Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

Abstract

תאים לחוש ולהגיב רמזים פיזי בסביבה שלהם על-ידי המרת גירויים מכניים אותות נסתרים מבחינה ביוכימית בתהליך הנקרא mechanotransduction. שלב חיוני ב- mechanotransduction הוא העברת הכוחות בין סביבות חיצוניים ופנימיים. לשדר הכוחות, חייב להיות מתמשך, רצופה הפיזי הצמדה שנוצרו על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון חלבון. אינטראקציה חלבון נתון, עומס מכני יכול לקבל שום השפעה על האינטראקציה, להוביל מהר יותר השיוך של האינטראקציה, או אפילו לייצב את האינטראקציה. הבנת איך מולקולרית עומס מכתיב מחזור חלבונים בתאים חיים יכולים לספק מידע יקר ערך על מצב מכני של חלבון, בתורו שחקרתי את תפקידו ב- mechanotransduction. קיימות טכניקות למדידת dynamics רגישים ל"כוח הפזורים חלבון או חוסר מדידות ישירה של עומס חלבון או להסתמך על המדידות שבוצעו מחוץ להקשר הסלולר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להתאוששות העברה-זריחה פורסטר תהודה אנרגיה לאחר photobleaching (סריג-FRAP) טכניקה, אשר מאפשר את המדידה של חלבון רגישים ל"כוח הפזורים הדינמיקה בתוך תאים חיים. טכניקה זו ישימה פוטנציאלי על כל חיישן מתח מבוסס סריג, בקידום המחקר של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבון במגוון מבנים subcellular, סוגי תאים שונים.

Introduction

הסביבה חוץ-תאי הוא מקור עשיר של סימנים ביוכימיים והן פיזית המכתיבים בהתנהגות התא. בפרט, הטבע הגופני של microenvironment יכולה לתווך תאיים מפתח, כולל צמיחת תאים, העברה של בידול1,2,3,4. Dysregulation של המכניקה של microenvironment הוא מרכיב קריטי למחלות רבות שאין להן עדיין טיפולים נאותים, כגון סרטן5, טרשת עורקים6ו פיברוזיס7. הבנה מלאה של מה תאים להמיר לגירויים פיזיים לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, תהליך הנקרא mechanotransduction, דורש הבהרה של המנגנון המולקולרי תיווכה כוח שידור, לתוך והן התאים ו בתוך מבנים subcellular מרובים.

בתוך מבנים subcellular, חלבונים משתנים כל הזמן איגוד, פעולת ההוצאה מהאוגדן המבוססת על האינטראקציות שלהם עם האיגוד שותפים8. עבור כוחות בהצלחה ישודרו על-פני מרחק פיזי, בטח יש שרשרת רצופה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כלומר כי המחזור של חלבון חייבת להיות איטית מספיק לקיים ולשדר לכוח השותף שלה מחייב9. בעוד אינטראקציות חלבון-חלבון כלל מורכבות של מספר שאינו-קשרים הדדיים בין חלבון, האינטראקציה נתפסת לעתים קרובות כמדינה מאוגד יכול העוברות למצב לא מאוגד תחת תנאים שונים10, 11. לאינטראקציה חלבון נתון, זה אפשרי כי כוח יכולים להיות ללא השפעה על חייו של האינטראקציה, המכונה "בונד אידיאלי", להפחית את אורך החיים של האינטראקציה, המכונה "קשר slip," או להגדיל את אורך החיים של האינטראקציה , המכונה "לתפוס בונד"10. לפיכך, יש מערכת יחסים מורכבות בין עומס חלבון חלבון דינמיקה, אשר אנו מתייחסים כאל רגישים ל"כוח הפזורים דינמיקה.

לקראת הבנת ההשפעה של עומס על דינמיקה בונד, בוצעו מספר ניסויים מאוד אינפורמטיבי על רמת מולקולה בודדת. באמצעות חלבונים מבודד, או שברי חלבונים ו טכניקות מניפולציה כגון פינצטה מגנטי, מלקחיים אופטיים מיקרוסקופ כוח אטומי, מחקרים אלה הראו אינטראקציות חלבון רגישים ל"כוח הפזורים עבור מספר הרלוונטיים חלבונים11,12. שניהם אינטגרינים13 ו cadherins14, אשר חשוב עבור יוצרים אינטראקציות מטריצה תא ותא תא, בהתאמה transmembrane חלבונים, הראו שינויים ב- dynamics בשל כדי לטעון. בתוך התא, vinculin הוא גויס בשני talin15 וα-catenin16 באופן תלוי-כוח והוא יכול ליצור קשר לתפוס עם אקטין17, המציינת את תפקיד מכריע עבור vinculin-מוקד הדבקויות (FAs) והן adherens צמתים (AJs ) תחת עומס. מולקולה בודדת מחקרים לאפשר ניתוקה של אינטראקציות חלבון ספציפי להניב פירות ברורה וחד משמעית, אבל הם לא מהווים המורכבות של הסביבה התאית.

ציון דרך ניסויים הראו כי מספר מבנים subcellular, כולל FAs ו AJs, הן mechanosensitive, התערוכה הרכבה משופרת בתגובה נטען שנוצר באופן פנימי או חיצוני שהוחל18,19, 20,21,22. בנוסף, מספר מודלים תיאורטיים הראו כי מכלול mechanosensitive יכול להיות מונע על ידי כוח רגיש חלבון dynamics23,24,25. לבחון הדינמיקות האלה רגישים ל"כוח הפזורים בתוך תאים חיים, ננקטו כמה גישות עקיף. FRAP טכניקות הקשורות לספק מתודולוגיה פשוטה יחסית למדידת חלבון דינאמיקה של תאים26,27,28,29. עם זאת, המדד של עומס חלבון הוגבלה יותר. גישה אופיינית היא להשוות dynamics החלבון בתאים עם ובלי את החשיפה מעכב cytoskeletal להשתמש בהם כדי להפחית הכוללת תא contractility8,30,31. מבחינה מושגית, זוהי השוואה בין לעומס גבוה לבין המדינה עומס נמוך. עם זאת, יש אין כימות של העומס על פני החלבון במצב או, ייתכן שיש לא מכוונות אפקטים הביוכימי של המדכא, כגון אובדן של אתרי קישור מפתח לאורך נימה F-אקטין. גישה אחרת, ספיציפית FAs, כבר למדוד מאמץ כוח מוחלט על המצע על-ידי הפא באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה משוער עומס מולקולרית ולבחון את הקשר עם הדינמיקה של חלבון יחיד בתוך הפא32. בעת גישה זו מאפשרת כימות של הכוח הכולל, אינה מספקת מידע מולקולרי ספציפי. FAs מורכב של מעל 200 חלבונים שונים, רבים מהם יכול לשאת עומס33. לפיכך, מדידת הפלט כוח מוחלט של הפא פוטנציאל מטשטש את האפשרות של מסלולים שידור כוח מרובים, לא אמין לספק מידה של עומס על חלבון ספציפי.

בניגוד גישות הקודם ב- mechanobiology, כניסתו של מתח מבוסס סריג חיישנים מאפשר ישיר מדידה של המון מנוסים על ידי חלבונים ספציפיים בתוך החיים תאים34,35,36. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב מתח מבוסס סריג חיישנים מבוססי FRAP מדד של חלבון דינמיקה. אנו מתייחסים טכניקה זו כאל FRAP סריג. גישה זו מאפשרת את המדידה בו זמנית של עומס חלבון ואת הדינמיקה חלבון, ובכך מאפשר את ההערכה של דינמיקת רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים (איור 1). . כבר, הטכניקה סריג-FRAP הוחל במחקר של הדינמיקות רגישים ל"כוח הפזורים של vinculin חלבון37מקשר מכני. המתח חיישנים פותחו חלבונים רבים הרלוונטיים במגוון מבנים subcellular. לדוגמה, חיישנים פותחו עבור vinculin34 / talin38,39 FAs, cadherins catenins AJs40,41,42, nesprin ב הלינק גרעיניים מורכבים 43, α-actinin44 , filamin36 , שלד התא, ו- MUC-1 ב- glycocalyx45, בין היתר46. בדומה, FRAP הוא שטכניקה נפוץ שימש על mechanosensitive חלבונים בתוך8,הידבקויות מוקד31, צמתי adherens47, קליפת אקטין26, ואת גרעין48. לנוע קדימה, שהטכניקה FRAP סריג צריך להיות בהרחבה החלים על כל אלה חיישנים קיימים או לאחרונה פיתחה חיישנים, המאפשר המידות של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים במגוון רחב של מבנים subcellular והקשרים. למטרה זאת, אנו מספקים נתונים היסטוריים, כללית פרוטוקול ליישום הטכניקה סריג-FRAP ישים במערכות שונות אלו. בתקווה, זה יאפשר מגוון רחב של ניסויים שחקרתי את התפקידים של חלבונים mechanosensitive שונים בוויסות כוח שידור, מתווכים בהתנהגות התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ליצור את דוגמאות עבור הדמיה

  1. לבנות חיישן המתח stably אקספרס בסוג התא הרצוי.
    1. לשבט לבנות חיישן המתח וקטור pRRL או אחרים פלסמיד ביטוי ויראלי.
      הערה: מספר כלים שיבוט מולקולרי שונים זמינים להשיג את שלב זה כולל שימוש אנזימי הגבלה, חופפים סיומת ולאחר ההרכבה גיבסון35. וקטור pRRL משמש lenti ויראלי התמרה חושית ומאפשרת מידה ניכרת של ייצור החלבון באמצעות ייצוג המקדם cytomegalovirus אנושי (CMV). ייתכן שיהיה צורך וקטורים שונים בהקשר מסוים. למשל, האמרגן CMV מושתק, כמה סוגים של תאים49. בנוסף, רק חיישנים מבוסס סריג המכיל חלבון פלואורסצנטי הומולוגיה רצף חזק את חוסר, כגון mTFP1 ו- A206K ונוס, יכול לשמש כדי ליצור שורות תאים יציב. חיישנים המכילה חלבון פלואורסצנטי ציאן, חלבון פלואורסצנטי צהוב צפוי להיות כפופים רקומבינציה הומולוגית50.
    2. צור lentivirus בתאים אנושיים עובריים כליות (HEK) 293T באמצעות psPax2 ו- pMD2.G אריזה פלסמידים באמצעות שיטות ייצור וירוס רגיל51.
      התראה: Lentivirus צריך רק להיות מטופלים על ידי צוות מיומן כראוי בסביבת מעבדה רמה 2 אבטחה.
      הערה: שילוב זה של תאים, פלסמידים אריזה מתאימה לשימוש עם pRRL. מערכות אחרות עשוי להידרש עם וקטורים אחרים.
    3. מגלי התאים הרצויים עם וירוס באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים התמרה חושית52 ולהשתמש cytometry זרימה כדי למיין תאים53 בחירת אוכלוסיה הומוגנית לבטא כל לבנות-רמות אנדוגני כ37. לאחר בחירת התא, ניסויים יכול להתבצע באופן מיידי, או תאים יכולים להיות מוקפאים לשימוש מאוחר יותר. לא יעלה על 2 מחזורים ההקפאה-הפשרה עבור קו נתון תא יציב.
      הערה: השימוש של שורות תאים בנכונותם החלבון להיות למד (למשל, vinculin- / - MEFs לשימוש עם חיישן המתח vinculin) יגדיל את אות רעש יחס בניסויים סריג, כמו גם להגביל ביטוי יתר חפצים. קווים אלה מתחלקים פיברובלסט (MEF) יציבה העכבר יכול לשמש כ- 15 קטעים לפני אובדן משמעותי של ביטוי או השפלה של חיישנים בולטת. אם שיטות מבוססות ויראלי אינו רצוי, שפע של ריאגנטים מסחרי יכול לשמש על פי הפרוטוקול של היצרן transiently transfect מגוון רחב של סוגי תאים עם חיישנים המתח פלסמיד המתאים, כגון pcDNA3.1. הביטוי אופטימלי יהיה 24-48 שעות לאחר תרביות תאים.
  2. להכין מצעים תא זריעה.
    1. רוכשים 4, מנות תת 35 מ מ.
    2. עובד בברדס התרבות תאים, צינור הקנוני 15 מ"ל, ודא 4 מיליליטר 10 µg/mL fibronectin בתמיסת באגירה פוספט (PBS) באמצעות PBS סטרילי בשכונה התרבות התא. היפוך בעדינות את הצינור פעם לערבב ולתת הפתרון לשבת 5 דקות בשכונה התרבות תאים.
      הערה: הריכוז או סוג של חלבון ה-ECM ייתכן שיהיה עליך לכוונן את סוגי תאים אחרים. התנאים הניתנים מתאימים MEFs.
    3. פיפטה 1 מ"ל של פתרון fibronectin על כל מנה עם תחתית זכוכית.
    4. להשאיר את הפתרון fibronectin על המנות לשעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב 4 º C.
    5. האחות הפתרון fibronectin, לשטוף פעם עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל ל- PBS.
  3. הזרע התאים על גבי מצעים מוכן.
    1. להתחיל עם התאים של עניין-אחוז הנהרות מתאים subcultivation לצלחת תרבות 6 ס מ.
      הערה: סוגי תאים שונים ידרוש תנאים התרבות תאים נפרדים ופרוטוקולים subcultivation. סעיף זה מספק קווים מנחים מתאימים MEFs. בדרך כלל, MEFs גדלים הנהרות 85% לפני subcultivation.
    2. עובד בתוך ברדס התרבות תאים, לשטוף את התאים פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA דגירה למשך 5 דקות ב 37 º C.
    3. להוסיף 3 מ"ל של התקשורת מלאה למנה 6 ס מ, לאסוף את התאים, למקם את צינור חרוטי 15 מ"ל.
      הערה: קומפוזיציה לתקשורת מלאה יהיה תלוי בסוג התא בשימוש. עבור MEFs, התקשורת מלאה מוגדר לעתים קרובות ששינה נשר בינוני של גלוקוז גבוהות Dulbecco עם סרום שור עוברית 10%, 1% אנטיביוטיקה-Antimycotic (המכיל המפוטריצין פניצילין, סטרפטומיצין), ופתרון 1% חומצת אמינו שאינן הכרחיות (NEAA).
    4. ספין התאים למטה ב- 1000 g x במשך 5 דקות.
    5. האחות התקשורת, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של התקשורת מלאה.
    6. הסר PBS כלי הזכוכית מצופה fibronectin. לספור את התאים, זרע תאים 30,000 על כל מנה fibronectin מצופה זכוכית עם המדיה מלאה המתאימה עבור אמצעי אחסון הסופי של 1.5 מ.
      הערה: צפיפות תא הזה מתאים MEFs, יוביל אוכלוסיה של התאים שאינם נוגע ללב, אבל לא דליל מאוד. המספר המדויק תא ייתכן שתצטרך לכוונן את סוגי תאים אחרים או חדר דימות אחרים.
    7. לאפשר את התאים להפיץ במשך 4 שעות לאחר זריעה. ב 2 h של התפשטות, תשאף התקשורת צמיחה, לשטוף פעם עם הדמיה מדיה, עוזב 1.5 מ של הדמיה מדיה.
      הערה: הפעם מתפשטת מתאים MEFs, אך ייתכן שתצטרך להשתנות עבור תאים אחרים. עם זאת, פרקי זמן דגירה של יותר מ 6-8 h תוביל למתן עדות משמעותית של חלבון ה-ECM של הנסיוב בתקשורת מלאה. הדמיה מדיה צריך להכיל התוספות אותו כמו מדיה מלאה אבל צריך להיות שטיחות לנקות ולא להכיל כל תרכובות לזרוח בערוצים הדמיה, כגון flavins, או להרוות פלורסצנטיות, כגון פנול אדום. בדרך כלל שימושי מדיה הדמיה הוא DMEM-gfp לחיות תא ויזואליזציה מדיה בתוספת 10% FBS ו 1% פתרון NEAA. אם הרקע autofluorescence מתקבל על הדעת, אז הסכום של סרום יכול להיות מופחת. אם שינוי המדיה אינו אפשרי לאחר ציפוי הראשונית, התאים להיות resuspended ישירות בהדמיה מדיה בתוספת מעכב טריפסין.

2. להגדיר את המיקרוסקופ עבור הדמיה

  1. הפעל את המיקרוסקופ.
    1. הפעל את המנורה הקשת הראשונה.
      הערה: מנורת קשת תשחרר פולס אלקטרומגנטי, אשר עלולה לגרום נזק ציוד אחר שכבר נמצאת.
    2. להפעיל את מסנן גלגל בקר בקר הבמה אוטומטיות, לממשק מחשב-מיקרוסקופ, מצלמה.
    3. להפעיל את הלייזר FRAP, לייזר בקרי עמדה.
      התראה: לייזר רב עוצמה יכול להזיק לעיניים אם ישירות הציג. מומלץ להגדיר למערכת מיקרוסקופ לחסום לייזר עירור של מנת החלקים העין, אשר יכול להתבצע על ידי הזזת מראה לתוך נתיב קרן FRAP במהלך הלבנת כדי לשקף את הלייזר לכיוון המדגם וכדי למנוע שידור אל העינית.
    4. הפעל את המחשב והתוכנה שליטה מיקרוסקופ פתוח.
    5. אפשר 15 דקות כדי להפוך את קשת מנורת לייזר FRAP להתחמם.
  2. כיילו את הלייזר FRAP.
    1. פתח את החלון תצורה של לייזר. להגדיר הגדרה תאורה (במהלך פעימה) ההגדרות המתאימות FRAP תאורה לייזר חשיפה המדגם. הגדר הגדרת תאורה (במהלך דימות) בהגדרות תאורה המתאימות הדמיה רק את fluorophore מקבל.
    2. בחר את המטרה כדי לכייל תחת הגדרת מערכת צירים. נקודות באופן ידני לחץ על כיול נקה ובחר להציג תמונות במהלך הכיול.
    3. הגדר את זמן להתעכב 10,000 µs ואת מספר פולסים עד 100.
    4. המקום השקופית כיול, גרם של אתידיום ברומיד חתום בין זכוכית coverslip, לתוך מתאם הבמה עם הצד coverslip למטה.
      התראה: אתידיום ברומיד מוטגן, צריך להיות מטופל באמצעות כפפות. אם השקופית נמצא בסיכון, תשליך בהתאם להנחיות של המוסד.
    5. השתמש בהגדרות תאורה מקבל למקד פני השטח של השקופית, פוררו מטוס מוקד עם האות המבריקים. פגמים קטנים הציפוי יהיה גלוי כדי לסייע התמקדות.
    6. להעביר את השקופית לאזור עם פלורסצנטיות אחיד על פני המטוס הדמיה.
    7. לחץ על יצירת הגדרה. התוכנה לאתחל את תהליך הכיול, הלבנת באופן אוטומטי מזהה את המיקום של הנקודה מולבן.
    8. ודא כיול מוצלחת על-ידי הערכת התמונה הסופית, אשר יהיה ברשת 3 x 3 נקודות מולבן צריך להיות מופץ באופן שווה, בפוקוס. לשמור את התמונה כיול לשימוש עתידי.
    9. הסר את השקופית כיול, לאחסן בביטחה. כיול צריכה להתבצע לפני תחילת ניסוי אבל אינו צריך להתבצע בין הדגימות.

3. בחרו את הפרמטרים עבור הדמיה סריג

  1. תיקון אחד של הדגימות שנוצר של התאים לבטא את חיישן המתח עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות Paraformaldehyde פתרון צריך להיות מתנול חינם, המכונה לעתים קרובות EM-כיתה, כדי למנוע denaturing של חלבונים פלורסנט. מקום PBS לאחר קיבוע.
    התראה: פתרונות Paraformaldehyde רעילים. שלב זה צריך להתבצע בשכונה fume, הפתרון צריך להיות מסולק בהתאם למדיניות מוסדיים.
    הערה: מיטוב זה אינו תלוי ב- dynamics חלבון ומאפשרת מדגם קבוע עבור משך הזמן המרבי הדמיה מבלי לדאוג לגבי בריאות.
  2. לשטוף את הדגימה שלוש פעמים עם PBS ולהשאיר ב- PBS.
    הערה: השימוש במדיה הרכבה הכי זמין מסחרית ישפיעו על מאפייני fluorophore, ביצוע המדגם אינו מתאים עבור סריג הדמיה54. באופן אידיאלי, תאי ידומה מיד, אבל אפשר להשאיר למשך הלילה ב 4 º C. זמני ההמתנה ארוכים יותר תגרום להידרדרות של המדגם.
  3. למקם את הדגימה בעל שלב מיקרוסקופ עבור הדמיה.
  4. פתח את הכלי Multi-Dimensional רכישה (מד א). ביסוס של הדמיה רציפים של שלושה ערוצים: מקבל עירור היחידה, פליטה (ערוץ מקבל), תורם עירור, מקבל פליטה (ערוץ קשת/קשתית), ואת עירור היחיד התורם פליטה (ערוץ התורם).
    הערה: ישנם מגוון דרכים סריג דגימות. השיטה שלושה ערוצים או "שלוש-קוביה" של הדמיה לזווג עם אמצעי כיול המערכת כדי למדוד את יעילות סריג מומלצת מתח מבוסס סריג-חיישנים-55,-56. גישה זו הוא מהיר, פשוט, גמישה, דורש רק פלורסצנטיות סטנדרטי הדמיה במיקרוסקופ, ומאפשרת ההשוואה של ניסויים על פני ימים שונים והתקנות הדמיה.
  5. סרוק את הדגימה באמצעות מועד החשיפה של 500 ms ומסנן דחיסות נייטרלית (ND) של 10%. למצוא תא לבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברור והמבנה של האינטרס.
  6. בחר את זמן החשיפה של 500 ms או לאורך הרצוי לכל ערוץ הדמיה של מסנן ND של 100% ולרכוש רצף תמונות סריג.
  7. להעריך את העוצמה הממוצעת של החיישן ב המבנים subcellular עניין בכל אחד מהערוצים ההדמיה. אותות נמוך עלול להוביל תוצאות לא מדויקות עקב תיקון לקוי הערכות, ללא linearities-גלאים, או תרומה משמעותית של רקע אותות. הדרישה היא שזמן משוער לכוון עוצמות מעל 10% של הטווח הדינמי של המצלמה (כלומר., עבור מצלמה 16 סיביות, עוצמות צריך להיות מעל 6,000).
    הערה: הגדרות אופטי זהים (פעמים חשיפה, מסננים, מטרות, ומשתנים אחרים כגון מצלמה רווח או binning) יש להשתמש עבור כל הניסויים סריג זה תיערך השוואה. לשנות כל אחת מהגדרות אלה להוביל שינוי הסכום סריג הוא או שנוצר ו/או זוהה בקביעת מיקרוסקופ. מדידות יעילות סריג אינם תלויים אלה הגדרת, אך הגורמים כיול לקביעת יעילות סריג אינם. בתיאוריה, סטים שונים של גורמי הכיול יכול לשמש כדי ליצור סריג היעילות מתוך הגדרות אופטי שונות, אבל לא מומלץ. הלבנת או phototoxicity יכול להיות שונה בין ההגדרות השונות, יצירת תוצאות כדין.
  8. רוכשים את רצף תמונות סריג השני של שדה הראייה באותה. מעריכים photobleaching בין מסגרות על-ידי השוואת בעוצמה ממוצעת של החיישן בכל אחד מהערוצים ההדמיה. Photobleaching יש לשמור עד למינימום, רצוי פחות מ- 1-5% לאבדן קשר.
  9. כוונן את הפרמטרים הדמיה כדי להגדיל את העוצמה תוך מזעור photobleaching. עבור התאמות גס, לשנות את המסנן ND בשימוש בזמן הרכישה. עבור התאמות עדינה יותר, לשנות את זמן החשיפה בשלבים של 250 ms.
  10. חזור על שלבים 3.5-3.8 עד אות מספקת יכולה להיות מושגת תוך מזעור photobleaching.
    הערה: בדרך כלל, הגדרות עבור חיישן מתח vinculin MEFs vinculin- / - הן 1,500 ms, 1,500 ms ו- ms 1000 עבור הערוצים התורם, סריג, מקבל בהתאמה. הערכים האופטימלי משתנה עם הסוג של מערכת תאורה, אובייקטיבי, מערכות סינון ורמת ביטוי חיישן.

4. בחר פרמטרים עבור FRAP הדמיה

  1. למטב את הגדרות לייזר כדי להבטיח הלבנת מלאה של האזור עניין (ROI) ללא הלבנה האזור שמסביב או גרימת נזקי.
    1. תקן אחת הדגימות שנוצר של התאים לבטא את חיישן המתח עם 4% paraformaldehyde למשך 10 דקות.
      הערה: מיטוב זה אינו תלוי ב- dynamics חלבון ומאפשרת מדגם קבוע עבור משך הזמן המרבי הדמיה מבלי לדאוג לגבי בריאות. זה יהיה גם למנוע את ההתאוששות של הלבנה על ידי חלבונים נייד, המאפשר ניתוקה של ההשפעה של הלבנה, הימנעות תופעות התאוששות מהירה, בתיווך דיפוזיה פלורסצנטיות המתרחשים בין השכיחות של הלבנת ולקחת התמונה הראשונה שלאחר אקונומיקה.
      התראה: פתרונות Paraformaldehyde רעילים. שלב זה צריך להתבצע בשכונה fume, הפתרון צריך להיות מסולק בהתאם למדיניות מוסדיים.
    2. לשטוף את הדגימה 3 פעמים עם PBS ולהשאיר ב- PBS.
      הערה: השימוש ביותר הזמינים בשוק התקשורת הרכבה תשפיע על מאפייני fluorophore, ביצוע המדגם אינו מתאים עבור FRAP הדמיה54. באופן אידיאלי, תאי ידומה מיד, אבל אפשר להשאיר למשך הלילה ב 4 º C. זמני ההמתנה ארוכים יותר תגרום להידרדרות של המדגם.
    3. למקם את הדגימה בעל שלב מיקרוסקופ עבור הדמיה.
    4. פתח את החלון תצורה של לייזר. להתחיל עם הגדרת זמן להתעכב לייזר של 1,000 µs וקטניות 10, כלומר כל במקום לסרוק את פני רועי יקבל 10,000 µs של לייזר בצריכת חשמל מלאה
      הערה: 500 mW, 515 ננומטר לייזר שימש הלבנה. זה נבחר כדי להלבין באופן סלקטיבי ונוס A206K, מקבל חיישן המתח vinculin, עם יעילות מירבית. אם המתח מבוסס סריג חיישנים עם חלבונים פלורסנט אחרים משמשים, סוג אחר של לייזר ייתכן שתצטרך להיות מועסק.
    5. למצוא תא לבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברור והמבנה של האינטרס ולרכוש תמונה.
    6. צייר של רועי מלבני חלוקה לרמות את האזור אקונומיקה ולאחסן את המיקום רועי. הדופק הלייזר. צלם תמונה אחרת של המדגם.
      הערה: גודל התיבה צריכה להיות בערך בגודל של הפא כולו. להקפיד כי לגודל התיבה אינה משתנה באופן קיצוני לאורך ניסויים. האזור מולבן חייב לפקח בקפידה בחלבונים dynamics אשר מושפעים דיפוזיה. זהו חשש פוטנציאלי חלבונים transmembrane, כגון cadherins47, או חלבונים להתפזר אט-אט27,57.
    7. בדוק את האיכות של photobleaching על-ידי בדיקה כי רועי כולו הוא מולבן כך עוצמת נמצא ליד רמות הרקע. בנוסף, כדי לוודא שאין שום הלבנת מחוץ רועי.
    8. התאם את הגדרות לייזר כנדרש על מנת להשיג כמות משמעותית של הלבנת בתוך רועי ללא גרימת הלבנת משמעותי מחוץ רועי. עבור התאמות גס, לגדל, להפחית את הזמן להתעכב בשלבים של 100 µs, וגם עבור כוונון עדין, מעלים ומורידים את מספר פולסים צעדים של 5 פולסים.
    9. חזור על שלבים 4.1.5 – 4.1.8 עד שהגיע הקביעות המזעריות שבה ההחזר הוא מולבן באופן מלא ללא הנחה-יעד photobleaching.
      הערה: השגת ערך הלבנת הראשונית ניכר ללא גרימת phototoxicity הוא היבט מרכזי של FRAP ניתוח. השתמש בהגדרות לייזר כי התוצאה מלבין מלאה הדגימות קבוע. באופן כללי, מספר מינימלי של פוטונים אמור לשמש להשגת רמת הלבנת הרצוי. בנוסף, פרוטוקול הלבנה יש לשמור יחסית עקבית במהלך הניסויים, כמו שינויים יכול להשפיע על מדידות של חלבון dynamics58.
  2. למטב את זמן לשגות פרמטרים ללכוד באופן מלא את הדינמיקה של החלבון עניין תוך מזעור photobleaching.
    1. להכין את הסידור מיקרוסקופ הדמיה תא חי, רצוי עם שלב מחוממת, אובייקטיבי, כמו גם בקרת2 CO. מאפשרים equilibrate למשך 20 דקות.
      הערה: כדי לשמור על הבריאות של התאים הדמיה, טמפרטורה, pH חייבת להישמר כלי הדמיה. מגוון של שלבים מחוממת, מחממי אובייקטיבי יכול בקלות לשמור על הטמפרטורה בתא ב 37 º C. השליטה של pH עבור סוגי מדיה רבים יכול להתבצע על ידי השימוש של משאבת סחרור אל מעבר humidified 5% CO2 על המדגם-15 מ"ל לדקה לחלופין, אם CO2 שליטה אינה זמינה, בשידור חי הדמיה המדיה המכילה HEPES צריך להתרגל למנוע שינויים גדולים pH.
    2. מקום אחד של הדגימות שנוצר של התאים לבטא את חיישן המתח לתוך בעל שלב מיקרוסקופ עבור הדמיה. מאפשרים equilibrate למשך 10 דקות.
    3. באמצעות הכלי מד א, להגדיר את זמן לשגות לרכוש 3-5 תמונות מראש מלבין, אקונומיקה רועי, ולהמשיך לקיחת תמונות 10-60.
      הערה: עבור vinculin-אופנה, הדמיה כל 5 s עבור אקונומיקה אחרי 5 דקות מספיקה לבחון את הדינמיקה ללא היכרות עם הלבנת מופרז31. 59,6048,47,בספרות ניתן למצוא נקודות המוצא שימושי עבור שיעור הדמיה ומשך הרבה חלבונים אחרים.
    4. השתמש מקבל הדמיה הגדרות למזער את החשיפה של המדגם אור, תוך שמירה על יחס אות לרעש מספיקות, לשיקוף המבנה של ריבית. נקודת התחלה טובה היא מחצית ND פילטר וחשיפה הזמן הדרוש עבור הדמיה של מקבל במהלך סריג.
    5. למצוא תא לבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברור והמבנה של האינטרס, לצלם תמונה.
    6. צייר של רועי מלבני כדי לסמן היכן אקונומיקה ולאחסן את המיקום ROI. ליזום מואץ.
    7. בחן את קבוצת תמונות עבור בעיות פוטנציאליות וכתוצאה מכך.
      1. אם ניכר קפיצות (גדול מ 10% בעוצמה הראשונית) בהתאוששות זריחה בין מסגרות, להפחית את הזמן-צעד בין מסגרות.
      2. אם יש לאובדן גלובלי משמעותי של קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן (גדול מ- 5-10% בעוצמה הראשוני), להפחית את מספר התמונות שצולמו אקונומיקה שלאחר ו/או לשנות את הגדרות הדמיה כדי לצמצם את החשיפה של המדגם להדליק.
      3. אם השחזור זריחה ךתומדק לא בסוף מואץ, להגדיל את האורך הכולל של מואץ.
    8. כוונן את הפרמטרים זמן לשגות בהתאם, חזור על שלבים 4.2.5 – 4.2.7 עד ההחלמה פלורסצנטיות שלמאחה נלכד ללא צילום-נזק כללי המדגם.

5. רכישת נתונים FRAP סריג

  1. להכין את הסידור מיקרוסקופ הדמיה תא חי, רצוי עם שלב מחוממת, אובייקטיבי, כמו גם בקרת2 CO. מאפשרים equilibrate למשך 20 דקות.
    1. כדי להבטיח את בריאותם של תאי הדמיה, לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס בתא הדמיה. שימוש משאבה סחרור לעבור humidified 5% CO2 על המדגם-15 mL/min כדי לשמור על רמת ה-pH.
    2. לחלופין, אם CO2 שליטה אינה זמינה, השתמש מדיה חיה הדמיה המכיל HEPES כדי למנוע שינויים גדולים pH.
  2. פתח את הכלי מד א ולהגדיר עם סריג הדמיה פרמטרים, כולל ערכות סינון שונות.
  3. לשמור את מד א לתיקיה ניסיוני עם השם של MDA_FRET_Date.
  4. להגדיר את מד א אחר עם FRAP הדמיה פרמטרים, כולל מערכות סינון שונות של ההגדרות זמן לשגות, כתב העת פולס הלייזר לאחר רכישה מראש אקונומיקה.
  5. לשמור את מד א לתיקיה ניסיוני עם השם של MDA_FRAP_Date. סגור את החלון מד א.
  6. בסרגל הכלים ' בחלק העליון של המסך, בחר יומן | התחל הקלטה.
  7. פתח את החלון מד א, לטעון את המדינה MDA_FRET_Date ולחץ על רכוש. לאחר מכן לטעון את המדינה MDA_FRAP_Date ולחץ על רכוש.
  8. בסוף שנת הרכישה, בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך, בחר יומן | הפסק הקלטה.
  9. לשמור יומן זה לתיקיה ניסיוני עם השם של FRETFRAP_Date והוסף אותו לסרגל כלים לגישה נוחה. סגור את החלון מד א.
  10. מקום אחד של הדגימות שנוצר של התאים לבטא את חיישן המתח לתוך המחזיק מיקרוסקופ עבור הדמיה. מאפשרים equilibrate למשך 10 דקות.
  11. לנווט את הדגימה באמצעות רכישת התמונה תחת ידרשו | לרכוש עם חשיפה מינימלית ND וזמן לסנן כדי לזהות את התאים של עניין.
  12. להגדיר מיקוד אוטומטי מתמשך על-ידי ניווט אל מכשירים | מיקוד. באופן ידני מתמקדים הדגימה עד שהגיע המטוס הדמיה הנכון.
  13. לחץ על הגדר פוקוס רציף, לחכות למערכת להתאים ולחץ להתחיל תוך התמקדות רציפה.
    הערה: זה אינו נדרש, אך משפר באופן משמעותי את איכות של עקומות שחזור FRAP כי היא מונעת את הדגימה נסחף out-of-להתמקד.
  14. למצוא תא לבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברור והמבנה של האינטרס, לצלם תמונה.
  15. צייר של רועי מלבני כדי לסמן היכן אקונומיקה. החנות של רועי.
  16. אתחל את היומן FRETFRAP_Date , אשר יתחיל רכישת תמונות סריג ואחריו אתחול FRAP זמן לשגות.
  17. חזור על שלבים 5.14-5.16 עד 10-15 תמונות ערכות נרכשים.
    הערה: מדידה לא ניתן לחזור באותו התא. ברגע photobleaching מתרחשת, סריג נתונים הוא לא אמין.

6. ניתוח נתונים FRAP סריג

  1. לנתח את התמונות סריג שימוש בתוכנה של בחירה.
    הערה: ישנם מספר דרכים תמונה של quantitate סריג61, כולל רציומטרי סריג62 וסריג-אינדקס-34,-35. עם זאת, מומלץ מאוד להשתמש ההערכות של סריג יעילות55,63 הפרשנות של סריג-FRAP נתונים. ראו הדיון לחקר נוספת של נושא זה. פליטה sensitized, חישוב יעילות סריג, תוכנות מותאמות אישית זמינה מהמעבדה הופמן-https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. פרמטרים רלוונטיים עבור כל מבנה subcellular זה היה קשה לכמת. זה צריך לכלול הממוצע סריג אינדקס/יעילות וממוצע הראשוני מקבל עוצמה (פרופורציונליים לריכוז) אך יכול גם לכלול פרמטרים פיזיקליים כגון גודל ROI.
  3. לנתח את התמונות FRAP שימוש בתוכנה של בחירה.
    הערה: קיימות מספר דרכים כדי quantitate FRAP26,27,28,29. דאגות ניסיוני מפתח כוללות להתווכח על הלבנת במהלך שלאחר אקונומיקה הדמיה, שינויים בעוצמה ברקע, טרנסלוקציה של מבנים subcellular דינמי מאוד, כגון הדבקויות מוקד. הלבנת תיקונים ווריאציות על רקע תאורה יכול להתבצע באמצעות הניתוח של שאינו מולבן ואזורים שאינם-פלורסנט של התמונות. מבנים subcellular דינמי מאוד, במיוחד אלה מציג יתר דינמיקה הגדילה או פירוק אינן תואמות תקן ניתוחים FRAP, לא צריך להיות מנותח. בנוסף, ישנם מגוון דרכים כדי לנרמל את הנתונים. ההנחיות שסופקו מיועדים הניתוח הפשוט ביותר.
  4. לתקן את נתוני שחזור עבור הלבנת אפקטים, ואז לנרמל מראש איפה משיגים עוצמות. לכמת המחצית של התאוששות לבין השבר נייד על פי28,המשוואה הבאה34:
    MF - (MF - Ro) e-קאפה -טאו
    איפה MF השבר ניידים, Ro ההחלמה הראשונית, k הוא קצב ההתאוששות. המחצית של ההתאוששות נקבעת על-ידי:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    הערה: ישנם מגוון רחב של חבילות תוכנה זמין לציבור להשלמת ניתוחים אלה64 , כמו גם מגוון רחב של תוספים ImageJ. תוכנות מותאמות אישית זמינה מהמעבדה הופמן-https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. ניתוחים נוספים אמור לשמש את המצבים שבהם פעפוע משפיע על הדינמיקה של החלבון של עניין, פרקי זמן מרובים הם ניכרת ההתאוששות, או תקני גיאומטריות הלבנת משמשים.

7. לפרש את הנתונים FRAP סריג

  1. לקמפל את המידע הרלוונטי עבור כל רועי כולל: שבר ניידים FRAP FRAP בחצי משרה, מקבל עוצמה, סריג אינדקס/יעילות.
    הערה: סריג אינדקס או יעילות משמש כדי לקבוע load ממוצעת על פני החלבון בתוך רועי. מקבל עוצמה מודד את הריכוז המקומי של החלבון. חצי זמן ההחלמה הוא מדד של חלבון דינמיקה. חצי-זמן קטן יותר מציין תחלופה מהירה יותר. שבר ניידים FRAP מודדת את כמות החלבונים בתוך רועי כי הוא פונה באופן פעיל מעל. שבר נייד גדול מציין כי אחוז גדול יותר של החלבון בתוך רועי הוא מתהפך.
  2. כדי לחקור את השפעת הריכוז המקומי על קצב תחלופת חלבון וכמות, מגרש FRAP בחצי משרה, ניידים שבר כנגד עוצמת מקבל הראשונית.
  3. כדי לחקור את ההשפעה של עומס חלבון על קצב תחלופת חלבון וכמות, מגרש שבר בחצי משרה, ניידים FRAP נגד סריג אינדקס/יעילות.
    הערה: בהתאם חלבון או מבנה, גם ייתכן מעניין לבחון את ההשפעות של פרמטרים פיזיים, כגון גודל המבנה או אקסצנטריות, על עומס חלבון או מחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סריג-FRAP מורכב של השילוב של שתי טכניקות פלורסנט, דאגה, FRAP. כפי התמקדנו השפעת עומס חלבון, השתמשנו מתח מבוסס סריג חיישנים34,46. חיישנים אלה מבוססים בדרך כלל על מתח חישה מודול בהיקף של שני חלבונים פלורסנט, כגון mTFP1 ו- VenusA206K, המחוברים באמצעות מקשר (linker) flagelliform (איור 1 א'). כאשר המודול ממוקמת בין ראש ולא זנב של חלבון, זה אפשר למדוד את העומס המופעל על פני החלבון. בעת ניתוח הנתונים סריג, מתמונות שצולמו בערוץ מקבל משמשים כדי להעריך לוקליזציה חיישן המתח, ריכוז, כמו האות הזה היא עצמאית של קשת/קשתית (איור 1B). לאחר חישוב יעילות סריג, עומס חלבון ניתן לאבחן בסולם ערכי צבע מוחלטים שבו לירידה סריג יעילות לכיוון הצבעים קריר יותר מצביע על עלייה עומס חלבון, סריג יעילות בטווח האדום להצביע על עומס חלבון נמוכה ( איור 1B). הדמיה FRAP מבוצע באמצעות לייזר כדי להלבין את fluorophore מקבל בתוך מבנה subcellular יחיד ושחזור צג לאורך זמן (איור 1C). העקומה המתקבלת FRAP מנורמל ניתן לנתח לחלץ פרמטרים המתארת את הדינמיקה חלבון, כולל המחצית של השחזור, שבר ניידים (איור 1D). כי סריג ו- FRAP ניתוחים בוצעו באותו התא, ניתן להתוות את עומס חלבון ממוצעת ובניית מבנה subcellular בתור נקודה אחת. הדמיה בתאים מרובים התשואות נקודות מרובות, המגמה המסתמנת ניתן לציין האם יש חלבון גרם אולי לפגיעה ביציבות (איור 1E) או מיוצב על ידי עומס מולקולרית (איור 1F).

חיישן המתח vinculin (VinTS) stably שבאה לידי ביטוי vinculin null MEFs בבירור. רגישה כדי FAs הפזורים ברחבי התא, כפי שנראה על ידי הסתכלות על התמונה ערוץ מקבל (איור 2 א). התמונה ערוץ מקבל משמש ליצירת מסיכה פילוח המזהה כל פא בודדים עם מזהה ייחודי, המיועד ויזואלית על ידי צבעים שונים (איור 2B). האלגוריתם פילוח המבוסס על שיטת "מים" ומתייג את FAs כ הסדר של בהירות, כפי שתואר לעיל34,65. פילוח התוצאות מומרים מסכה בינארי ואז החלה על התוצאות היעילות קשת/קשתית (איור 2C), יעילות סריג הממוצע בתוך כל פא ייחודי מחושב (איור דו-ממדי). מאפיינים נוספים ניתן לחשב עבור כל הפא באופן דומה, כולל מקבל ממוצע עוצמת, גודל, אקסצנטריות ומיקום בתוך התא. בדרך זו, לפי הפא נבחר עבור FRAP ל'אור את המזהה הייחודי של הפא ואת המאפיינים המשויכים.

FRAP הדמיה וניתוח רגיש מספר גורמים שניתן לשלוט בהם, כולל לייזר והדמיה פרמטרים, ולאחר כמה גורמים שאינם נשלטים, כגון כללי הפא יציבות26,27,28, 29. לדוגמה, יותר מדי חשיפה לאור במהלך ההדמיה בצילום מואץ יכול להוביל הנושאים העיקריים לפרש FRAP נתונים. למרות הניתוח של שליטה FAs זה היו לא מולבן יכול לשמש כדי לנרמל עבור קטין photobleaching לאורך זמן, עם יותר מדי חשיפה של המדגם לאור, העקומה המתקבלת FRAP מראה של ההחלמה הראשונית ואחריהם לטבול בעוצמתם מנורמל זה לא יכול להיות מדויק מתאים של פונקציה מעריכית. אם אפקט זה הוא ציין בעקביות הנתונים, יש צורך מחדש לייעל את הפרמטרים הדמיה או להקטין את זמן החשיפה, להגדיל את הזמן-צעד בין מסגרות הדמיה או להקטין את משך מואץ כדי להפחית את החשיפה של המדגם לאור.

דוגמה נוספת של הנתונים FRAP uninterpretable, הוא כאשר הפא, זה היה photobleached translocates במהירות במהלך השחזור28. מקרה נציג של טרנסלוקציה מופרז מוצג באיור3. התמונה הראשונית, איפה ROIs נבחרו, לא נותן אינדיקציה של הפא יציבות (איור 3 א). ניטור הפא מולבן לאורך זמן, זה עובר במהירות מן המיקום ההתחלתי ולא מעקב אוטומטי מסוגלת לעקוב באופן מיידי בשל האות פלורסנט נמוך בעקבות photobleaching (איור 3 א). העקומה המתקבלת FRAP מציגה את השלב הראשוני של התאוששות קלה עם קפיצה כאשר הוא התאושש מספיק עבור התוכנה לזהות את הפא ולעבור רועי (איור 3B). עקום זה לא יכול להיות בכושר בהצלחה על ידי פונקציה מעריכית. רוברטסונית מהירה של הפא גם מרמז כי המבנה הפא הוא לא יציב. לפיכך, FAs יציב לא ייכללו בגליון הניתוח סריג-FRAP אותו מהר ככל האפשר יציבה, בשל בעיות טכניות והן ביולוגי.

עם סריג משביע רצון ונתוני FRAP, השלב הבא הוא משלים הניתוח סריג-FRAP על-ידי הערכת בו-זמנית עומס חלבון ואת הדינמיקה. איור 4A מראה יעילות סריג המפות של vinculin שלושה null MEFs stably לבטא VinTS. FAs המתוארים בלבן נבחרו לניתוח FRAP, עוצמות מקבל מוצגים לאורך זמן. FAs שלושה אלה יש vinculin תחת כמויות שונות של לטעון ולהציג פרופיל שחזור vinculin שונים. לכימות מאפיינים אלה על-ידי חישוב המחצית של התאוששות התוויית נגד היעילות סריג הממוצע כל פא מדגים את המגמה הכללית של vinculin ייצוב על ידי עומס מוגבר (איור 4B). עם זאת, השבר ניידים לעומת יעילות סריג מראה אין מגמה, רומז שבר הנייד הזה לא מוסדר על ידי עומס מולקולרית (איור 4C). היכרות עם מוטציה לתוך VinTS-חומצת אמינו 50 (A50I) הוכח כדי למנוע vinculin מחייב שותף איגוד מרכזי בתוך FAs, talin66. משינוי של אינטראקציית חלבון זה משפיע על דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים vinculin. Vinculin MEFs null stably לבטא VinTS A50I יש תאים שונים, מורפולוגיות פא, vinculin שונים טעינת פרופילים, ואת הדינמיקה vinculin שונים (איור 4D). אוכפי החוק או לכימות החצי-פעמים של שחזור ופעולות התייעלות סריג מראה כי כאשר האינטראקציה vinculin-talin מופר, vinculin ב FAs הוא גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי עומס מוגבר (איור 4E) בזמן שבר ניידים מראה אין מגמת (איור 4F ).

Figure 1
איור 1: עקרונות הטכניקה סריג-FRAP. (א) מפרטים טכניים של המודול חיישן מתח מבוסס סריג (TSMod) מוכנס לתוך חלבון עניין ואת השפעת המתח על האות סריג. (ב) כדי לכמת סריג באמצעות פליטת sensitized, תמונות נלקחים לכידת התורם אות (לא מוצג), מקבל אות של האות סריג. עם תיקונים מתאימים, התמונה סריג ניתן להקצות סולם ערכי צבע מוחלטים כדי להמחיש כמה מתח מוחל החיישן. (ג) FRAP מתנהל באמצעות האות מקבל, אשר הוא ביחס ישר לריכוז. (ד) ניתוח ההדמיה FRAP מייצרת עקומות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן יכול להיות מתאים באמצעות מודלים מתמטיים לקביעת חלבון דינמיקה. (E, F) כאשר סריג FRAP משולבים, ניתן למדוד כוח ובניית פא יחיד. מדידת FAs מרובים בתאים מרובים התשואות יחסים בין עומס חלבון חלבון מחזור. ניתוח זה, קשר שיש התואם עומס מוגבר עם תחלופה מוגברת נחשבת מדינה גרם כוח אולי לפגיעה ביציבות (E). ניתוח זה, יחסים שבהם עומס מוגבר בקורלציה עם הקטנת תחלופת נחשבת מדינה כוח מיוצב (נ). דמות זו שונתה מ. רוטנברג ואח 37. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: פא זיהוי וניתוח סריג- (א) vinculin null MEF לבטא את VinTS דמיינו בערוץ מקבל, שבו עוצמת מציין הריכוז המקומי של vinculin. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. (B) FAs הם מחולקים בהתבסס על הערוץ מקבל ליצירת מסיכה פא מזהה איפה הפא כל מוקצה מזהה ייחודי, כמוצג כאן בצבעים שונים, כ לפי סדר בהירות. (ג) מסכת פא מזהה להמיר מסיכה בינארי ומוחלים על התמונה יעילות סריג כדי להציג את ערכי יעילות סריג רק ב FAs. (ד) יעילות סריג בתוך הפא כל הוא בממוצע כדי להשיג ערך יחיד עבור כל פא, אשר מזוהה עם המזהה פא בטבלת נתוני הפלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוגמה של פא translocating. (א) vinculin null MEF לבטא את החיישן מוטציה VinTS A50I הוא מדמיין בערוץ מקבל, עם טבלת הצבע הפוכה על בהירות. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. הפא המתוארים שחור נבחר הלבנה. תמונות תקריב בהצג את הפא התקדמות לאורך זמן עם המתאר אדום המציין היכן התוכנה זיהתה את הפא. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B) העקומה המתקבלת FRAP מנורמל מנתונים ב- (א). יש כ 5% קפיצה בעקבות עוצמת הצבע 3 הנובע הפא translocating מהר לפני התאוששות מספקת את התוכנה לזהות את השינוי במיקום פא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג סריג-FRAP תוצאות. (א) Vinculin MEFs null לבטא את VinTS מוצגים כתמונות יעילות סריג הממוצע של התא כולו (סולם בר = 30 מיקרומטר) עם שהתצוגה בהפוכה מקבל הערוץ תמונות מראה התקדמות השחזור FRAP (סולם בר = 2 מיקרומטר). (B) FRAP בחצי משרה של התאוששות להתוות נגד סריג יעילות עבור תאים 32, עם נקודות המייצגות תאים (א) באדום. (ג) FRAP שבר ניידים לעומת סריג יעילות עבור התאים אותו ב (B). (ד) Vinculin MEFs null לבטא את החיישן מוטציה VinTS A50I מוצגים כתמונות יעילות סריג הממוצע של התא כולו (סולם בר = 30 מיקרומטר) עם שהתצוגה בהפוכה מקבל הערוץ תמונות מראה התקדמות השחזור FRAP (סולם בר = 2 מיקרומטר). (ה) FRAP בחצי משרה של התאוששות להתוות נגד סריג יעילות עבור תאים 21, עם נקודות המייצגות תאים (D) באדום. (ו) FRAP שבר ניידים לעומת סריג יעילות עבור התאים אותו ב- (E). הנתונים פורסמו במקור רוטנברג. et al. 37 . והם דמיינו כאן בתבנית חדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה סריג-FRAP מאפשרת מדידה ישירה של חלבון רגישים ל"כוח הפזורים דינמיקה, מאפיין זה היה קשה לחקור ישירות בתוך תאים חיים. הרגישות של חלבון דינמיקה מולקולרית לטעון חיוני לתפקוד החלבון כוח המשדר או מתמר. טעינת נדרש עבור השידור של שניהם שנוצר באופן פנימי, שהוחל מבחוץ כוחות, נקרא mechanotransmission, וזה עבור ההמרה של אותם כוחות לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, שנקרא mechanotransduction. אולם, השינוי בעומס יכול להשפיע על משך הזמן שחלבון נשאר כבול, לכן, פחות זמן חלבון מבלה ברינג טען, פוחתים הסיכויים שהכוח צריך להיות מועבר לחלבונים אחרים או transduced לתוך אות נסתרים מבחינה ביוכימית, חש. השיטה סריג-FRAP מגשרת על הפער בין רמת הסלולר המולקולריים בכך שהוא מאפשר מולקולרית בקנה מידה מדידות של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים ושיטותיה בתוך הקשר רחב יותר הסלולר. יתר על כן, היא מאפשרת מדידות אלה להילקח תוך כדי perturbing על הסביבה תאיים או חוץ-תאית מבחינה ביוכימית או מכנית. טכניקה זו צריכה להיות החלים על כל חיישן מתח מבוסס סריג, המאפשר חקירת מצב מכאני חלבון במגוון מבנים subcellular, בהקשרים חוץ-תאית.

שלבים קריטיים בביטוח שמושגות המדידות סריג-FRAP הרצוי כרוך אופטימיזציה של הפרמטרים הדמיה וביצוע ניתוח נתונים ופרשנות. אופטימיזציה של הפרמטרים הדמיה, כפי שמתואר בתוך הפרוטוקול, יש צורך להגביל את נזקי לדגימת, תוך מתן אפשרות של מבנים הרצוי ואת הדינמיקה להיות מכובד ועל עוצמת אות מספיק עבור החישוב של סריג. הקמת פרמטרים אלה הדמיה עבור קו לתא מסוים וחלבון עניין מוקדם יקל על השוואה ישירה בין קבוצות שונות ניסיוני. ראוי לציין כי שינויים במערכת, כגון מוטציה החלבון עניין או היכרות עם מעכבי, יכול להוביל לשינויים לוקליזציה חלבון (ובכך משנים את עוצמת האות) ואת הדינמיקה. הפרמטרים ממוטבת צריך לאפשר מדידות ברורה, מדויקת על פני כל התנאים ניסיוני. לכן, מומלץ לבחור את הפרמטרים הם לא בקצה הקיצוני של להיות שימושי, לדוגמה, להיות מסוגל להבחין בקושי אות מרעש.

בזמן ההדמיה ב פרוטוקול זה שתואר עבור מיקרוסקופ epifluorescence וגם מחובר מודול לייזר FRAP, סריג-FRAP ישימה על מערכות הדמיה אחרות. לדוגמה, טכניקה זו ניתן להתאים מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת קו, כמו גם מיקרוסקופ קונפוקלי ספינינג-דיסק עם מודול של photobleaching המצורף. הדמיה הגדרות צריך להיות מותאם באופן מקביל להשגת נאותה אות לרעש ללא גרימת נזקי או photobleaching יתר. במיוחד בנוגע סריג הדמיה, גלאי יעילות גבוהה קוונטית נדרשים לקבל אות מספיק לחישוב סריג מוצלח ללא גרימת נזק fluorophore. ישנם מספר פרסומים המתארת הדמיה סריג או FRAP נפרד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי67,68,69, אשר יכול לשמש כדי להנחות אופטימיזציה עבור סריג-FRAP הדמיה.

בעקבות הניסוי, ניתוח נתונים צריכים להיות מטופלים בקפידה וביצע בצורה לשחזור, רצוי אוטומטיות. בשל חוסר היכולת להלבין יותר מ 2-3 אזורים subcellular בתא יחיד לפני הלבנת מדי של מאגר זמין של חלבון, התפוקה של טכניקה זו היא מוגבלת יחסית. לפיכך, ערכות נתונים משולבים לעתים קרובות על-פני ימים מרובים של הדמיה, הדורשים טיפול עקבי של נתונים. סריג והן FRAP מציעים אתגרים עם ניתוח נתונים. סריג אינדקס ומדידות יעילות סריג מאפשרים כימות של עומס חלבון. סריג אינדקס הוא מדד יחסי זה תלויה מאוד הגדרות מיקרוסקופ, ואילו מדידות יעילות סריג מוחלטת ובלתי תלוי מיקרוסקופ-הגדרות-55,-70. לאחרונה הראינו כי שיטה שפותחה בעבר באמצעות הדמיה "שלוש-קוביה" יכול לשמש כדי לקבוע יעילות סריג מן המידות של פליטת sensitized כי הם בדרך כלל לכמתו סריג אינדקס כאשר באמצעות חיישנים מתח מבוסס סריג56 . המידות של סריג יעילות נדרשים אם המדידות של החוויה כוחות מוחלטת על ידי חיישנים המתח להיות מחושב34. בתאים המבטאים מתח מבוסס סריג חיישנים, תאים יציב במיוחד על מספרים גבוהים מעבר, חלל או לבזות את החיישנים, המוביל אל סריג לא שמיש נתונים50. זה מזוהה בקלות בעת חישוב יחסי התורם-כדי-מקבל במהלך החישוב תדאג יעילות37,56 אבל יכול להיות קשה יותר לזהות באמצעות אינדקס סריג. כאשר החל עם חיישן מתח מבוסס סריג, זה יכול להיות מועיל לקבל ערכת נתונים גדול (> 50 תאים) רק סריג נתונים עבור המבנה של הריבית כדי לזהות את היעילות לטווח הצפוי של סריג. בנוסף, ייתכן FRAP נתונים קשה לחלץ במבנים ניידים מאוד, כגון FAs במהירות הזזה או פירוק. בחירה של subpopulation של מבנים או במיטוב תא תנאים ציפוי לצמצם את האפקט הזה יכול לעזור כדי למזער את הבעיה.

במושג, סריג-FRAP ניתן ליישם כל חיישן מבוסס סריג בכל אזור subcellular, עם אופטימיזציה נכונה. בפועל, זה עשוי להיות קשה ללכוד רגישים ל"כוח הפזורים הדינמיקה של חלבונים שאינם תחת עומס מכני משמעותי או קבצים שיש חצי-פעמים של התאוששות על ציר הזמן קצר מאוד של כמה שניות או בציר זמן של עשרות דקות. תוצאות ממחקרים מולקולה בודדת באפשרותך להצביע על החלבונים עשויה להדגים רגישים ל"כוח הפזורים הדינמיקה בתוך תאים חיים. עד כה, כולל רבים הפא ואת AJ חלבונים13,14,15,16 , כמו גם כמה אלמנטים cytoskeletal71,72,73. הצלחתנו, חיישנים מבוסס סריג עוצבו עבור רבים של חלבונים אלה46. תוצאות אלו יכול להנחות את הבחירה של חלבון עניין; עם זאת, זה לא ניתן לצפות כי הנתונים סריג-FRAP יהיה בדיוק במראה את התוצאות ממחקרים אלה מולקולה בודדת. למעשה, תקנה הביוכימי, אינטראקציות עם חלבונים אחרים, מבנה cytoskeletal מקומיים עשויים לטשטש, או לשנות, את ההשפעות של כוחות על אינטראקציות חלבון-חלבון. היכולת להתבונן המורכבות היא כוח ייחודי של הגישה FRAP סריג.

שילוב של מניפולציות על התא, החלבון של עניין ניתן להבהיר את הגורמים חשוב בוויסות חלבון dynamics. לדוגמה, זה יכול להיות מועיל יש חיישן חסר כוח-רגישות, או באמצעות מחיקה או מוטציה של35,תחום מחייב כוח74 כמו שצריך, ללא תלות של הדינמיקות מחזור חלבון הכוח שדווחו על-ידי החיישן. בנוסף, מוטציות של אתרי קישור קריטיים או אתרי זרחון החלבון אחרות יכול לספק תמונה שלמה יותר של איך להיות מווסתות החלבון עניין. ביצוע שינויים כלליים על התא או על הסביבה דרך מעכבי cytoskeletal או על ידי שינוי מאפייני המצע (מטריצה חוץ-תאית אקס או נוקשות), בהתאמה, יכולה לעזור לקבוע איך הדינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים של החלבון להגיב לפליטת מכני. שילוב המידע על עומס חלבון, יחסי כוח רגיש עם מאפיינים אחרים ביופיזיקלי של החלבון יכול לסייע להקמת המדינה מכני של החלבון עניין. זה יכול לכלול לוקליזציה של אינטראקציות חלבון מקומיים בתוך75,מבנה subcellular76. בנוסף, החלבון יכול לשכון בארצות קונפורמציה שונה, אפילו בתוך המבנה subcellular אותו, בהתאם להקשר76,77. עומס חלבון, דינמיקה, לוקליזציה, קונפורמציה תוכל להיות בו זמנית מושפע הכוחות שנוצר באופן פנימי ולא חיצוני שהוחל37,76,78,79, מכתיב תפקידו של החלבון כוח שידור, mechanotransduction. צדדיות של השיטה סריג-FRAP ותאימות פוטנציאליים שלה עם מגוון רחב של חלבונים ומניפולציות צריך לאפשר הבהרה של האינטראקציה בין בצובר מכניקה, חלבון דינמיקה mechanosensitive איתות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על ידי פרס הקריירה קרן המדע הלאומית (ה-NSF-CMMI-14-54257) כמו גם מענקים American Heart Association (16GRNT30930019), מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM121739-01) זכה ד ר הופמן ברנטון, אזרח מדע קרן בוגרת מחקר לאגודה מוענק קת'רין רוטנברג. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של ה-NSF או NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 141 Mechanobiology mechanotransduction ביופיסיקה מתח מבוסס סריג חיישנים FRAP רגישים ל"כוח הפזורים חלבון דינמיקה
מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter