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Biology

Microscopie 4D de levure

Published: April 28, 2019 doi: 10.3791/58618
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Abstract

L'objectif de ce protocole est de caractériser la façon dont les compartiments membranaires se forment et se transforment en cellules vivantes de levure en herbe. Beaucoup de compartiments intracellulaires dans la levure sont dynamiques, et une compréhension complète de leurs propriétés exige l'imagerie de time-lapse. La microscopie multicolore de fluorescence confocale 4D est une méthode puissante pour suivre le comportement et la composition d'un compartiment intracellulaire sur une échelle de temps de 5-15 min. L'analyse rigoureuse de la dynamique des compartiments nécessite la capture de milliers d'optiques Sections. Pour atteindre cet objectif, le blanchiment photo et la phototoxicité sont réduits au minimum en scannant rapidement à très faible puissance laser, et les dimensions de pixel et les intervalles Z-step sont réglés aux plus grandes valeurs qui sont compatibles avec l'échantillonnage de l'image à pleine résolution. Les ensembles de données 4D qui en résultent sont bruyants mais peuvent être lissés par la déconvolution. Même avec des données de haute qualité, la phase d'analyse est difficile parce que les structures intracellulaires sont souvent nombreuses, hétérogènes et mobiles. Pour répondre à ce besoin, des plugins ImageJ personnalisés ont été écrits pour mettre en réseau des données 4D sur un écran d'ordinateur, identifier les structures d'intérêt, modifier les données pour isoler les structures individuelles, quantifier les cours de temps de fluorescence et faire des films des piles Z projetées. Les films 4D sont particulièrement utiles pour distinguer les compartiments stables des compartiments transitoires qui se retournent par maturation. De tels films peuvent également être utilisés pour caractériser des événements tels que la fusion de compartiments, et pour tester les effets de mutations spécifiques ou d'autres perturbations.

Introduction

Les compartiments du système endomembrane sont en constante évolution, et leur caractérisation complète nécessite une imagerie cellulaire vivante. Décrit ici est un protocole qui emploie la microscopie confocale 4D (time-lapse 3D) pour visualiser les compartiments fluorescents étiquetés dans les levures en herbe. La méthode a été développée pour suivre la dynamique des compartiments sécréteurs dans Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Ce protocole se concentre sur S. cerevisiae, qui a un Golgi non empilé dans lequel les cisternae individuelles sont optiquement résolvables4. L'organisation inhabituelle de Golgi dans S. cerevisiae a permis la démonstration par microscopie 4D qu'une cisterna de Golgi étiquette d'abord avec les protéines tôt résidentes de Golgi, et perd alors ces protéines tout en acquérant les protéines golgi tardives résidantes3 ,5. Cette transition peut être visualisée en créant une souche dans laquelle la protéine Golgi Vrg4 est étiquetée avec gFP tandis que la protéine Golgi tardive Sec7 est étiquetée avec une protéine fluorescente rouge monomeric. Lorsque les cisternae individuelles sont suivies, la maturation est observée comme une conversion vert-rouge3. Ce type d'analyse peut fournir des informations précieuses sur la localisation des protéines et l'identité du compartiment. Par exemple, deux protéines avec des heures d'arrivée et de départ légèrement décalées peuvent parfois sembler étiqueter différents compartiments dans des images statiques, mais peuvent être vues dans des films 4D pour étiqueter le même compartiment à différents points de temps6,7 . Ainsi, la microscopie 4D révèle des phénomènes qui ne seraient pas évidents autrement.

La microscopie 4D informative des compartiments à levures peut être réalisée avec des procédures et un équipement appropriés2. Dans la mesure du possible, le marquage des protéines fluorescentes est effectué par remplacement génétique8 pour éviter les artefacts surexpression. Parce que les structures intracellulaires sont souvent très dynamiques, la formation image 4D est nécessaire pour s'assurer qu'une structure est suivie de façon fiable au fil du temps. Le protocole décrit ici utilise un microscope confocal à balayage laser équipé de détecteurs de haute sensibilité. Avec cet appareil, le volume cellulaire entier de S. cerevisiae peut être imagepar microscopie confocale approximativement tous les 1-3 s, avec 2 intervalles de s étant typiques. Les données peuvent être recueillies jusqu'à 5-15 min en fonction des densités d'étiquetage des fluorophores et de leurs propriétés photophysiques. Le principal obstacle est de minimiser le photoblanchiment. À cette fin, les intensités laser sont maintenues aussi bas que possible, la vitesse de balayage confocal e est maximisée, et les paramètres optiques sont configurés pour l'image à la limite Nyquist afin de capturer les informations pertinentes tout en évitant l'exposition excessive à la lumière. Ces paramètres sont également censés soulager la phototoxicité, un facteur qui est souvent négligé lors de l'imagerie cellulaire en direct9,10,11. Les données bruyantes qui en résultent sont traitées avec des algorithmes de correction de l'eau de Javel et de déconvolution pour faciliter la quantification des intensités de fluorescence.

Même avec des films 4D de haute qualité, l'analyse est délicate parce que les compartiments à levures ont tendance à être nombreux, hétérogènes et mobiles. En raison des limites intrinsèques de la microscopie confocale et des réglages non optimaux requis pour une imagerie 4D prolongée, les structures fluorescentes qui sont proches les unes des autres sont difficiles à résoudre. Ce problème peut être contourné en se concentrant sur le petit nombre de structures fluorescentes qui restent optiquement résolvables pendant toute la durée de la période d'étiquetage, en supposant que ces structures sont représentatives de l'ensemble de la population d'étiquettes Compartiments. Les compartiments fluorescents qui peuvent être suivis de façon fiable sont identifiés en visionnant des films de piles Z projetées et en créant une série de montages dans lesquels les sections optiques pour chaque point de temps sont disposées sur un écran d'ordinateur. Cette analyse utilise des plugins ImageJ12 personnalisés, qui permettent de suivre une structure individuelle de manière isolée.

Des méthodes récentes ont couvert l'utilisation de protéines fluorescentes dans la levure13 ainsi que la théorie et la pratique de l'imagerie confocale 4D des cellules de levure2. Ce protocole se concentre sur les principaux aspects pratiques d'une expérience d'imagerie 4D. Il comprend quelques améliorations aux procédures précédemment décrites, ainsi que des versions mises à jour du code plugin ImageJ et de la documentation. L'exemple montré se concentre sur la dynamique Golgi, mais ce protocole est tout aussi approprié pour l'imagerie d'autres compartiments à levures.

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Protocol

1. Préparation

  1. Faire non fluorescent minimal NSD moyen2. L'absence de riboflavine devrait réduire la fluorescence verte intracellulaire de fond et la phototoxicité associée.
  2. Cultivez la souche de levure pendant la nuit à 23 oC jusqu'à la phase logarithmique en 5 mL de NSD dans un flacon déconcerté de 50 ml avec une bonne aération. Environ 3-4 h avant l'analyse, diluer la culture de levure dans NSD frais de sorte que l'OD600 final sera 0.5-0.8 au moment de l'imagerie.
  3. Préparer une solution de 2 mg/mL de concanavaline A (ConA). Si vous le souhaitez, congeler les aliquots de cette solution dans de l'azote liquide et les stocker à -80 oC.
  4. Faites tourner la solution ConA pendant 5 minutes à pleine vitesse dans un microcentrifugepour enlever les particules qui peuvent interférer avec l'imagerie. Ensuite, ajoutez 250 l de supernatant à un plat de microscopie propre de 35 mm de fond de verre de couverture. Après 15 min, laver 2-3 fois avec 2 ml de dH2O et laisser sécher.
  5. Ajoutez 250 l l de la culture de levure au plat ConA-enduit, attendez 10 min pour permettre aux cellules d'adhérer, et lavez doucement 2-3 fois avec 2 mL NSD. Couvrir les cellules de 2 ml de NSD frais.

2. Imagerie

  1. Utilisez une lentille d'immersion d'huile 63x ou 100x. Une ouverture numérique (NA) de 1,40 est suffisante, mais une lentille NA plus élevée peut également être utilisée.
  2. Format de la taille du cadre à 256 x 128 (largeur x hauteur). Si une plus grande taille de cadre est nécessaire, l'augmentation de la largeur ne réduira pas la vitesse d'analyse tant que le microscope confocal est équipé d'un scanner résonant.
  3. Ajustez le facteur de zoom pour faire la taille du pixel 80 nm.
  4. Utilisez la vitesse maximale d'analyse, qui est généralement de l'ordre de 8 kHz. Activez la numérisation Bidirectionnelle X si elle est disponible, et si les expériences de contrôle confirment que les scans des deux directions sont enregistrés.
  5. Définir l'accumulation de la ligne à 4 ou 6. Assurez-vous d'utiliser l'accumulation (somme) au lieu de la moyenne.
  6. Définir le trou d'épingle à 1,2 unités Airy. Empiriquement, lors de l'imagerie des cellules de levure vivantes, ce paramètre capture plus de photons que le choix standard de 1.0 Airy unité tout en ne causant aucune perte appréciable de résolution.
  7. Pour chaque canal de fluorescence, définir la longueur d'onde de l'excitation, assigner un détecteur de haute sensibilité, définir la plage de longueur d'onde des émissions et activer le mode de comptage des photons si disponible. Les choix de longueur d'onde dépendront des fluorophores. À titre d'exemple, excitez la fluorescence GFP à 485 nm et collectez de 495-550 nm, et excitez la fluorescence mScarlet à 555 nm et collectez de 562-625 nm.
  8. Définir l'intensité de chaque laser pour être aussi faible que possible. Ce paramètre doit être déterminé empiriquement. Une intensité appropriée se traduira par la capture d'une séquence d'image bruyante mais interprétable, avec le signal de fluorescence blanchissant pas plus de 50% à la fin d'un film de 5 min. Sur le microscope confocal utilisé ici (voir Tableau des Matériaux),cette intensité correspond à un réglage de puissance laser de l'ordre de 5%.
  9. Utilisez des filtres d'encoche ou des talonnages pour éviter de capter la lumière réfléchie du bordereau. Si le chronolimage est disponible, définir la fenêtre de gating à 0.6-10.0 ns.
  10. Activez l'imagerie brightfield et utilisez un détecteur de faible sensibilité pour la collecte de données. Définiz le gain à un niveau qui rend les cellules clairement visibles. N'utilisez pas de contraste d'interférence différentiel (DIC) parce que le prisme interfère avec la capture de données fiables sur la fluorescence.
  11. Définir l'intervalle Z-step à 0,25-0,35 m. Imager l'ensemble du volume des cellules de levure en recueillant environ 20-25 sections optiques par z-pile. Spécifiez la directionnalité de l'imagerie de telle sorte que « vers le bas » se déplace vers le bordereau de couverture.
  12. Pour un film typique, fixez l'intervalle de temps entre les z-stacks à 2 s et fixez la durée du film à 5 à 10 min. Selon le compartiment à l'étude, réduisez l'intervalle pour faire des films plus courts de dynamique relativement rapide, ou augmentez l'intervalle pour faire des films plus longs de dynamique relativement lente.
  13. Enregistrer le film comme un fichier LIF avec les images brightfield dans le dernier canal. Des profondeurs de bits plus élevées ne sont pas nécessaires à ce stade, et le pipeline de traitement est configuré pour accepter les données 8 bits Du TIFF.

3. Deconvolution

  1. Lancez le logiciel de déconvolution (voir Tableau des matériaux), à l'aide de l'algorithme classic Maximum Likelihood Estimation.
  2. Ouvrez l'ensemble de données généré à l'étape 2.13. Sélectionnez "Deconvolution Wizard". Inspectez les valeurs affichées dans l'assistant "Parameter". Les paramètres d'imagerie doivent être détectés et correctement affichés. Sous les « indices réfractifs », modifiez la valeur « Embedding med » à 1,40 pour se rapprocher du cytoplasme de levure. Sous "coverslip", sélectionnez "Launch editor" et "Estimate position" et "OK" pour définir la position de coverslip. Sélectionnez "Set all verified" et "Accept".
  3. Passez par le « magicien de la déconvolution » pour chaque canal de fluorescence. Sélectionnez "Manuel" comme mode d'estimation de fond. Inspecter le profil d'intensité de la fluorescence des données brutes pour déterminer une valeur de fond estimée, qui est généralement d'environ 0,1.
  4. Dans le menu de configuration de la déconvolution, entrez une valeur « Itérations maximales » de 40 et éteignez la correction de l'eau de Javel. Entrez une valeur SNR estimée, qui est généralement d'environ 5,0. Cliquez sur "Deconvolve".
  5. Si nécessaire, retournez au fichier de données d'origine, ajustez l'arrière-plan et les valeurs SNR, et répétez la déconvolution, jusqu'à ce que le bruit soit suffisamment enlevé sans éliminer la fluorescence authentique des structures sombres.
  6. Fusionnez les canaux de fluorescence brightfield et déconvolved. Pour les étapes de montage de films ultérieures dans ImageJ, organiser les canaux de telle sorte que le rouge est d'abord, vert (si présent) est le prochain, bleu (si présent) est le prochain, et brightfield est le dernier. Enregistrer la séquence d'image comme un fichier TIFF 8 bits.

4. Bleach Correction et génération de films

  1. Importer la séquence d'image décongestionné dans ImageJ et le convertir en une hyperpile en choisissant l'image 'gt; Hyperstacks 'gt; Stack à Hyperstack. Sélectionnez "xyzct" dans le menu déroulant, et remplissez le nombre de canaux, de tranches Z-stack et de délais (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Choisissez l'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels.
  3. Corriger les canaux de fluorescence pour le photoblanchiment à l'aide du plugin ImageJ disponible à partir de http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Une fois que le plugin a été téléchargé et installé, choisissez Plugins 'gt; EMBLtools 'gt; Bleach Correction. Sélectionnez "Exponential Fit".
  4. Pour fusionner les canaux de fluorescence corrigés de brightfield et d'eau de Javel dans une hyperpile, choisissez l'image 'gt; Color 'gt; Merge Channels. Enregistrer l'hyperpile résultante comme un fichier TIFF 8 bits.
  5. Installez les plugins ImageJ personnalisés fournis avec ce protocole. Suivez les instructions dans le document d'accompagnement pour visualiser, modifier et quantifier la séquence d'images, et pour produire un film final des z-stacks projetés.

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Representative Results

L'exemple donné ici documente et quantifie la maturation de deux levures Golgi cisternae telles que visualisées par microscopie confocale 4D double couleur3. Une cellule de levure contient sur l'ordre de 10-15 Golgi cisternae, dont chacun mûrit sur un cours de temps d'environ 2-4 min. Maturation peut être visualisé en taguant le marqueur Golgi tôt Vrg4 avec GFP et en taguant le marqueur Golgi tardif Sec7 avec un fluorescent rouge comme mCherry ou mScarlet. Une cisterna individuelle étiquette d'abord avec le marqueur Vrg4, puis subit une brève transition dans laquelle les marqueurs sont échangés, puis les étiquettes avec le marqueur Sec7.

Parce que la cellule contient plusieurs cisternae Golgi qui sont assez mobiles, il est difficile de suivre une citerne individuelle tout au long de la période d'étiquetage. Les cisternae sont souvent trop proches l'une de l'autre pour être résolues sans ambiguïté compte tenu des limites temporelles et spatiales des données d'image. En outre, Golgi cisternae fusionnent occasionnellement14, et golgi cisternae tardif ont tendance à se regrouper à des sites de croissance polarisée15. En conséquence, un film 4D donne rarement plus d'une ou deux cisternae qui peuvent être suivis de façon fiable. L'une des étapes les plus difficiles de la méthode est d'examiner le film initial des projections Z-stack et d'identifier les cisternae qui sont des candidats prometteurs pour l'analyse.

Les figures représentent des étapes séquentielles dans la procédure :

La figure 1 montre les images des films des projections De la pile Z de données brutes ou de données déconvolées et corrigées de l'eau de Javel. Figure 1 A compare les premières images pour les données brutes par rapport aux données déconvolées. Figure 1 B est du même film déconvolé, et montre plusieurs images dans lesquelles les deux cisternae qui ont été analysés étiquette d'abord avec le marqueur vert Vrg4 et plus tard avec le marqueur rouge Sec7. Ces cisternae ont été choisies parce qu'elles sont clairement séparées des autres structures étiquetées pour la plupart du film. Les images de cette figure ont été générées à partir d'hyperstacks 4D TIFF bruts ou déconvolés et corrigés de l'eau de Javel à l'aide des plugins "Make Montage Series", "Montage Series to Hyperstack" et "Project Hyperstack".

La figure 2 montre une partie du montage qui a été créé pour une pile Z à l'un des moments, avant et après l'édition pour isoler le signal de l'une des cisternae choisies. Les images de cette figure ont été générées à partir de l'hyperpile 4D TIFF décongestionnante et corrigée de l'eau de Javel à l'aide des plugins "Make Montage Series" et "Edit Montage Series".

La figure 3 montre plusieurs images du film final des z-piles projetées (Vidéo 1), avec les projections originales en haut et les projections éditées en bas. Les images de cette figure ont été générées à partir des montages originaux et édités à l'aide des plugins "Série Montage à Hyperstack", "Merge Hyperstacks" et "Project Hyperstacks".

La figure 4 montre la quantification des signaux de fluorescence vert et rouge des cisternae choisies. Les données de ce chiffre ont été générées à partir des hyperstacks édités à l'aide du plugin "Analyze Edited Movie".

L'analyse de ces cisternae Golgi a révélé que le marqueur Vrg4 arrive et persiste pendant environ 80 s, puis le marqueur Sec7 arrive et persiste pendant environ 60 s, avec une brève période de chevauchement entre les deux marqueurs. Comme l'illustre cet exemple, l'imagerie 4D fournit des informations qualitatives et quantitatives sur la dynamique d'un compartiment à levures.

Figure 1
Figure 1 : Projections de z-stacks à partir d'un film 4D. (A) Projections des données brutes (à gauche) et des données décongestionnelles (à droite) du premier Z-stack dans un film 4D. Le signal vert provient de GFP-Vrg4, le signal rouge est de Sec7-mScarlet, et le signal gris est les images brightfield des cellules de levure. Barre d'échelle de 2 m . (B) Cadres représentatifs du film initial montré dans (A) des piles Z déconvolées et projetées. Les points de temps sont indiqués. Les flèches marquent les deux cisternae qui ont été choisies pour l'analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Une partie du montage de la pile Z correspondant au point de 01:20. Chaque image du montage est une section optique. Le panneau supérieur montre une partie du montage original, et le panneau inférieur montre la partie correspondante du montage édité dans laquelle les signaux de fluorescence de la cisterna choisie ont été sélectivement conservés. Dans chaque panneau, les sections optiques sont commandées de gauche à droite dans la première rangée, puis de gauche à droite dans la deuxième rangée. Barre d'échelle de 2 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Cadres du film final des Zstacks projetés. Dans ces extraits de la vidéo 1, les images originales sont montrées au-dessus des images modifiées. Les cinq premières images montrent une citerne qui subit une transition vert-rouge, et les cinq images suivantes montrent une deuxième citerne qui subit une transition similaire. Les flèches superposées sur les images originales indiquent les cisternae qui ont été suivies. Barre d'échelle de 2 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Quantification des signaux de fluorescence de la vidéo 1. Les graphiques représentent les signaux GFP-Vrg4 et Sec7-mScarlet des deux cisternae choisies pour l'analyse, où le panneau supérieur représente la citerne qui devient visible au début du film et le panneau inférieur représente la citerne qui devient visible plus tard dans le film. Le temps zéro est défini pour chaque cisterna comme le cadre juste avant que la fluorescence GFP-Vrg4 ait été détectée pour la première fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1 : Film final des z-stacks projetés. Le panneau supérieur montre les projections originales, et le panneau inférieur montre les projections modifiées dans lesquelles seules les deux citernes choisies pour l'analyse sont visibles. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

La formation image confocale 4D des organites de levure exige l'adage soigneux des paramètres multiples. La principale préoccupation est le blanchiment et la phototoxicité. Un film 4D typique consiste à collecter des milliers de sections optiques, de sorte que l'éclairage laser doit être maintenu aussi bas que possible. Les étiquettes de protéines fluorescentes Tandem peuvent être utilisées pour stimuler le signal sans augmenter l'expression de la protéine étiquetée16,17. La maximisation de la vitesse d'analyse permet de limiter les dégâts photo, et permet également aux piles Z d'être capturées à intervalles convenablement courts. Les tailles de Voxel qui sont à la limite de Nyquist dans les deux XY et Z minimiser l'exposition à la lumière tout en récupérant théoriquement l'information qui est disponible à partir de la configuration optique18. En fin de compte, chaque voxel dans une zone contenant un signal d'une section optique ne recevra généralement que 1-3 photons. Cette quantité d'informations est bien inférieure à ce qui est normalement recommandé pour une imagerie optimale avec une seule pile Z, ou pour la déconvolution. Mais la déconvolution aide toujours en lissant les signaux bruyants, et ces ensembles de données peuvent être analysés et quantifiés.

Même avec un jeu de données 4D de haute qualité, le suivi des organites étiquetés est une tâche complexe. Avec les plugins ImageJ fournis ici, un chercheur peut tableau chaque Z-pile sur l'écran de l'ordinateur et peut facilement se déplacer d'avant en arrière entre les points de temps et entre les données originales et modifiées. Ces outils permettent de suivre les structures étiquetées dans le temps et dans l'espace avec une confiance raisonnable. Cependant, le jugement subjectif joue un rôle nécessaire, et la partialité doit être évitée chaque fois que c'est possible. Logiciel de suivi des particules pourrait potentiellement aider, mais n'est pas encore assez sophistiqué pour la plupart des phénomènes qui sont à l'étude. Pour compenser cette limitation, il est préférable d'examiner plusieurs marqueurs et de tester les prédictions des modèles de différentes manières3,6,7.

L'imagerie confocale 4D a joué un rôle central dans la caractérisation des voies sécrétrices et endocytiques de levure. Cette méthode a démontré que les sites de sortie ER forment de novo et persistent indéfiniment1, a confirmé que Golgi cisternae mature3,5, et a clarifié le rôle du manteau de vésicule COPI dans la maturation Golgi7, 19. Plus récemment, l'imagerie 4D a fourni la preuve que la levure endosome précoce est identique à la fin de Golgi, et que la levure endosome fin est un compartiment à longue durée de vie6. Alors que l'imagerie statique des compartiments étiquetés fluorescents continue d'être précieuse, l'imagerie 4D offre un aperçu unique des principes de fonctionnement des organites de levure.

Un développement récent passionnant dans la disponibilité des protéines auto-étiquetées pour le marquage fluorescent20. SNAP-tag se comporte mal comme un partenaire de fusion dans la levure, mais HaloTag se comporte bien. Les substrats HaloTag lumineux et phototables de HaloTag21 ont permis d'effectuer une imagerie confocale 4D avec des colorants rouges lointains6. L'ajout d'un canal d'imagerie rouge lointain aux canaux d'imagerie vert et rouge précédemment utilisés permet une microscopie 4D à trois couleursrobuste 23, élargissant ainsi la gamme de phénomènes qui peuvent être étudiés dans la levure par l'imagerie cellulaire en direct.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01 GM104010. Merci pour l'aide à la microscopie de fluorescence à Vytas Bindokas et Christine Labno à l'installation de base de microscopie intégrée, qui est soutenu par le Nih-financé Cancer Center Support Grant P30 CA014599.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5 MatTek P35G-0.170-14-C Imaging dishes
Concanavalin A powder Sigma-Aldrich C2010
Trolox Vector Laboratories CB-1000
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite X  Leica Microsystems Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04 Scientific Volume Imaging Deconvolution software
ImageJ NIH Image processing and analysis software

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References

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