Summary
פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את כיצד תאים ממברנות טופס ולשנות בתאים חיים של שמרים לגבש. תאים תאיים רבים שמרים הם דינמיים, והבנה מלאה של המאפיינים שלהם דורש הדמיה בזמן. Multi-צבעים 4D מיקרוסקופ מיקרוסקופית פלואורסצנטית היא שיטה רבת עוצמה למעקב אחר ההתנהגות והרכב של תא תאיים על סולם זמן של 5-15 דקות. ניתוח קפדני של דינמיקה תא דורש לכידת אלפי אופטי סעיפים. כדי להשיג מטרה זו, photobleaching לבנת ו פוטורעילות הם ממוזער על ידי סריקת במהירות בכוח לייזר נמוך מאוד, ואת מידות פיקסל ומרווחי Z-step מוגדרים לערכים הגדולים ביותר התואמים לדגימת התמונה ברזולוציה מלאה. ערכות הנתונים המתקבלות מוסדרות, רועשות, אך ניתן לחלק אותן על-ידי פירוק. גם עם נתונים באיכות גבוהה, שלב הניתוח הוא מאתגר כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות רבים, הטרוגנית, וניידים. כדי לענות על צורך זה, התוספים ImageJ מותאם אישית נכתבו לתוך מערך 4D נתונים על מסך המחשב, לזהות מבנים של עניין, לערוך את הנתונים כדי לבודד מבנים בודדים, לכמת את קורסי הזמן הזריחה, ולעשות סרטים של ה-Z מוקרן הערימות. 4D סרטים שימושיים במיוחד כדי להבחין תאים יציבים מתאים ארעי כי להפוך על ידי התבגרות. סרטים כאלה יכולים לשמש גם כדי לאפיין אירועים כגון היתוך תא, כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות ספציפיות או רטבאליות אחרים.
Introduction
התאים של המערכת הendomembrane הם בשטף קבוע, ואת האפיון המלא שלהם דורש הדמיה תא חי. מתוארים כאן הוא פרוטוקול המעסיק 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופיה כדי להמחיש באופן מתויג בתאי בתים של הניצנים. השיטה פותחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של מתאי הפרשה בפיצ'יה פסטורלה וסכומיסס סרביסיאה1,2,3. פרוטוקול זה מתמקד ב -S. cerevisiae, אשר יש golgi שאינו מוערם שבו cisternae הפרט הם לפתירה4. הארגון החריג Golgi ב -S. cerevisiae ס איפשר את ההפגנה על ידי מיקרוסקופ 4d כי golgi cisterna בתחילה תוויות עם תושב מוקדם בשנת golgi, ולאחר מכן מאבד את החלבונים האלה תוך רכישת תושב מאוחר golgi חלבונים3 ,5. מעבר זה יכול להיות דמיינו על ידי יצירת זן שבו חלבון Golgi מוקדם Vrg4 מתויג עם GFP בעוד חלבון Golgi מאוחר Sec7 מתויג עם חלבון פלורסנט monomeric אדום. כאשר cisternae בודדים מסומנים, התבגרות נצפתה כהמרה ירוק-אדום3. סוג זה של ניתוח יכול לספק מידע חשוב אודות לוקליזציה של חלבון וזהות תא. לדוגמה, שני חלבונים עם זמני הגעה ויציאה מעט נגדיים עשויים לעתים להיראות כתוויות לתאים שונים בתמונות סטטיות, אך ניתן לראות בסרטים 4d כדי לתייג את אותו תא בנקודות זמן שונות6,7 . לפיכך, מיקרוסקופ 4D חושף תופעות שלא היו נראות באופן אחר.
מיקרוסקופ 4D אינפורמטיבי של תאי שמרים ניתן להשיג עם הליכים המתאימים וציוד2. במידת האפשר, התיוג חלבון פלורסנט מבוצע על ידי החלפת גנים8 כדי למנוע חפצים ביטוי יתר. כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות דינמי מאוד, 4D הדמיה נדרשת כדי להבטיח כי מבנה מסומנים מהימן לאורך זמן. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לייזר המצויד בגלאי רגישות גבוהה. עם התקן זה, את כל הנפח של התא של S. cerevisiae ס יכול להיות בתמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית בערך כל 1-3 s, עם 2 מרווחי s להיות אופייני. נתונים ניתן לאסוף עד 5-15 דקות בהתאם לצפיפות התיוג של fluorophores ואת המאפיינים שלהם פוטופיסיים. המשוכה העיקרית היא למזער את הלבנת התמונות. למטרה זו, עוצמות הלייזר נשמרות נמוכות ככל האפשר, מהירות הסריקה הקונפוקלית מוגדלת, והפרמטרים האופטיים מוגדרים לתמונה במגבלת נייקוויסט כדי ללכוד את המידע הרלוונטי תוך הימנעות מחשיפה מוגזמת באור. הגדרות אלה צפויים גם להקל על הרעילות, גורם התעלמו לעתים קרובות במהלך הדמיה תא חי9,10,11. הנתונים הרועשים הנובעים מכך מעובדים עם תיקון אקונומיקה והאלגוריתמים לפירוק כדי להקל על הכמת של עוצמות הזריחה.
גם עם איכות גבוהה בסרטים 4D, הניתוח הוא מסובך כי בתאי שמרים נוטים להיות רבים, הטרוגנית, וניידים. בשל המגבלות הפנימיות של המיקרוסקופיה וההגדרות הלא-אופטימליות הנדרשות עבור הדמיה ממושכת של 4D, מבני פלורסנט הסמוכים זה לזה קשה לפתרון. בעיה זו ניתן להקיף על-ידי התמקדות במספר קטן של מבני פלורסנט כי נשארים מחדש באופן מבחינה אופטית למשך תקופת תיוג, עם ההנחה כי מבנים אלה מייצגים את האוכלוסיה כולה של התווית תאים. תאים פלורסנט שיכולים להיות מסומנים באופן מהימן מזוהים על ידי צפייה בסרטים של ה-Z-ערימות מוקרן ועל ידי יצירת סדרה של ונטאז שבו הסעיפים האופטיים עבור כל נקודת זמן מסודר על מסך המחשב. ניתוח זה משתמש בתוספים מותאמים אישית של ImageJ12 , המאפשרים מבנה פרטני להיות מאותר בבידוד.
ניירות השיטות האחרונות כיסו את השימוש של חלבונים פלורסנט ב-13 שמרים, כמו גם את התיאוריה והתרגול של הדמיה מיקוד 4d של תאים שמרים2. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים המרכזיים של ניסוי הדמיה 4-d. הוא כולל כמה שיפורים להליכים שתוארו בעבר, כמו גם גירסאות מעודכנות של הקוד והתיעוד של התוסף ImageJ. הדוגמה המוצגת מתמקדת בדינמיקה של Golgi, אך פרוטוקול זה מתאים באותה מידה ליצירת הדמיה של תאי שמרים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- הפוך מינימלי לא פלורסנט NSD בינונית2. היעדר הריבופלאווין צפוי להפחית את הרקע הירוק מתאים לקרינה פלואורסצנטית ירוקה ו-phototoxicity משויכת.
- לגדל את מאמץ שמרים לילה ב ~ 23 ° צ' לשלב לוגריתמי ב 5 mL NSD ב 50 mL מבולבל בקבוקון עם האנטנה טוב. כ 3-4 h לפני הניתוח, לדלל את התרבות שמרים ב NSD טריים כך הסופי OD600 יהיה 0.5-0.8 בזמן הדמיה.
- להכין פתרון 2 מ"ג/mL של concanavalin A (קונה). אם תרצה, הקפא את התמיסה הזאת בחנקן נוזלי ובחנות ב-80 ° c.
- לסובב את הפתרון הקונה עבור 5 דקות במהירות מלאה במיקרוצנטריפוגה כדי להסיר חומר חלקיקי שעלול להפריע הדמיה. לאחר מכן להוסיף 250 μL של supernatant כדי נקי 35 מ"מ שמיכות התחתון צלחת המיקרוסקופיה. לאחר 15 דקות, לשטוף 2-3 פעמים עם 2 מ ל של dH2O ולתת יבש.
- הוסף 250 μL של התרבות שמרים לצלחת מצופה קונה, לחכות 10 דקות כדי לאפשר את התאים לדבוק, ולשטוף בעדינות 2-3 פעמים עם 2 mL NSD. כסה את התאים עם 2 מ"ל NSD טרי.
2. הדמיה
- השתמש עדשה 63 x או 100x טבילה שמן. פתח מספרי (NA) של 1.40 הוא מספיק, אבל עדשת NA גבוהה יכול לשמש גם.
- עצב את גודל המסגרת ל-256 x 128 (רוחב x גובה). אם יש צורך בגודל מסגרת גדול יותר, הגדלת הרוחב לא תפחית את מהירות הסריקה כל עוד המיקרוסקופ הקונקטיבי מצויד בסורק תהודה.
- כוונן את מקדם הזום כדי להפוך את גודל הפיקסל ~ 80 ננומטר.
- השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר של 8 kHz. הפעל סריקת X דו-כיוונית אם הוא זמין, ואם בקרת ניסויים לוודא כי סריקות משני הכיוונים הם בהרשמה.
- הגדר את הצטברות הקו ל-4 או 6. הקפד להשתמש בהצטברות (סיכום) במקום בממוצע.
- הגדר את החור מנקב 1.2 יחידות אווריריים. אמפירי, כאשר הדמיה לחיות תאים שמרים, הגדרה זו לוכדת פוטונים יותר מאשר הבחירה הסטנדרטית של 1.0 יחידת אוורירי תוך גרימת אובדן ניכר של רזולוציה.
- עבור כל ערוץ זריחה, להגדיר את אורך הגל, להקצות גלאי רגישות גבוהה, להגדיר את טווח אורך הגל הפליטה, ולהפעיל מצב ספירת פוטון אם זמין. בחירות אורך הגל יהיה תלוי fluorophores. כדוגמה, לרגש את הזריחה GFP ב 485 nm ולאסוף מ 495-550 nm, ולהלהיב mScarlet פלואורסצנטית ב 555 nm ולאסוף מ-562-625 nm.
- הגדר את עוצמת כל לייזר כדי להיות נמוך ככל האפשר. הגדרה זו חייבת להיקבע בהתאם. האינטנסיביות המתאימה תגרום ללכידת רצף התמונה רועש אך מתרגם, עם האות הפלואורסצנטית הלבנת לא יותר מ 50% עד סוף הסרט 5 דקות. במיקרוסקופ הקונמוקד המשמש כאן (ראה טבלת חומרים), עוצמה זו מקבילה להגדרת כוח לייזר על סדר של 5%.
- השתמש במסננים מדרגה או בזמן המשך כדי להימנע מלכידת האור המשתקף מהכיסויים. אם המשך הזמן זמין, להגדיר את החלון החוצה כדי 0.6-10.0 ns.
- הפעל דימות ברייטפילד והשתמש בגלאי רגישות נמוך לאיסוף נתונים. הגדר את הרווח לרמה שהופכת את התאים לגלויים בבהירות. אל תשתמש בניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) מכיוון שהפריזמה תפריע ללכידת נתוני הזריחה האמינים.
- הגדר את מרווח ה-Z ל-0.25-0.35 μm. תמונה של כל הנפח של התאים שמרים על ידי איסוף על 20-25 מקטעים אופטיים לכל Z-מחסנית. ציין את הכיווניות של הדמיה כגון "למטה" נע לעבר הכיסויים.
- עבור סרט אופייני, הגדר את מרווח הזמן בין Z-ערימות ל-2 s והגדר את משך הסרט ל-5 עד 10 דקות. בהתאם לתא שמתחת למחקר, הפחת את מרווח החיים כדי לבצע סרטים קצרים יותר של דינמיקה מהירה יחסית, או הגדל את המרווח כדי להפוך סרטים ארוכים יותר של דינמיקה איטית יחסית.
- שמור את הסרט כקובץ, עם תמונות השדה הברייטמיות בערוץ האחרון. במעמקי הסיביות הגבוהה יותר אינם נחוצים בשלב זה, והצינור העיבוד מוגדר לקבל נתוני TIFF של 8 סיביות.
3. פירוק המבנים
- הפעל את תוכנת הפירוק (ראה טבלת חומרים), באמצעות האלגוריתם ' שערוך סבירות מקסימלית קלאסי '.
- פתח את ערכת הנתונים שנוצרה בשלב 2.13. בחר באפשרות "אשף פירוק הטור". בדוק את הערכים המוצגים באשף הפרמטרים. יש לזהות את פרמטרי ההדמיה ולהציגם כראוי. תחת "מדדי השבירה", לשנות את הערך "הטבעה רפואית." כדי 1.40 לקירוב הציטופלסמה שמרים. תחת "coverslip", בחר "הפעל עורך" ו "מיקום הערכה" ו "אישור" כדי להגדיר את מיקום coverslip. בחר "קבע את כל האימות" ו-"קבל".
- המשך באמצעות "אשף פירוק" עבור כל ערוץ זריחה. בחר "ידני" כמצב עבור שערוך רקע. בדוק את פרופיל עוצמת הקרינה הגולמית של הנתונים כדי לקבוע ערך רקע מוערך, שהוא בדרך כלל כ-0.1.
- בתפריט ההגדרה של פירוק, הזן ערך ' מספר איטראציות מרבי ' של 40 וכבה את תיקון האקונומיקה. הזן ערך SNR מוערך, שהוא בדרך כלל כ-5.0. לחץ על "דבולבה".
- במקרה הצורך, חיזרו לקובץ הנתונים המקורי, התאימו את ערכי הרקע והSNR, וחזרו על הפרק, עד שהרעש יוסר במידה מספקת מבלי לסלק קרינה מקורית ממבנים עמומים.
- למזג את השדה ברייטזה ולפרק ערוצי זריחה. עבור שלבי עריכת הסרטים הבאים ב-ImageJ, סדר את הערוצים כך שאדום הוא הראשון, ירוק (אם קיים) הוא הבא בתור, כחול (אם קיים) הוא הבא בתור, וברייטפילד הוא האחרון. שמור את רצף התמונות כקובץ TIFF של 8 סיביות.
4. תיקון אקונומיקה ודור הסרט
- יבא את רצף התמונות החוצה לתוך ImageJ והמירו אותה להיפר-מחסנית על-ידי בחירה באפשרות תמונה > היפרערימות > מחסנית ל-Hyperstack. בחר באפשרות "xyzct" מהתפריט הנפתח ומלא את מספר הערוצים, פרוסות מחסנית Z ומסגרות הזמן (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
- בחרו ' תמונה > צבע ' > ערוצים מפוצלים.
- תקן את ערוצי הזריחה עבור הלבנה באמצעות התוסף ImageJ הזמין מ http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. לאחר התוסף הזה הורד והתקין, בחר תוספים > EMBLtools > תיקון אקונומיקה. בחר באפשרות "התאמה מעריכית".
- כדי למזג את ערוצי הקרינה הפלואורסצנטית ותיקון האקונומיקה לתוך hyperstack, בחרו ' תמונה > צבע ' > מיזוג ערוצים. שמור את ההיפר-מחסנית המתקבלת כקובץ TIFF של 8 סיביות.
- התקן את התוספים המותאמים אישית של ImageJ המסופקים עם פרוטוקול זה. בצע את ההוראות המופיעות במסמך הנלווה כדי להציג, לערוך ולכמת את רצף התמונות, ולהפיק את הסרט הסופי של ה-Z-ערימות המוקרנת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדוגמה שניתנה כאן מסמכים וככמת את ההבשלה של שתי Golgi cisternae שמרים כפי שדמיינו על ידי המיקרוסקופיה 4D מיקרוסקופית הצבע הכפולה3. תא שמרים מכיל על הסדר של 10-15 Golgi cisternae, שכל אחד מהם מתבגר במשך זמן של כ 2-4 דקות. התבגרות יכול להיות מדמיין על ידי תיוג מוקדם מסמן Golgi Vrg4 עם GFP ועל ידי תיוג המנוח Golgi סמן Sec7 עם פלורסנט אדום חלבון כגון מאנצ או מסקרלט. תוויות cisterna בודדות בתחילה עם סמן Vrg4, ולאחר מכן עובר מעבר קצר שבו הסמנים מוחלפים, ולאחר מכן מתייג עם סמן Sec7.
בגלל התא מכיל מרובים Golgi cisternae כי הם די ניידים, זה מאתגר לעקוב אחר cisterna בודדים לאורך כל תקופת תיוג. Cisternae הם לעתים קרובות מדי קרוב מדי כדי להיות מפוענח בהתחשב מתמיד את המגבלות הטמפורלית המרחבית של נתוני התמונה. יתר על כן, Golgi cisternae מדי פעם הפתיל14, ו golgi מאוחר cisternae נוטים אשכול באתרים של גידול מקוטב15. כתוצאה מכך, סרט 4D מניב לעתים נדירות יותר מcisternae אחת או שתיים שניתן לעקוב אחריהן באופן אמין. אחד השלבים המאתגרים ביותר בשיטה הוא לבחון את הסרט ההתחלתי של התחזיות של מחסנית Z ולזהות cisternae המבטיחים מועמדים לניתוח.
הנתונים מתארים צעדים רציפים בהליך:
איור 1 מציג מסגרות מסרטים של התחזיות של מחסנית Z של נתונים גולמיים או על-ידי פירוק ונתונים שתוקנו באקונומיקה. איור 1 A משווה את המסגרות הראשונות עבור נתונים גולמיים לעומת פירוק. איור 1 B הוא מתוך אותו סרט לפירוק, ומציג מספר מסגרות בהן שני הcisternae שנותחו בתווית תחילה עם סמן Vrg4 ירוק ומאוחר יותר עם הסמן האדום Sec7. הcisternae האלה נבחרו משום שהם מופרדים בבירור ממבנים אחרים המסומנים בתווית עבור רוב הסרט. התמונות בדמות זו נוצרו מתוך raw או לפרק ולתקן את ההיפרקות התלת-ממדית מסוג TIFF באמצעות "הפוך סדרות מונטאז", "מונטאז טור להיפר-מחסנית" ותוספים של "פרויקט Hyperstacks".
איור 2 מציג חלק מהמונטיום שנוצר עבור מחסנית Z באחת מנקודות הזמן, הן לפני והן אחרי העריכה כדי לבודד את האות מאחד מcisternae הנבחרים. התמונות בדמות זו נוצרו מההיפר-מחסנית התלת-ממדי של TIFF בשיטת "יצירת מונטאז" ו-"עריכת סדרות מונטאז".
איור 3 מציג מספר מסגרות מהסרט הסופי של ה-Z-ערימות (וידאו 1), עם התחזיות המקוריות בחלק העליון והתחזיות הערוכות בתחתית. התמונות באיור זה נוצרו מהמונוננים המקוריים והערוכות באמצעות "סדרת מונטאז ' להיפר-מחסנית", "מיזוג היפרערימות" ותוספים של "פרוייקט היפרערימות".
איור 4 מראה את הקוונפיקציה של אותות הירוק ואדום מcisternae הנבחרים. הנתונים עבור איור זה נוצרו מתוך היפרערימות שנערכו באמצעות התוסף "לנתח את הסרט הערוך".
ניתוח של אלה Golgi cisternae חשף כי הסמן Vrg4 מגיע וממשיך על 80 s, ולאחר מכן את Sec7 סמן מגיע ונמשך כ 60 s, עם תקופה קצרה של חפיפה בין שני סמנים. כפי שמוצג בדוגמה זו, הדמיה 4D מספקת מידע איכותי וכמותי לגבי הדינמיקה של תא שמרים.
איור 1 : התחזיות של Z-ערימות מסרט 4d. (א) התחזיות של הנתונים הגולמיים (משמאל) ונתונים לפירוק (מימין) מערימת ה-Z הראשונה בסרט 4d. האות הירוק הוא מ GFP-Vrg4, האות האדום הוא מ Sec7-mScarlet, ואת האות האפור הוא התמונות ברייטפילד של תאים שמרים. סרגל בקנה מידה = 2 μm. (ב) מסגרות הנציג מתוך הסרט הראשון המוצג (א) של הפירוק ו-Z מוקרן הארובות. נקודות זמן מסומנות. החיצים מסמנים את שני הcisternae שנבחרו לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : חלק מהמונטאז ' ממחסנית Z המתאימה לנקודת הזמן 01:20. כל תמונה במונטאז ' היא מקטע אופטי. הפאנל העליון מראה חלק מהמונטיום המקורי, והפאנל התחתון מראה את החלק המתאים של מונטאז ' הערוך שבהם האותות הcisterna מהנבחרים נשמרו באופן סלקטיבי. בכל פאנל, המקטעים האופטיים מסודרים משמאל לימין בשורה הראשונה ולאחר מכן משמאל לימין בשורה השניה. סרגל קנה מידה = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : מסגרות מהסרט הסופי של Zstacks מוקרן. בקטעים אלה מתוך וידאו 1, התמונות המקוריות מוצגות מעל לתמונות הערוכות. חמש המסגרות הראשונות מציגות cisterna אחת העוברת מעבר ירוק-לאדום, וחמש המסגרות הבאות מציגות cisterna שנייה העוברת מעבר דומה. חיצים המצופים בתמונות המקוריות מציינים את הcisternae שאחריהם מתבצע מעקב. סרגל קנה מידה = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : קוונפיקציה של אותות הזריחה מתוך וידאו 1. הגרפים מייצגים את האותות GFP-Vrg4 ו Sec7-mScarlet משני cisternae שנבחרו לניתוח, שם הפאנל העליון מייצג את הcisterna הופך להיות גלוי בתחילת הסרט והפאנל התחתון מייצג את הcisterna הופך גלוי מאוחר יותר בסרט. זמן אפס מוגדר עבור כל cisterna כמו המסגרת בדיוק לפני הזריחה GFP-Vrg4 התגלתה לראשונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הסרט האחרון של מוקרן Z-ערימות. החלונית העליונה מציגה את התחזיות המקוריות, והחלונית התחתונה מציגה את התחזיות הערוכות שבהן רק שתי הcisternae שנבחרו לניתוח גלויות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4d הדמיה קונפוקלית וקד של אורגלים שמרים דורש כוונון זהיר של פרמטרים מרובים. הדאגה העיקרית היא פוטוהלהלבנת ו פוטורעילות. סרט 4D אופייני כרוך באיסוף אלפי מקטעים אופטיים, כך שתאורת הלייזר חייבת להישמר כנמוכה ככל האפשר. התגים של חלבון פלואורסצנטי טנדם ניתן להשתמש כדי להגביר את האות מבלי להגדיל את הביטוי של חלבון מתויג16,17. למקסם את מהירות הסריקה מסייע להגביל את הנזק photodamage וגם מאפשר Z-ערימות להילכד במרווחי זמן קצרים כראוי. גדלים voxel הנמצאים במגבלת נייקוויסט ב-XY ו-Z מצמצמים את החשיפה לאור בעוד תיאורטית מתאוששת את המידע הזמין מההתקנה האופטית18. בסופו של דבר, כל voxel באזור המכיל אות של מקטע אופטי בדרך כלל לקבל רק 1-3 פוטונים. כמות זו של מידע רחוקה מאוד מתחת למה שבדרך כלל מומלצת לדימות אופטימלי עם מחסנית Z יחידה, או לפירוק. אבל הפירוק עדיין מסייע בהחלקת האותות הרועשים, וניתן לנתח ולכמת מערכות נתונים כאלה.
גם עם ערכת נתונים באיכות גבוהה של 4D, מעקב אחר בעלי תווית הארגונית היא משימה מורכבת. עם התוספים של ImageJ המסופקים כאן, חוקר יכול לערך כל מחסנית Z על מסך המחשב והוא יכול בקלות לנוע הלוך ושוב בין נקודות זמן ובין הנתונים המקוריים והערוכות. כלים אלה מאפשרים מבנים בעלי תוויות להיות מסומנים בזמן ובמרחב עם ביטחון סביר. עם זאת, השיפוט הסובייקטיבי ממלא את החלק ההכרחי, ויש להמנע מהטיה בכל עת אפשרית. תוכנת מעקב אחר חלקיקים עלולה לעזור אך עדיין אינה מתוחכמת מספיק עבור רוב התופעות הנלמדים. כדי לקזז מגבלה זו, מומלץ לבדוק סמנים מרובים כדי לבדוק את התחזיות של המודלים בדרכים שונות3,6,7.
4d הדמיה קונפוקלית וקד שיחק תפקיד מרכזי באפיון מסלולים הפרשה שמרים ו endocytic. שיטה זו הוכיחה כי טופס היציאה של אתר האינטרנט דה נובו וממשיכות ללא הגבלה1, אישר כי golgi cisternae בוגרת3,5, והבהיר את התפקיד של מעיל ושלפוחית הcopi ב golgi בהבשלה7, . בן 19 לאחרונה, 4D הדמיה סיפקה ראיות כי שמרים מוקדם אנדוזום זהה ל-Golgi המנוח, וכי האנדוזום מאוחר שמרים הוא תא ארוך חי6. בעוד הדמיה סטטית של התאים מתויג fluorescently ממשיך להיות יקר, 4D הדמיה מציעה תובנות ייחודיות לתוך עקרונות ההפעלה של אורגלים שמרים.
התפתחות מרגשת לאחרונה בזמינות של חלבונים התיוג העצמי עבור תיוג פלורסנט20. SNAP-תג מתנהג בצורה לא טובה כשותף היתוך בשמרים, אך הלוטאג מתנהג היטב. בהיר, ממברנה פוטויציבה-permeant הלוגן מצעים21 הפכו את זה אפשרי לבצע הדמיה מיקוד 4d עם צבעים האדום הרחוק6. תוספת של ערוץ הדמיה מרחוק אדום לערוצי הדמיה ירוק ואדום בשימוש בעבר מאפשר מיקרוסקופ תלת-צבעי תלת מימדי חזק23, ובכך להרחיב את מגוון התופעות שניתן ללמוד שמרים על ידי הדמיה של תאים חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק R01 GM104010. תודה על הסיוע עם מיקרוסקופ הזריחה כדי Vytas Bindokas וכריסטין Labno במתקן ליבה מיקרוסקופ משולב, אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן NIH ממומן תמיכה גרנט P30 CA014599.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).
