlaubt. Um weiter zu quantifizieren und demonstrieren die Probenahme-Fähigkeit der saugfähige Microbiopsy, wurde bisherigen Literatur, die RNA-Extraktion aus Menschenhaut Gewebe beteiligt untersucht. Aus einem typischen 3.0 oder 4.0 mm Haut Stanzbiopsie, drei Studien haben berichtet der extrahierten RNA-Mengen reichte von 50 bis 200 ng pro mg Haut Gewebe19,20,21. Vergleich mit dem 1.43 ng RNA, die aus der absorbierenden Microbiopsy im Durchschnitt (Abbildung 3), das Gewicht des aufgenommenen Hautgewebe zurückgewonnen wurde voraussichtlich Palette von 0,29-115 µg basierend auf dem gleichen Verhältnis der RNA-Gewebe aus Haut Punch Biopsie Studien.
Dieses Protokoll ist nicht ohne Fallstricke, obwohl einige der Probleme leicht überwunden werden kann. Zum Beispiel schlug die RNA-Extraktion-Daten eine erhebliche Variation auch mit der 10-s Haltezeit (Abbildung 3). Um das Problem zu beheben, ist eine mögliche Lösung optimieren das Anwendungsprotokoll. Parameter wie Kraft auf die Haut aufgetragen und Haltezeit sollte getestet und optimiert, um die Schwankungen der Probengewinnung zu reduzieren. Das mögliche Problem ist die Entfernung des Microbiopsy aus dem Gerät, das die Probe Integrität und Erholung auswirken könnten. Zwar die Microbiopsy für die RNA-Extraktion entfernen einen effektiven Ansatz, das gesamte Verfahren ist langwierig und Verunreinigungen in den Prozess die Probe ausgesetzt sein könnte. Daher ist die Änderung des Protokolls Probe Verarbeitung sehr erwünscht, um Probe Integrität gewährleisten und verhindern, dass Probenverlust.
Nachdem die oben genannten zwei Probleme behoben sind, wird erwartet, dass das Gerät ein Standardwerkzeug für die klinische Forschung. Es ist wichtig zu beachten, dass das Gerät gleichzeitig Haut und Blut Probe erfasst und dies in Betracht gezogen werden, sollte bei der Analyse von Genexpressionsdaten. Zusammenfassend, beschreibt dieses Protokoll die Details des absorbierenden Microbiopsy als einfach und minimal-invasive Werkzeug für kombinierte Haut und Blutabnahme und die anschließende Probe Verarbeitung für relative gen Expression profiling durchführen.
Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir würden gerne NHMRC Stipendien APP1109749 und APP1111216, Universität von Queensland Centennial Stipendium und International Postgraduate Research Scholarship anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
