Summary
В этой статье мы демонстрируем, как выполняется абсорбирующий microbiopsy техника и как образец может использоваться для РНК добыча для простых и одновременной выборки кожи и кровь в минимально инвазивной манере.
Abstract
Биопсия кожи обычных ограничивает клинических исследований, которая включает косметически чувствительных областях или педиатрического приложений из-за его инвазии. Здесь мы описываем протокол для использования абсорбирующего дерма-устройством на базе, абсорбирующего microbiopsy, для малоинвазивных проб смеси кожи и крови. Наша цель – помочь облегчить достижение быстрого прогресса в клинических исследованиях, создании биомаркеров для заболевания кожи и снижение риска для участников клинических исследований. В отличие от обычных кожи биопсии методов абсорбирующего microbiopsy может быть выполнена в течение нескольких секунд и не требует интенсивного обучения из-за своей простой конструкции. В настоящем докладе мы описывают использование поглощающей microbiopsy, включая погрузку и приложения на добровольцев. Затем мы покажем, как изолировать РНК из всасывается образца. Наконец мы продемонстрировать использование количественных обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР) для количественной оценки выражения уровни mRNA крови (CD3E и CD19) и кожи (KRT14 и TYR). Методы, которые мы опишем используют покинуть шельфа наборы и реагенты. Этот протокол предлагает минимально инвазивной подход для одновременной выборки кожи и крови в пределах той же абсорбирующий microbiopsy матрицы. Мы нашли человеческой этики комитетов, клиницистов и добровольцев в поддержку этого подхода к дерматологические исследования.
Introduction
Биопсия кожи является одним из важнейших методов в дерматологии для кожи выборки и последующего Диагностика кожных заболеваний через гистопатологические оценки. Биопсия техника включает медицинский работник, удаление подозрительных поражений на коже пациента на обследование1с помощью биопсии лезвия или удар. Хотя этот метод является эффективным, это очень инвазивных и ограничивает клинических исследований, как конечная точка обычно включает в себя методы молекулярной биологии2,3. Молекулярный анализ кожных заболеваний имеет потенциал для обеспечения весьма специфический биологическую информацию, что гистопатологические анализа нельзя, способствуя тем самым наркотиками открытий и болезни диагноз4,5. Кроме того образец спросом в самых молекулярных методов сравнительно мала и может привести к сокращению использования животных и разрешить большее количество реплицирует. Таким образом, существует явная необходимость альтернативный метод, который позволяет молекулярного анализа в клинических исследованиях и снижает риск для участников.
Для удовлетворения такой потребности в области, наша группа разработала Роман дерма-платформа на основе диагностики, абсорбирующего microbiopsy, что позволяет коллекцию малюсенькое количество кожи, смешанные с кровью в простой и минимально инвазивной6. Цель этой публикации заключается в описания абсорбирующий microbiopsy как инструмент выборки для облегчения молекулярного анализа через РНК добыча в клинических исследованиях.
Ранее мы описали первую версию microbiopsy, microbiopsy кожи, которая состоит из микроиглы, изготовлена из листовой трехслойный дизайн для извлечения крошечные кусочки тканей кожи7. Новизна этого устройства происходит от нескольких контактных пунктов от микроиглы, позволяющий эффективно ткани добычи3. В противоположность этому биопсия кожи круговой удар обеспечивает только одну точку контакта и просто слезы кожи без захвата любой образец, в некоторых случаях. Основываясь на microbiopsy кожи, мы недавно разработали абсорбирующий microbiopsy, который имеет крови и кожи, отбор возможностей. Устройство было показано, быть осуществимым для использования в бедных ресурсами районах в последние эпидемиологические исследования6.
Благодаря своей простой конструкции абсорбирующего microbiopsy может быть выполнена в течение нескольких секунд и не требуют обширной подготовки. Кроме того местная анестезия не требуется, и сайт приложения не вызывает рубцевания. Настоящий Протокол позволяет исследователям или медицинских специалистов без соответствующей выборки, обучение для получения данных целевых кожи для молекулярного анализа. Мы ожидаем, microsampling устройства, чтобы стать обычной практикой в исследовании кожи в будущем.
Хотя microbiopsy уже сообщалось в других исследований болезни кожи, которые вовлечены молекулярные методы диагностики6,8,9,10, такие как вирус папилломы человека ДНК обнаружения, этот протокол является первым, чтобы продемонстрировать детали образца добычи и обработки методов для поглощающей microbiopsy. Кроме того это первый доклад, описывающий профилирование выражение гена относительного кожи и клетки крови в microbiopsy образцах.
Protocol
Исследование было одобрено метро Южная человека Комитет по этике исследований и университета Квинсленда человека Комитет по этике исследований (HREC-13-QPAH-551 и UQ2013001551) и Университет Южной Австралии человека Комитет по этике (200607).
1. абсорбирующие Microbiopsy изготовление
- Лазерной резки микроиглы частей от 50 мкм медико класса из нержавеющей листовой стали и абсорбирующий слой (фильтр бумага), соответственно (рис. 1).
Примечание: Других частей, включая поршень и случай, устройства изготавливаются с быстрого прототипирования методы, такие как 3D печати. - Замочите все части, за исключением абсорбирующий слой, в 70% этанола (EtOH) за 5 мин и высушите на воздухе их на 30 минут после.
- Соберите три слоя микроиглы, с абсорбирующим слоем в середине (рис. 1a).
- Вставьте собранный микроиглы в щели поршень.
- Положите на весну и вставьте поршень в случае (рис. 1С). Избегайте микроиглы, касаясь ничего в процедуре сборки для обеспечения качества иглы.
- Уплотнение собрал абсорбирующий microbiopsy в пакете для γ-излучения стерилизации перед использованием.
2. отбор проб с абсорбирующей Microbiopsy
- Носить одноразовые перчатки и спрей руки и инструменты, такие как щипцы, с 70% EtOH.
- Обезопасить сайт приложения с очистки спирта.
- Удалите microbiopsy из пакета стерилизованные γ-излучения без касатьться Микроиглы в процессе.
- Загрузите устройство, потянув поршень для сжатия пружины до тех пор, пока есть «нажмите» Звук и поршень замки на месте.
- Цель устройства в кожу, чтобы отведать, обеспечивая области выборки в фиксированном положении.
- Убедитесь, что устройство приблизительно перпендикулярно к коже, а затем применить ≥1 кг силы к устройству на кожу.
Примечание: Применение силы вниз в кожу требуется для обеспечения достаточных проникновения микроиглы. - Нажмите на курок и удерживайте устройство в место для минимум 10 s для образца крови быть поглощенным.
Примечание: Если устройство выпускается до 10 сек, есть меньше образца в плен.
3. РНК добыча
Примечание: Процедуры извлечения РНК были изменены от производителей протокол для оптимального изоляции от образца microbiopsied РНК. Все реагенты и столбец, используемый в РНК добыча включены в комплект, если не указано иное.
- Вытащите поршень и поглощающей микроиглы от дела руками осторожно. Убедитесь, что кончик микроиглы не вступают в контакт с ничего во время удаления.
- Удаление абсорбирующий дерма из поршень. Держите на двух отверстий на микроиглы с парой стерильный пинцет и вытащите его.
- Положить в 2-мл пробирку microcentrifuge нетронутыми Микроиглы (не из комплекта изоляции RNA; см. Таблицу материалы) заполнено автоматически с 50 мкл буфера добычи, с иглы лицевой стороной вниз к нижней. Чтобы свести к минимуму потери образца, оставьте трубки на сухой лед для 5 минут перед обработкой образца.
- Вихрь кратко (3-5 s), чтобы удалить некоторые из отобранных материалов от кончика.
- Инкубировать микроиглы в трубку на рокер за 30 мин при 42 ° C.
Примечание: Буферный раствор будет поглощена в абсорбирующий слой немедленно. - Место в верхней части на уровне Микроиглы (с противоположной стороны от иглы) с верхним краем 2-мл пробирку отцентрифугировать, используя стерильный пинцет.
- Закройте крышку трубки, таким образом, что в верхней части микроиглы удерживается на месте между колпачком и трубки.
- Спина трубки на 16000 x g или максимальной скоростью 30 s, чтобы удалить выбранные материалы из абсорбирующий слой устройства.
- Осторожно снимите микроиглы пинцетом без погружения обратно в буферный раствор. Держите трубку и отбросить микроиглы.
- Центрифугуйте образцы на 3000 x g на 2 мин пипеткой супернатанта, содержащий извлеченные РНК тщательно в новые пробки microcentrifuge.
- 250 мкл буфера кондиционирования на мембране фильтра столбца очистки и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга для столбца в коллекции трубки на 16000 x g или максимальной скоростью за 1 мин.
- Добавьте 50 мкл 70% EtOH в собранных образцов с шагом 3,9. Смешайте хорошо аккуратно закупорить вверх и вниз.
- Передача смеси (~ 100 мкл) в столбце оговоренную очистки.
- Центрифуги для 2 мин на 100 x g немедленно, после центрифугирования в 16000 x g 30 s для удаления потока через.
- Мкл 100 мыть буфера 1 (W1) в столбец очистки и центрифуги за 1 мин на 8000 x g.
- Готовят раствор DNase, добавив 5 мкл DNase я фондовых решения 35 мкл буфера RDD в отдельном microcentrifuge трубку для каждого образца. Смешайте нежно переворачивать.
Примечание: Лечение DNase должна выполняться на столбце очистки, вместо в пластину PCR после этого, из-за количества образца. - 40 мкл DNase инкубации смеси непосредственно в столбец мембраны очистки. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Мкл W1 40 в мембрану столбец очистки. Центрифуга на 8000 x g 15 s.
- Пипетка 100 мкл мыть буфера 2 (W2) в столбце очистки после лечения DNase и центрифуги за 1 мин на 8000 x g.
- Добавить еще 100 мкл W2 в столбце очистки и центрифуги для 2 мин в 16000 x g. Проверьте столбце очистки для любого остаточного мыть буфера. Повторно центрифуги на 16000 x г за 1 мин, если любой мыть буфера остается.
- Передать столбце очистки новой трубки microcentrifuge 0,5 мл в комплекте.
- Пипетка 11 мкл РНКазы свободной воды (не поставляется в комплекте изоляции RNA), вместо Элюирующий буфер (EB), непосредственно на мембраны столбце очистки. Нежно прикасаться кончиком пипетки на поверхности мембраны дозирования РНКазы свободной воды для обеспечения максимального поглощения РНКазы свободной воды в мембрану. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин.
- Центрифуга для столбца 1 мин на 1000 x g распространять РНКазы свободной воды в столбце, а затем центрифуги для 16 000 x g 1 мин для элюировать РНК.
Примечание: Количественное определение РНК не рекомендуется из-за малого количества образца. - Остановить пункт #1: хранилище общей выборки РНК-80 ° c, если синтез cDNA выполняется не сразу.
Примечание: Во избежание замерзания Если нет необходимости ввиду низкой концентрации РНК образца.
4. синтез cDNA
- Размораживание замороженного образца на льду (от шаг 3.25).
- Синтез cDNA от общего РНК с комплект для синтеза cDNA согласно процедуре ниже.
- Подготовьте смесь реакции: 11 мкл всего РНК, 4 мкл 5 x TransAmp буфера, 1 мкл обратной транскриптазы, 4 мкл DNase/РНКазы свободной воды. Смешайте нежно закупорить.
- Запуск обратной транскрипции на аппарат тепловая велосипедист: 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C в течение 15 мин, следуют окончательный обратной транскриптазы инактивации шаг на 85 ° C за 5 мин.
- Остановить пункт #2: хранить обратной транскрипции образца при температуре-80 ° C до использования.
5. ПЦР-реакции и анализ данных
Примечание: Праймеры для реакций ПЦР были призваны охватывать Интрон границы, чтобы избежать амплификацию геномных ДНК с помощью NCBI грунтовка взрыва (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Ген ссылки, используемые в данном исследовании является RPLP0 (см. раздел обсуждения для получения дополнительной информации).
- Размораживание замороженного образца на льду (от 4,5 шаг).
- Выполняйте ПЦР с комплектом мастер смесь ПЦР согласно процедуре ниже.
- Подготовка мастер смеси, содержащие объяснения на реакции: 5 мкл 2 x qPCR реакции микс, 0.4 мкл 10 мкм вперед грунт, 0.4 мкл 10 мкм обратный грунт, 2.2 мкл DNase свободной воды. Смешайте нежно закупорить. Настройка образцов в triplicates.
- Пипетка 8 мкл мастер смесь в каждой скважине 384-ну ПЦР плиты первого и затем 2 мкл cDNA от каждого образца (в общей сложности 10 мкл на хорошо).
Примечание: Не шаблон управления (НПС) и не обратной транскриптазы (-RT) включены как негативный контроль. - Печать пластины с липкой пленкой и кратко центрифуги.
- Запустить усиление реакции на реальном времени тепловая велосипедист: 95 ° C на 2 мин (полимеразы активации), а затем 40 циклов 95 ° c за 5 s (денатурация), 60 ° C для 10 s (отжиг) и 72 ° C для 10 s (расширение).
- Образцами концентрации РНК вычисления путем интерполяции по калибровочной кривой, приготовленный из шаблонов с известной концентрацией.
- Создайте Новый эксперимент в программном обеспечении.
- Щелкните определить и установить стандарты для настроить последовательный разрежения для пластин.
- Выбирать и упорядочивать скважин для стандартов и образцы. Нажмите кнопку Применить.
- Нажмите кнопку анализ на вкладке результат для оценки калибровочной кривой. Подтвердить склон, значение R2 , экспериментальный критериям эффективности амплификации и ошибка.
- Проверьте количество неизвестных образцов визуально на стандартной кривой, на основе их значений Ct.
Примечание: Строительство калибровочной кривой, включая выбор коэффициента разрежения, осуществляется согласно опубликованные протоколы11,12,13.
- Выполните анализ выражения гена мРНК с помощью метода ΔCt (Ct нормализуется к гену деталей).
- Вычтите значение Ct целевого гена от Ct значения гена ссылка для получения значения ΔCt.
- Средняя реплицирует значения ΔCt технических.
- Сюжет и анализ экспрессии генов с статистики программное обеспечение11,14 (см. Таблицу материалы).
Примечание: Кроме того, анализ выражения гена осуществляется согласно опубликованные протоколы13.
Representative Results
Мы уже ранее сообщали, что микроиглы кожи microbiopsy проникает кожу около 500 мкм глубокой7. Дерма дизайн кожи microbiopsy очень похож на один на абсорбирующий microbiopsy (Рисунок 2a). В то время как абсорбирующий microbiopsy состоял из неотражающий слой в середине для поглощения крови, кожи microbiopsy содержится канал для захвата механических тканей кожи. Использование абсорбирующего слоя также привело к небольшой разницей в измерении Микроиглы (абсорбента: 1,50 x 0,50 x 0,21 мм против кожи: 1,50 x 0,50 x 0,15 мм).
Рисунок 2b показывает приложение сайтов 5 мин после абсорбента и кожи стереотаксическими были применены на левой руке ладонной мужской добровольцев. Из-за сходства между двумя конструкции микроиглы сайты приложений от обоих устройств были сопоставимы с незначительными эритема. Оба приложения сайтов не были заметны после 48 ч с не шрамы оставили позади. Это подкрепляет гипотезу о том, что это минимально инвазивной устройство имеет потенциал, чтобы помочь экран несколько сайтов приложений или осуществляться на регулярной основе.
Рисунок 2 c показывает картину представительной неотражающий слой поглощающего microbiopsy после применяются к ладонной руку мужчина добровольцев. Как показано на рисунке, несколько маленьких кусочков кожи были захвачены у оконечности микроиглы, и некоторые крови была поглощена фильтровальная бумага. Это означает, что устройство проникли кожи и захватили кожи и крови одновременно в рамках той же абсорбирующий microbiopsy матрицы. 2d рисунок показывает после выборки кожи microbiopsy, предыдущего поколения microbiopsy, для сравнения. Канал microbiopsy кожи захватил небольшой кусок кожи, но количество крови на микроиглы был мал по сравнению с абсорбирующей microbiopsy. Оба приложения сайтов не были заметны в течение 48 ч. В эксперименте, поглощающей microbiopsy был применен с 10-s время после применения, а кожу microbiopsy сразу же был выпущен после применения из-за разницы в дизайне.
Как показано на рисунке 3a, две группы абсорбирующий microbiopsy были вовлечены в этот эксперимент, основанный на протоколе приложения: «Релиз» и ' 10-s Холдинг». Для группы «Релиз» устройство применяется с использованием протокола по microbiopsy же оригинальный кожи, с устройства удаляется из узла приложения сразу же после применения. Для проведения ' 10-s' группа, устройства был проведен в месте после заявки на 10 s для улучшения сбора проб. Чтобы продемонстрировать, как приложение подход может повлиять на объем выборки были созданы две группы абсорбирующий microbiopsy. Время проведения 10-s был выбран как клинически разумное время продемонстрировать, что время приложения влияет на количество извлекаемых образца.
Количество РНК оправился от двух групп абсорбирующий microbiopsy были 0,33 ± 0,39 нг «Релиз» и 1,43 ± 0,88 нг для проведения ' 10-s' (рис. 3a, n = 20), предлагая 4-кратное увеличение с дополнительное время. Это означает, что применение абсорбирующий устройство с 10-s Холдинг времени привели к более РНК извлечены. Разница может быть связано с наличием более крови в абсорбирующий слой (рис. 3 c). Действительно, «Релиз» группы (рис. 3b) удалось собрать же количество крови с абсорбирующим слоем по сравнению с Холдинг ' 10-s' группы (рис. 3 c). Следует также отметить, что наиболее немедленно выпустила стереотаксическими были близки к оси x, предлагая их негативные события или отображаться очень низкое количество РНК. Поэтому результат проверить гипотезу, что время выдержки будет иметь влияние на производительность устройства, как это может занять время для крови, чтобы быть поглощены абсорбирующий слой.
Поскольку устройство было предназначено для крови и кожи выборки, ПЦР была использована для выявления выражение кожу и кровь биомаркеров для обоих устройств для сравнения. Мы использовали тирозиназы, TYR, в качестве биомаркеров для меланоцитов и KRT14 качестве биомаркеров для кератиноцитов в жизнеспособные эпидермиса. Кожа microbiopsy образцы были включены в эксперимент для сравнения. Как показано на рисунке 4, хотя кожи и поглощающей стереотаксическими применялись по-разному из-за разницы в дизайне, выражение уровней для обоих кожи биомаркеров TYR и KRT14 были сопоставимыми для обоих устройств, как указано данных. Биомаркеры белых клеток крови (CD3E, Т-клетки и CD19, клетки B) были найдены быть более распространена в образцах абсорбирующий microbiopsy чем в microbiopsy образцах кожи. Этот результат свидетельствует о том, что поглощающей microbiopsy в крови коллекции, но все еще сохраняет потенциал для захвата кожи по сравнению с microbiopsy кожи (n = 5).
Рисунок 1. Изготовление абсорбирующий microbiopsy. (-трехслойный микроиглы. (b) все части устройства. (c собрал абсорбирующий microbiopsy. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Абсорбирующие microbiopsy удалось захватить образцы крови и кожи одновременно не покидая шрам на левой руке ладонной мужской добровольцев. (a) сравнение между микроиглы кожи и поглощающей стереотаксическими. (b) приложения сайтов оставленные кожи и поглощающей стереотаксическими 5 мин после аппликации. (c, d) Микроиглы стереотаксическими абсорбирующие и кожи после применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Абсорбирующие microbiopsy захватили больше крови и РНК образца при применении для 10-s. () после применения проведение 10-s время привело к большего количества РНК, чем выпускать устройства немедленно (n = 20). Планки погрешностей представляют с.д. от среднего (***p< 0.0001). (b, c) Представитель фотографии абсорбирующий стереотаксическими после применения с «Релиз» и ' 10-s Холдинг ' подходы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Сравнение уровней выражение mRNA между кожей и поглощающей стереотаксическими (n = 5). Экспрессии генов были нормализованы с ссылкой гена RPLP0. Планки погрешностей представляют с.д. от среднего (*p< 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Эти результаты показывают, что поглощающей microbiopsy может использоваться как инструмент для простых и минимально инвазивной выборки в кожу и кровь смеси для молекулярная характеристика. Приложения для устройства в соответствии с нашей протокол имеет важное значение для получения надежных результатов, как показано на разницу в количестве РНК, восстановленные с различных прикладных протоколов (рис. 3). После извлечения образца последующих образец обработки шаг для РНК добыча очень похож на установленные протоколы15,16. Кроме того от первых шагов в РНК добыча измененные для поглощающей microbiopsy, другим ключевым изменением является использование РНКазы свободной воды, чтобы улучшить результаты для нисходящие приложения. Кроме того стоит отметить, что ген ссылки, используемые в данном исследовании является RPLP0. RPLP0, функция которого хорошо известны для различных клеток и тканей типы17, было сообщено, как ген подходящую ссылку для использования в не Меланома кожи рак и предраковые18.
Одним из основных ограничений устройства является удаление microbiopsy из устройства, которое занимает много времени и потенциально увеличивает вероятность потери образца, особенно для чувствительных проб как РНК. Тем не менее проблемы могут быть преодолены путем предварительного охлаждения стерильной обработки инструменты, такие как трубы microcentrifuge 2мл, по сухим льдом.
Использование поглощающей microbiopsy прост и не требует интенсивного обучения. Обычные биопсии не является необходимым, как microbiopsy позволяет молекулярная характеристика с установленным молекулярной диагностики методы, такие как RT-ПЦР. Для дальнейшего количественного определения и продемонстрировать способность проб абсорбирующий microbiopsy, было расследовано предыдущих литературы, что извлечение RNA от ткани кожи человека. От типичной 3.0, или 4.0 мм кожи пробивать биопсии, три исследования сообщили извлеченные РНК суммы варьировались от 50 до 200 нг на мг кожи ткани19,,2021. Сравнение с 1,43 нг РНК, которая была восстановлена из абсорбирующей microbiopsy в среднем (рис. 3), вес пробы кожных тканей ожидается в диапазоне от 0,29-115 мкг на основе той же пропорции РНК ткани из исследования биопсия кожи удар.
Этот протокол является не без потенциальные ловушки, хотя некоторые проблемы могут быть легко преодолены. Так, например РНК добыча данных предложил значительные различия даже с течением времени проведения 10-s (Рисунок 3). Для решения этой проблемы, одно из возможных решений включает в себя оптимизацию протокола приложения. Такие параметры, как силы применяется к коже и время выдержки следует протестированы и оптимизированы, чтобы уменьшить колебания в пример извлечения. Другой потенциальной проблемой является устранение microbiopsy от устройства, которое может повлиять на целостность образца и восстановления. Хотя удаление microbiopsy для извлечения РНК является эффективным подходом, вся процедура является утомительным и образца могут подвергаться воздействию загрязнения в процессе. Таким образом модификации протокола обработки образца весьма желательно для обеспечения целостности образца и предотвращения потери образца.
После выше двух вопросов, ожидается, что устройство станет стандартным инструментом для клинических исследований. Важно отметить, что устройство захватывает кожу и крови одновременно, и это следует учитывать при анализе данных выражения гена. В заключение этот протокол описывает детали выполнения абсорбирующий microbiopsy как инструмент легко и минимально инвазивных для комбинированной кожи и проб крови и последующие образец обработки для относительной ген выражение профилирования.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Мы хотели бы признать NHMRC стипендии APP1109749 и APP1111216, университет Квинсленда столетия стипендии и международной стипендии последипломного исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
