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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Abstract

Zellen spüren und reagieren auf körperliche Signale in ihrer Umgebung durch die Umwandlung der mechanischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale in einem Prozess namens Mechanotransduktion. Ein entscheidender Schritt in Mechanotransduktion ist die Übertragung der Kräfte zwischen den internen und externen Umgebungen. Kräfte zu übertragen, muss eine nachhaltige, ungebrochen körperliche Verbindung erstellt durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion mechanischer Belastung haben entweder keine Auswirkungen auf die Interaktion, zu schneller Distanzierung der Interaktion führen oder sogar stabilisieren die Interaktion. Verstehen, wie molekulare Last diktiert, dass Protein-Umsatz in lebenden Zellen wertvolle Informationen über den mechanischen Zustand eines Proteins, im Gegenzug seine Rolle bei der Mechanotransduktion Aufklärung liefern kann. Bestehende Techniken zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik fehlen direkte Messungen des Proteins Last oder verlassen Sie sich auf die Messungen außerhalb des zellulären Kontexts. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Förster Resonanz Energie Transfer-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (Bund-FRAP) Technik, ermöglicht die Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen. Diese Technik gilt möglicherweise für jeden Bund-basierte Spannung Sensor erleichtern das Studium der Kraft-Sensitive Proteindynamik in unterschiedlichsten subzellulären Strukturen und in verschiedenen Zelltypen.

Introduction

Die extrazelluläre Umgebung ist eine reiche Quelle von biochemischen und physikalischen Signale, die ihr Verhalten der Zelle bestimmen. Insbesondere kann die physische Beschaffenheit der Mikroumgebung wichtige Zellfunktionen einschließlich Zellwachstum, Migration und Differenzierung1,2,3,4vermitteln. Dysregulation der Mechanik von der Mikroumgebung ist eine kritische Komponente für viele Krankheiten, die noch nicht ausreichende Behandlungen, wie z. B. Krebs5, Atherosklerose6und Fibrose7verfügen. Ein vollständiges Verständnis der wie Zellen physikalischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale umwandeln, ein Prozess Mechanotransduktion bezeichnet, erfordert die Aufklärung der molekularen Mechanismen vermitteln Kraftübertragung, sowohl in als auch außerhalb der Zellen und in mehreren subzelluläre Strukturen.

Im Inneren der subzellulären Strukturen sind Proteine ständig umdrehen; Bindung und loslösen, basierend auf der Stärke ihrer Interaktionen mit verbindlichen Partner8. Für Kräfte erfolgreich über eine räumliche Distanz hinweg übertragen werden muss eine ununterbrochene Kette von Protein-Protein-Interaktionen, was bedeutet, dass ein Protein-Umsatz langsam genug, um aufrecht zu erhalten und Kraft zu seinen verbindlichen Partner9übertragen werden muss. Während Protein-Protein-Interaktionen in der Regel von mehreren nicht-kovalente Bindungen zwischen den Protein-Domänen bestehen, ist die Interaktion häufig als gebundenen Staat konzipiert, die in einem ungebundenen Zustand unter verschiedenen Bedingungen10, übergehen kann 11. für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion ist es möglich, dass Kraft keine Wirkung auf die Dauer der Interaktion haben, bekannt als eine "ideale Bond", reduzieren die Lebensdauer der Interaktion, bekannt als "Slip-Bond", oder erhöhen die Lebensdauer der Interaktion , bekannt als ein "Fang Bond"10. So gibt es eine komplizierte Beziehung zwischen Protein Last und Proteindynamik, die wir als Kraft-Sensitive Dynamik bezeichnen.

Zum Verständnis der Auswirkungen der Belastung auf die Anleihe Dynamik, wurden eine Reihe von hochinformativen Experimente auf der Einzelmolekül-Ebene durchgeführt. Mit isolierten Proteine oder Fragmente von Proteinen und Manipulationstechniken wie magnetische Pinzette, optische Pinzette und Rasterkraftmikroskopie, zeigten diese Studien Kraft-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen für mehrere relevante Proteine-11,-12. Beide Integrine13 und Cadherine14, die transmembranen Proteine wichtig zur Bildung Zellmatrix und Zell-Zell-Interaktionen, bzw. sind, zeigten Veränderungen in der Dynamik durch geladen. Innerhalb der Zelle Vinkulin wird auf beide Talin15 und α-Catenin16 in einer Kraft-abhängigen Weise eingestellt, und bilden eine Fang-Anleihe mit Aktin17, zeigt eine entscheidende Rolle für Vinkulin bei fokalen Adhäsionen (FAs) und Adherens Junctions (AJs ) unter Last. Einzelmolekül-Studien für die Isolierung von spezifischen Protein-Protein-Interaktionen zu ermöglichen und eindeutige Ergebnisse liefern, aber sie nicht die Komplexität der zellulären Umgebung entfallen.

Landmark Experimente zeigten, dass mehrere subzelluläre Strukturen, einschließlich FAs und AJs, Mechanosensitive und verbesserte Montage als Reaktion auf intern generierten oder äußerlicher Anwendung Lasten18,19aufweisen, 20,21,22. Darüber hinaus haben mehrere theoretische Modelle vorgeschlagen, dass Mechanosensitive Montage durch Kraft-Sensitive Protein Dynamics23,24,25gefahren werden konnte. Um diese Kraft-Sensitive Dynamiken innerhalb von lebenden Zellen zu untersuchen, wurden einige indirekte Ansätze unternommen. FRAP und verwandte Techniken bieten eine relativ einfache Methode zur Messung von Proteindynamik Zellen26,27,28,29. Jedoch wurde die Messung von Protein Last mehr beschränkt. Ein typisches Vorgehen soll Proteindynamik in Zellen mit und ohne Exposition gegenüber einem Zellskelett Inhibitor verwendet, um allgemeine Zelle Kontraktilität8,30,31zu vergleichen. Im Prinzip handelt es sich um einen Vergleich zwischen einer hohen Belastung und niedrigen Lastzustand. Allerdings gibt es keine Quantifizierung der Last über das Protein in keinem der Staaten, und möglicherweise gibt es biochemische Nebeneffekte des Inhibitors, so den Verlust von wichtigen Bindestellen entlang einer F-Aktin-Filament. Ein weiterer Ansatz, speziell für FAs, wurde zur Messung der Gesamtkraft Anstrengung auf dem Substrat durch das FA mit Traktion Rasterkraftmikroskopie um ungefähre molekulare Last und untersuchen Sie die Beziehung mit der Dynamik eines einzigen Proteins innerhalb der FA32. Während dieser Ansatz die Quantifizierung der Gesamtkraft ermöglicht, bietet es keine molekular spezifische Informationen. FAs bestehen aus mehr als 200 verschiedene Proteine, von die viele Last33tragen können. So Messausgang die Gesamtkraft von einem FA möglicherweise verdeckt die Möglichkeit, mehrere Kraft Übertragungswege und zuverlässig liefert ein Maß für die Belastung auf ein bestimmtes Protein.

Im Gegensatz zu früheren Ansätzen in Mechanobiology, das Aufkommen der Bund-basierte Spannung Sensoren ermöglicht die direkte Messung von Lasten erlebt durch bestimmte Proteine in lebenden Zellen34,35,36. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Bund-basierte Spannung Sensoren mit FRAP Maß Proteindynamik verbindet. Wir bezeichnen diese Technik als Bund FRAP. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Messung von Protein Last- und Proteindynamik, so dass die Bewertung der Kraft-Sensitive Proteindynamik in lebenden Zellen (Abbildung 1). Bereits, hat die Bund FRAP-Technik für die Untersuchung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik der mechanischen Linker Protein Vinkulin37angewendet. Spannung-Sensoren wurden für zahlreiche Proteine entwickelt, die in einer Vielzahl von subzellulären Strukturen relevant sind. Zum Beispiel sind Sensoren für Vinkulin34 und Talin38,39 in FAs, Cadherine und Catenins in AJs40,41,42, Nesprin in der nuklearen LINC Komplex entwickelt worden 43, α-Actinin44 und Filamin36 in dem Zytoskelett und MUC-1 in der Glycocalyx45, unter anderem46. In ähnlicher Weise ist FRAP eine häufig verwendete Technik auf Mechanosensitive Proteine innerhalb der fokalen Adhäsionen8,31, Adherens Junctions47Aktin Kortex26und Kern48verwendet worden ist. Voran, die Bund-FRAP Technik breit anwendbar zu sein sollte dieser vorhandenen Sensoren oder neu entwickelte Sensoren zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik in einer Vielzahl der subzellulären Strukturen und Zusammenhänge ermöglicht. Zu diesem Zweck bieten wir eine detaillierte, generalisierte Protokoll für die Umsetzung der Bund-FRAP-Technik in diese unterschiedlichen Systeme anwendbar. Hoffentlich wird dies eine Vielzahl von Experimenten, die Aufklärung der Rollen der verschiedenen Mechanosensitive Proteine bei der Regulierung der Kraftübertragung und bei der Vermittlung Zelle Verhalten ermöglichen.

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Protocol

1. erzeugen Sie Proben für die Bildgebung

  1. Stabil ausdrückliche Spannung Sensor Konstrukt in gewünschten Zelltyp.
    1. Klonen Sie Spannung Sensor Konstrukt in pRRL Vektor oder anderen viralen Expressionsplasmid.
      Hinweis: Verschiedene molecular cloning Tools stehen zu erreichen diesen Schritt, einschließlich der Verwendung von Restriktionsenzymen, überlappen, Erweiterung und Gibson Montage35. Der pRRL Vektor wird in Lenti virale Transduktion verwendet und ermöglicht ein hohes Maß an Protein-Produktion durch den Einsatz der menschlichen Cytomegalovirus (CMV) Veranstalter. Verschiedene Vektoren können für einen bestimmten Kontext erforderlich sein. Zum Beispiel ist die CMV-Promotor in einige Zelle Arten49zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus kann nur FRET-basierte Sensoren mit fluoreszierenden Proteins, dass fehlende starke Sequenzhomologie, wie mTFP1 und Venus A206K, verwendet werden, stabilen Zelllinien zu schaffen. Sensoren mit Cyan fluoreszierenden Proteins und gelb fluoreszierenden Proteins werden wahrscheinlich homologe Rekombination50.
    2. Generieren Sie Lentivirus in menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T Zellen unter Verwendung von psPax2 und pMD2.G Verpackung Plasmide mit standard Virus Produktion Methoden51.
      Achtung: Lentivirus sollte nur von entsprechend geschultem Personal in einer Laborumgebung Biosafety Level 2 gehandhabt werden.
      Hinweis: Diese Kombination aus Zellen und Verpackung Plasmide ist geeignet für den Einsatz mit pRRL. Andere Systeme sein mit anderen Vektoren erforderlich.
    3. Gewünschte Zellen mit Viren mit standard Transduktion Protokolle52 transduzieren und Durchflusszytometrie Zellen53 eine homogene Bevölkerung mit dem Ausdruck jedes Konstrukt um etwa endogenen Ebenen37Auswahl sortieren verwenden. Nach Zellenauswahl Experimente können sofort durchgeführt werden, oder Zellen tiefkalt für den späteren Gebrauch eingefroren werden können. Überschreiten Sie nicht 2 Gefrier-Tau-Zyklen für eine gegebene stabile Zelllinie.
      Hinweis: Die Verwendung von Zelllinien, die einen Mangel an Protein sein Studium (z.B.Vinkulin- / - MEFs für die Verwendung mit dem Vinkulin Spannung Sensor) erhöht das Signal-noise-Verhältnis im Bund Experimente sowie die Überexpression Artefakte zu begrenzen. Solche stabilen Mauslinien embryonalen Fibroblasten (MEF) eignet sich für ca. 15 Passagen vor erheblichen Verlust des Ausdrucks oder Verschlechterung der Sensoren ist offensichtlich. Wenn virale basierte Methoden nicht erwünscht sind, eine Fülle von kommerziellen Reagenzien gemäß Protokoll des Herstellers lässt sich vorübergehend eine Vielzahl von Zelltypen transfizieren mit Spannung Sensoren in einem entsprechenden Plasmid, z. B. pcDNA3.1. Optimalen Ausdruck werden 24-48 h nach Transfektion.
  2. Substrate für die Zelle Saat vorzubereiten.
    1. 4, 35 mm Glasboden-Gerichte zu erwerben.
    2. Arbeiten in einer Zelle-Kultur-Haube, in einem 15 mL kanonische Rohr machen Sie 4 mL 10 µg/mL Fibronektin in Phosphat gepuffert (PBS) Kochsalzlösung mit sterilen PBS in der Zelle-Kultur-Haube. Invertieren Sie sanft die Röhre einmal zu mischen und lassen die Lösung für 5 min in der Zelle-Kultur-Haube zu sitzen.
      Hinweis: Die Konzentration oder die Art des ECM-Proteins eventuell für andere Zelltypen angepasst werden. Die Voraussetzungen sind für MEFs geeignet.
    3. Pipette 1 mL der Fibronektin-Lösung auf jedem Glasboden-Gericht.
    4. Lassen Sie die Fibronektin-Lösung auf dem Geschirr für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
    5. Aspirieren der Fibronektin-Lösung, einmal Spülen mit PBS, und fügen Sie 1 mL PBS.
  3. Samen der Zellen auf vorbereiteten Untergründen.
    1. Beginnen Sie mit den Zellen des Interesses am Zusammenfluss Prozentsatz für Zellfläche in der Kulturschale 6 cm.
      Hinweis: Verschiedene Zelltypen erfordert unterschiedliche Zelle Kulturbedingungen und Zellfläche Protokolle. Dieser Abschnitt enthält Richtlinien für MEFs geeignet. In der Regel werden MEFs bis 85 % Zusammenfluss vor Zellfläche angebaut.
    2. Arbeiten innerhalb einer Zelle Kultur Kapuze, spülen Sie die Zellen einmal mit 3 mL PBS. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 5 min bei 37 ° c inkubieren
    3. 6 cm Schüssel 3 mL komplette Medien hinzu, sammeln Sie die Zellen, und legen Sie in einem 15 mL konische Rohr.
      Hinweis: Komposition für komplette Medien hängt von den Zelltyp verwendet wird. Für MEFs, komplette Medien werden oft definiert als hohe Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Antibiotikum-Antimykotikums (mit Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin) und nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) eine 1 % ige Lösung.
    4. Drehen Sie die Zellen nach unten mit 1000 X g für 5 min.
    5. Aspirieren Sie die Medien und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der komplette Medien.
    6. Fibronektin-beschichtete Glasschalen PBS herausnehmen. Zählen der Zellen und 30.000 Zellen auf jeder Fibronektin-beschichtete Glasschale mit den entsprechenden komplette Medien für ein Endvolumen von 1,5 mL Samen.
      Hinweis: Diese Zelldichte eignet sich für MEFs und führt zu einer Bevölkerung der Zellen, die nicht berühren, aber nicht äußerst spärlich. Die exakte Zellzahl kann für andere Zelltypen oder anderen bildgebenden Kammer angepasst werden müssen.
    7. Lassen Sie die Zellen, für 4 h nach Aussaat zu verbreiten. Aspirieren Sie um 2 Uhr zu verbreiten die Wachstumsmedien, und spülen Sie einmal mit bildgebenden Medien, 1,5 mL der bildgebenden Medien verlassen.
      Hinweis: Diesmal Verbreitung eignet sich für MEFs aber möglicherweise für andere Zellen geändert werden müssen. Jedoch führt Inkubationszeiten von mehr als 6-8 h, die erhebliche Ablagerung von ECM Protein von Serum in die kompletten Medien. Imaging-Medien sollte sollte die gleichen Ergänzungen als komplette Medien enthalten jedoch optisch klar und nicht enthalten Substanzen, die in bildgebenden Kanäle wie Flavinen, fluoreszieren oder Fluoreszenz, wie Phenol rot zu stillen. Eine allgemein nützlichen bildgebenden Medien sind DMEM-Gfp Live Cell Visualisierung Medien mit 10 % FBS und 1 % NEAA Lösung ergänzt. Wenn Hintergrund Autofluoreszenz unannehmbar hoch ist, kann die Menge an Serum reduziert werden. Wenn ein Medienwechsel nach der anfänglichen Beschichtung nicht möglich ist, können die Zellen direkt im Bereich der bildgebenden Medien ergänzt mit einem Trypsin-Inhibitor Nukleinsäuretablette werden.

2. richten Sie Mikroskop für die Bildgebung

  1. Schalten Sie das Mikroskop.
    1. Schalten Sie die Bogenlampe zuerst.
      Hinweis: Eine Bogenlampe veröffentlichen ein elektromagnetischen Impulses, das andere Ausrüstung, das bereits beschädigen können auf.
    2. Schalten Sie das Rad Filtersteuerung, automatisierte Bühne Controller, Mikroskop-Computer-Interface und Kamera.
    3. Schalten Sie die FRAP-Laser und laser-Positions-Controller.
      Achtung: High-Power-Laser können Augen schädlich sein, wenn direkt angezeigt. Es wird empfohlen, konfigurieren Sie das Mikroskopsystem blockieren Laseranregung aus geleitet, die Auge-Stücke, die durch Verschieben eines Spiegels in den Strahlengang FRAP während bleichen reflektieren den Laser auf die Probe und verhindern die Übertragung erreicht werden kann um das Okular.
    4. Schalten Sie den Computer und offene Mikroskop-Steuerungs-Software.
    5. 15 min für die Bogenlampe und FRAP Laser zum Aufwärmen zu ermöglichen.
  2. Kalibrieren des FRAP-Lasers.
    1. Das Laser-Konfigurationsfenster zu öffnen. Stellen Sie Beleuchtung (bei Puls) auf die entsprechenden FRAP-Beleuchtung-Einstellungen für Laserbelichtung auf die Probe. Legen Sie Beleuchtung Einstellung (während der Bildgebung) auf die Beleuchtung Einstellungen für imaging nur den Akzeptor Fluorophor geeignet.
    2. Wählen Sie das Ziel, unter Koordinatensystem Einstellungzu kalibrieren. Deaktivieren Sie die Option Manuell klicken Kalibrierungspunkte und Anzeigen von Bildern während der Kalibrierungzu überprüfen.
    3. Die Verweilzeit auf 10.000 µs und die Anzahl der Impulse bis 100 einstellen.
    4. Ort der Kalibrierungs-Dias von Interkalation Bromid versiegelt zwischen einem Objektträger und einem Deckgläschen in den Phase-Adapter mit dem Deckglas Seite nach unten.
      Achtung: Interkalation Bromid ist ein Mutagen und mit Handschuhen behandelt werden sollen. Wenn die Folie gefährdet ist, nach der Institution Richtlinien entsorgen.
    5. Verwenden Sie die Akzeptor Beleuchtung Einstellungen sich auf der Oberfläche der Folie, als der Brennebene mit dem hellsten Signal erkennbar. Kleine Fehler in der Beschichtung ist in der Fokussierung Hilfe sichtbar.
    6. Bewegen Sie den Schlitten zu einem Gebiet mit einheitlichen Fluoreszenz in der Abbildungsebene.
    7. Klicken Sie auf die Einstellung zu schaffen. Die Software wird die Kalibrierung automatisch bleich- und Erkennung der Position des gebleichten Punktes initialisieren.
    8. Erfolgreiche Kalibrierung durch das endgültige Bild, werden eine 3 x 3-Raster von gebleichtem Punkten, die gleichmäßig verteilt werden sollen und im Fokus der Beurteilung zu gewährleisten. Speichern Sie die Kalibrierung Bild zum Nachschlagen.
    9. Die Kalibrierungs-Dias zu entfernen und sicher zu verstauen. Kalibrierung vor Beginn jedes Experiment durchgeführt werden, aber nicht zwischen Proben durchgeführt werden müssen.

3. Wählen Sie Parameter für die Bund-Bildgebung

  1. Update einer der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min. Paraformaldehyd Lösung sollte Methanol frei, werden oft als EM-Klasse, um zu verhindern, Denaturierung von fluoreszierenden Proteinen. Legen Sie mit PBS-Puffer nach der Fixierung.
    Achtung: Paraformaldehyd Lösungen sind giftig. Dieser Schritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden und die Lösung sollte nach institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
    Hinweis: Diese Optimierung hängt nicht von Proteindynamik und eine feste Probe ermöglicht maximale bildgebenden Zeit ohne sich Gedanken über Zellgesundheit.
  2. Spülen Sie die Probe dreimal mit PBS und lassen in PBS.
    Hinweis: Die meisten kommerziell verfügbaren Montage Mediennutzung Fluorophor Eigenschaften wirken machen die Probe ungeeignet für Bund imaging-54. Im Idealfall die Zellen werden sofort abgebildet werden, sondern können bei 4 ° c über Nacht bleiben Längere Wartezeiten führt zu Verschlechterung der Probe.
  3. Legen Sie die Probe in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung.
  4. Öffnen Sie das Tool Multi-Dimensional Erwerb (MDA). Eine sequentielle Bildgebung der drei Kanäle zu etablieren: Akzeptor einzige Anregung und Emission (Akzeptor-Kanal), Spender Erregung und Akzeptor Emission (Bund Kanal), und Geber nur Anregung und Emission (Geber-Kanal).
    Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um Bild-FRET-Proben. Die 3-Kanal oder "drei-Cube" Methode der Bildgebung gepaart mit Mitteln der Kalibrierung des Systems zur Messung der FRET-Effizienz empfiehlt sich für Bund-basierte Spannung Sensoren55,56. Dieser Ansatz ist schnell, einfach, zerstörungsfreien und erfordert nur eine standard Fluoreszenz imaging Mikroskop ermöglicht den Vergleich von Experimenten über verschiedene Tage und imaging-Setups.
  5. Scannen Sie die Probe mit einer Belichtungszeit von 500 ms und eine neutrale Dichte (ND) Filter von 10 %. Eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse zu finden.
  6. Wählen Sie eine Belichtungszeit von 500 ms oder die gewünschte Länge für jede imaging Channel und ein ND-Filter von 100 % und erwerben Sie ein Bund Bildsequenz zu.
  7. Schätzen Sie die durchschnittliche Intensität des Sensors auf der subzellulären Strukturen von Interesse in jedem bildgebenden Kanal. Geringe Signale führen zu ungenauen Ergebnissen aufgrund unsachgemäßer Korrektur Schätzungen, Nichtlinearitäten in Detektoren oder bedeutenden Beitrag von Hintergrund-Signalen. Eine ungefähre Richtlinie für Intensitäten über 10 % von den Dynamikbereich der Kamera Ziel ist (zB., für eine 16-Bit-Kamera sollte Intensitäten über 6.000).
    Hinweis: Identische optische Einstellungen (Belichtungszeiten, Filter, Ziele und andere Variablen wie Kameraverstärkung oder binning) müssen für alle Bund-Experimente verwendet werden, die verglichen werden. Änderung dieser Einstellungen führen zu einer Änderung in der Höhe Bund, die entweder generiert und/oder in der Mikroskopie-Setup erkannt. FRET-Effizienz-Messungen sind unabhängig von dieser Einstellung, die Kalibrierfaktoren zur Bestimmung der FRET-Effizienz jedoch nicht. In der Theorie verschiedene Sätze von Kalibrierfaktoren FRET-Effizienz aus verschiedenen optischen Einstellungen generieren verwendet werden könnten, aber dies wird nicht empfohlen. Bleaching oder Phototoxizität kann zwischen den verschiedenen Einstellungen erstellen falsche Ergebnisse unterschiedlich sein.
  8. Erwerben Sie einen zweiten Bund Bildsequenz der gleichen Sichtfeld. Immunofluoreszenz zwischen Frames durch den Vergleich durchschnittlichen Intensität des Sensors in jedem bildgebenden Kanal zu schätzen. Immunofluoreszenz sollte auf ein Minimum, vorzugsweise weniger als 1-5 % Verlust des Signals gehalten werden.
  9. Passen Sie die bildgebenden Parameter um die Intensität zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz. Für grobe Einstellungen ändern des ND-Filters während der Akquisition verwendet wird. Für feinere Einstellungen ändern Sie die Belichtungszeit in Schritten von 250 ms.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3,5 – 3,8 bis ausreichende Signal erreicht werden kann, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz.
    Hinweis: In der Regel sind Einstellungen für die Vinkulin Spannung Sensor in Vinkulin- / - MEFs 1.500 ms, 1.500 ms und 1000 ms für den Spender, Bund und Akzeptor Kanal bzw.. Die optimalen Werte variiert mit der Art der Beleuchtung, Objektive, Filtersätze und Ausdruck Sensorebene.

4. Wählen Sie Parameter für die Bildgebung FRAP

  1. Optimieren Sie die Lasereinstellungen, um sicherzustellen, komplette Bleichen der Region of Interest (ROI) ohne lichtbedingten verursachen oder Bleichen der näheren Umgebung.
    1. Einer der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min zu beheben.
      Hinweis: Diese Optimierung hängt nicht von Proteindynamik und eine feste Probe ermöglicht maximale bildgebenden Zeit ohne sich Gedanken über Zellgesundheit. Dies verhindert auch die Rückgewinnung von Bleichen durch mobile Proteine, so dass für die Isolierung von Bleachings, Vermeidung von Nebenwirkungen von rapid, Diffusion-vermittelten Fluoreszenz Erholung zwischen der Inzidenz von Bleichen und nehmen die erste Bild wird nach dem Bleichen.
      Achtung: Paraformaldehyd Lösungen sind giftig. Dieser Schritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden und die Lösung sollte nach institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
    2. Spülen Sie die Probe 3 Mal mit PBS und lassen in PBS.
      Hinweis: Die Verwendung von die meisten kommerziell verfügbaren Montage Medien wirken Fluorophor Eigenschaften, so dass die Probe nicht geeignet für FRAP imaging-54. Im Idealfall die Zellen werden sofort abgebildet werden, sondern können bei 4 ° c über Nacht bleiben Längere Wartezeiten führt zu Verschlechterung der Probe.
    3. Legen Sie die Probe in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung.
    4. Das Laser-Konfigurationsfenster zu öffnen. Beginnen Sie mit der Einstellung einer Laser-Verweilzeit von 1.000 µs und 10 Impulse, was bedeutet, dass jeder Ort im Scan über den ROI 10.000 µs Full-Power-Laser erhalten
      Hinweis: Ein 500 mW, 515 nm Laser wurde zum Bleichen verwendet. Dies wurde gewählt, um selektiv Venus A206K, den Akzeptor in Vinkulin Spannung Sensor, mit maximaler Effizienz zu bleichen. Wenn Spannung FRET-basierte Sensoren mit anderen fluoreszierende Proteine verwendet werden, möglicherweise eine andere Art von Laser eingesetzt werden.
    5. Eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse zu finden und ein Bild zu erwerben.
    6. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI Szenariobereichs zu bleichen und den ROI-Standort speichern. Puls der Laser. Ein anderes Bild der Probe ausrichten.
      Hinweis: Die Größe sollte etwa so groß wie die gesamte FA. Sollten darauf achten, dass die Kastengröße nicht drastisch über Experimente variieren. Die gebleichte Bereich muss in Proteinen sorgfältig überwacht werden, deren Dynamik durch Diffusion betroffen sind. Dies ist eine potenzielle Gefahr in transmembranen Proteine, wie z.B. Cadherine47, oder Proteine, die27,57langsam zu verbreiten.
    7. Überprüfen Sie die Qualität der Immunofluoreszenz, indem Sie überprüfen, dass der gesamte ROI gebleicht ist, derart, dass die Intensität in der Nähe von Hintergrund-Niveaus. Stellen Sie außerdem sicher, dass es keine bleichen außerhalb des ROI.
    8. Passen Sie die Lasereinstellungen an, wie notwendig, um eine erhebliche Menge an bleichen innerhalb der ROI ohne signifikante bleichen außerhalb der ROI zu erzielen. Heben Sie für grobe Anpassungen und senken Sie die Verweilzeit in Schritten von 100 µs und für Feineinstellungen, heben Sie und senken Sie die Anzahl der Impulse in Schritten von 5 Impulse.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5 – 4.1.8 bis zum Erreichen der minimalen Einstellungen, an denen der ROI vollständig ohne Ziel Immunofluoreszenz gebleicht.
      Hinweis: Einen wesentliche bleichen Anfangswert ohne Induktion Phototoxizität zu erreichen ist ein Schlüsselaspekt der FRAP-Analyse. Verwenden Sie die Lasereinstellungen, die ein komplettes Bleichmittel in den festen Proben führen. Im Allgemeinen sollte die minimale Anzahl der Photonen verwendet werden, um den gewünschten bleichen zu erreichen. Auch sollte das bleichende Protokoll während der Experimente, relativ konsistent gehalten werden, da Veränderungen Messungen des Proteins Dynamik58beeinflussen können.
  2. Zeitraffer-Parameter, um die Dynamik des Proteins des Interesses voll zu erfassen, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz zu optimieren.
    1. Bereiten Sie die Mikroskopie-Set-up für das live Cell Imaging, vorzugsweise mit einem beheizten Objekttisch sowie Ziel und CO2 -Regler. 20 min equilibrate lassen.
      Hinweis: Um die Gesundheit der abgebildeten Zellen beizubehalten, Temperatur und pH-Wert in der bildgebenden Gefäß einzuhalten. Eine Vielzahl von beheizten Stufen und objektiven Heizungen kann leicht pflegen die Zellentemperatur bei 37 ° C. Die Kontrolle des pH-Wertes für viele Medien-Typen kann erreicht werden durch die Verwendung einer peristaltischen Pumpe Pass befeuchtet 5 % CO2 über die Probe 15 mL/min. Alternativ, wenn CO2 -Steuerelement ist nicht verfügbar, live imaging Medium mit HEPES sollte verwendet werden, um großen pH-Änderungen zu verhindern.
    2. Platz eins der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung. Für 10 min equilibrate lassen.
    3. Mit dem MDA-Tool richten Sie ein Zeitraffer, 3-5 Bilder vorab zu bleichen, bleichen die ROI sowie weiter einnehmen, 10-60 Bilder zu erwerben.
      Hinweis: Für Vinkulin bei FAs, imaging-alle 5 s für 5 min nach dem Bleichen ist ausreichend, um die Dynamik zu beobachten, ohne übermäßige bleichen31einzuführen. In der Literatur47,48,59,60finden nützliche Ansatzpunkte für bildgebende Preis und Dauer für viele andere Proteine.
    4. Verwenden Sie Akzeptor imaging-Einstellungen, die die Belichtung der Probe, zu minimieren und gleichzeitig eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis, um die Struktur von Interesse Bild. Ein guter Ausgangspunkt ist die Hälfte der ND Filter und Belichtung Zeit notwendig, für die Darstellung von den Akzeptor beim Bund.
    5. Suchen Sie eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse und snap ein Bild.
    6. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI um zu markieren wo Bleichmittel und den ROI-Standort speichern. Initiieren Sie den Zeitraffer.
    7. Den resultierenden Satz von Bildern auf potenzielle Probleme zu untersuchen.
      1. Wenn gibt es erhebliche Sprünge, die Fluoreszenz-Erholung zwischen den Frames (größer als 10 % der ursprünglichen Intensität), reduzieren Sie den Zeitschritt zwischen Frames.
      2. Gibt es ein bedeutenden globalen Verlust der Fluoreszenz im Laufe der Zeit (mehr als 5 bis 10 % der ursprünglichen Intensität), verringern Sie die Anzahl der Bilder, die nach dem Bleichmittel und/oder Einstellungen Sie die bildgebenden zur Verringerung der Exposition der Probe ans Licht.
      3. Wenn Fluoreszenz Erholung nicht bis zum Jahresende den Zeitraffer Plateau hat, erhöhen Sie die Gesamtlänge von den Zeitraffer.
    8. Passen Sie die Zeitraffer-Parameter entsprechend an, und wiederholen Sie Schritte 4.2.5 – 4.2.7 bis die Fluoreszenz Erholung ausreichend ohne globale Foto-Schäden an der Probe erfasst wird.

5. Bund-FRAP Daten erfassen

  1. Bereiten Sie die Mikroskopie-Set-up für das live Cell Imaging, vorzugsweise mit einem beheizten Objekttisch sowie Ziel und CO2 -Regler. 20 min equilibrate lassen.
    1. Um die Integrität der abgebildeten Zellen sicherzustellen, behalten Sie die Temperatur bei 37 ° C in der bildgebenden Kammer. Verwendung einer peristaltischen Pumpe übergeben befeuchtet 5 % CO2 über der Probe mit 15 mL/min um den pH-Wert zu erhalten.
    2. Alternativ wenn CO2 Steuerelement nicht verfügbar ist, können Sie live-Image-Medien mit HEPES um große pH-Wert-Änderungen zu verhindern.
  2. Öffnen Sie das MDA-Tool und richten Sie mit Bund imaging-Parameter, unter anderem die verschiedenen Filter-Sets.
  3. Dieser MDA in den experimentellen Ordner mit dem Namen des MDA_FRET_Datezu retten.
  4. Ein weiterer MDA mit FRAP imaging-Parameter, einschließlich die verschiedenen Filter-Sets, die Time-Lapse-Einstellungen und das Journal den Laser nach Pre-Bleichmittel Übernahme Puls eingerichtet.
  5. Dieser MDA in den experimentellen Ordner mit dem Namen des MDA_FRAP_Datezu retten. Das MDA-Fenster zu schließen.
  6. Wählen Sie in der Symbolleiste am oberen Rand des Bildschirms, Journal | Starten Sie die Aufnahme.
  7. Das MDA-Fenster zu öffnen, Laden des MDA_FRET_Date Staates und drücken Sie erwerben. Dann laden Sie den MDA_FRAP_Date -Zustand und drücken Sie erwerben.
  8. Am Ende des Erwerbs in der Symbolleiste am oberen Rand des Bildschirms wählen Sie Journal | Beenden Sie die Aufnahme.
  9. Dieser Zeitschrift auf die experimentelle Ordner mit dem Namen FRETFRAP_Date speichern und Hinzufügen einer Symbolleiste für einfachen Zugang. Das MDA-Fenster zu schließen.
  10. Platz eins der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors in den Mikroskop-Halter für die Bildgebung. Für 10 min equilibrate lassen.
  11. Navigieren Sie die Probe mit der Bildaufnahme unter Acquire | Erwerben mit minimalen Zeit- und ND Filtern, um die Zellen von Interesse zu identifizieren.
  12. Kontinuierlicher Autofokus durch navigieren zu Geräten eingestellt | Schwerpunkt. Manuell fokussieren Sie auf die Probe bis zum Erreichen der korrekten Abbildungsebene.
  13. Klicken Sie Kontinuierlicher Fokus festlegen, warten Sie, bis das System anpassen, und klicken Sie auf Starten kontinuierliche Fokussierung.
    Hinweis: Dies ist nicht erforderlich, aber Qualität der FRAP Erholung Kurven deutlich verbessert, weil es verhindert, dass die Probe driften Out-of-Focus.
  14. Suchen Sie eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse und snap ein Bild.
  15. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI um wo Sie bleichen zu markieren. Speichern Sie den ROI-Standort.
  16. Initialisieren der FRETFRAP_Date Zeitschrift, die den Erwerb von FRET-Bilder, gefolgt von der Initialisierung des Time-Lapse FRAP beginnen wird.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 5.14-5.16 bis 10-15 Bildsätze erworben werden.
    Hinweis: Die Messung nicht in derselben Zelle wiederholt werden. Sobald Immunofluoreszenz auftritt, ist Bund Daten unzuverlässig.

(6) Bund FRAP Daten analysieren

  1. Analysieren Sie die Bund-Bilder mit der Software der Wahl.
    Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, um Bild und quantitate Bund61, einschließlich ratiometrischen Bund62 und Bund Index34,35. Es ist jedoch dringend empfohlen, die Schätzungen der FRET-Effizienz-55,-63 für die Interpretation der Bund FRAP Daten verwenden. Siehe die Diskussion für die weitere Erforschung dieses Themas. Für sensibilisierten Emissions- und Berechnung der FRET-Effizienz ist Individualsoftware von Hoffman Labor bei https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public erhältlich.
  2. Quantifizieren Sie die relevanten Parameter für jede subzelluläre Struktur, die gebleicht wurde. Dies sollte mittlere Bund Index/Effizienz und durchschnittlichen ersten Akzeptor Intensità ¤ t (proportional zur Konzentration) unter anderem könnte auch physikalische Parameter wie ROI Größe umfassen.
  3. Analysieren Sie die FRAP-Bilder mit der Software der Wahl.
    Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, FRAP26,27,28,29quantitate. Experimentelle Kernanliegen gehören Buchhaltung zum Bleichen während der Post-Bleichmittel imaging, Änderungen im Hintergrundintensität und Translokation von hochdynamischen subzellulären Strukturen, wie z. B. fokalen Adhäsionen. Bleaching, Korrekturen und Schwankungen der Hintergrundbeleuchtung kann durch die Analyse der nicht gebleicht und nicht-fluoreszierende Regionen der Bilder erreicht werden. Hochdynamische subzellulären Strukturen, insbesondere übermäßige Wachstum oder Demontage Dynamik zeigt FRAP Standardanalysen unvereinbar sind und sollte nicht analysiert werden. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Daten zu normieren. Die angegebenen Richtlinien sind für die einfachste Analyse.
  4. Die Wiederherstellungsdaten zum Bleichen Effekte zu korrigieren und dann um Intensitäten Pre bleichen normalisieren. Quantifizieren Sie die halbe Zeit der Erholung und der mobilen Anteil entsprechend der folgenden Gleichung28,34:
    MF - (MF - R-o) e-kt
    wo MF mobile Bruchteil, Ro ist die anfängliche Erholung und k ist die Wiederfindungsrate. Die halbe Zeit der Erholung wird bestimmt durch:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von öffentlich verfügbaren Software-Pakete für den Abschluss dieser Analysen64 sowie eine Vielzahl von ImageJ Plugins. Individualsoftware ist das Hoffman-Lab an der https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public ab. Weitere Analysen sollte verwendet werden, für die Situationen, wo die Diffusion beeinflusst die Dynamik des Proteins des Interesses, mehrere Zeitskalen sind offensichtlich in die Erholung oder nicht standardmäßige bleichende Geometrien verwendet werden.

7. Bund FRAP Daten interpretieren

  1. Relevante Informationen für jedes ROI einschließlich kompilieren: FRET-Index/Effizienz, Akzeptor Intensität, FRAP Halbzeit FRAP mobile Bruchteil.
    Hinweis: Bund Index oder Effizienz dient zum Durchschnittsbelastung über das Protein in den ROI zu bestimmen. Akzeptor Intensität misst die lokale Konzentration des Proteins. Die Hälfte der Zeit der Erholung ist ein Maß für Proteindynamik. Ein kleiner Halbzeit zeigt schneller Umsatz. FRAP mobile Bruchteil misst die Menge an Protein in den ROI, die aktiv umdrehen. Ein größerer mobilen Teil gibt an, dass ein größerer Anteil des Proteins innerhalb der ROI umdrehen.
  2. Um die Wirkung der lokalen Konzentration auf Protein Fluktuationsrate und Menge Sonde, Grundstück FRAP Halbzeit und mobilen Fraktion gegen anfängliche Akzeptor Intensität.
  3. Um die Wirkung von Protein Last auf Protein Fluktuationsrate und Menge Sonde, Grundstück FRAP Halbzeit und mobilen Fraktion gegen FRET-Index/Effizienz.
    Hinweis: Je nach Protein oder Struktur, kann es auch interessant zu untersuchen, Beeinflussung von physikalischen Parametern, wie z. B. Strukturgröße oder Exzentrizität, Protein Last bzw. Umsatz sein.

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Representative Results

Bund-FRAP setzt sich aus der Kombination von zwei fluoreszierende Techniken, Bund und FRAP. Da wir auf die Auswirkungen der Protein-Last, verwendeten wir Spannung FRET-basierte Sensoren34,46. Diese Sensoren basieren häufig auf eine Spannung Sensor Modul bestehend aus zwei fluoreszierende Proteine, wie mTFP1 und VenusA206K, verbunden durch eine birnenförmige Linker (Abbildung 1A). Wenn das Modul zwischen den Kopf und Schweif Domänen eines Proteins platziert wird, ist es möglich, die Belastung auf das Protein zu messen. Bei der Analyse der Daten der Bund Aufnahmen in den Akzeptor-Kanal werden verwendet, um Spannung Sensor Lokalisierung zu beurteilen und Konzentration, als dieses Signal ist unabhängig vom Bund (Abbildung 1 b). Nach der Berechnung der FRET-Effizienz kann Protein Last visualisiert werden auf einer kolorimetrischen Skala ein Rückgang der FRET-Effizienz gegenüber kühleren Farben zeigt eine Zunahme der Protein-Last, wobei FRET-Effizienz im roten Bereich zeigen eiweißarme Last ( Abbildung 1 b). FRAP Bildgebung erfolgt mit Hilfe eines Lasers zum Bleichen der Akzeptor Fluorophor in einem einzigen subzelluläre Strukturen und Monitor Recovery im Laufe der Zeit (Abbildung 1). Die resultierende normalisierte FRAP-Kurve kann analysiert werden, um Parameter zur Beschreibung der Proteindynamik, einschließlich die halbe Zeit der Erholung und des mobilen Bruchteil (Abbildung 1) zu extrahieren. Da Bund und FRAP Analysen wurden auf dieselbe Zelle, die durchschnittliche Protein Last und der Umsatz in einer subzellulären Struktur können als ein einziger Punkt geplottet werden. Mehrere Zellen Imaging liefert mehrere Punkte und ein sich abzeichnender Trend kann angeben, ob ein Protein ist destabilisiert (Abbildung 1E) oder durch molekulare Last (Abb. 1F) stabilisiert.

Der Vinkulin Spannung Sensor (VinTS) stabil in Vinkulin ausgedrückt null MEFs sehr eindeutig lokalisiert FAS verbreitete sich in der Zelle, wie gesehen mit Blick auf das Akzeptor Kanal Bild (Abbildung 2A). Der Akzeptor Kanal Bild wird verwendet, um eine Segmentierung Maske erstellen, die jede einzelne FA mit einer eindeutigen ID, optisch gekennzeichnet durch unterschiedliche Farben (Abb. 2 b) identifiziert. Die Segmentierungsalgorithmus basiert auf dem "Wasser"-Methode und der FAs ungefähr in der Reihenfolge der Helligkeit, wie zuvor beschrieben34,65Etiketten. Die Segmentierung Ergebnisse werden umgewandelt in eine binäre Maske, welches dann an die FRET-Effizienz-Ergebnisse (Abbildung 2) anliegt, und die durchschnittliche FRET-Effizienz innerhalb jedes einzigartige FA berechnet (Abb. 2D). Zusätzliche Eigenschaften können für jede FA in ähnlicher Weise, einschließlich durchschnittliche Akzeptor Intensität, Größe, Exzentrizität und Lage innerhalb der Zelle berechnet werden. Auf diese Weise je FA für FRAP gewählt wird, kann die eindeutige ID der FA und die damit verbundenen Eigenschaften angepasst werden.

FRAP Bildgebung und Analyse ist empfindlich auf mehreren Faktoren, die einschließlich Laser und imaging-Parameter gesteuert werden können, und einige Faktoren, die nicht können, wie z. B. Allgemeine FA Stabilität26,27,28kontrolliert werden, 29. Beispielsweise kann zu viel Belastung durch Licht während der Time-Lapse Bildgebung zu wichtigen Fragen bei der Interpretation FRAP Daten führen. Obwohl die Analyse der Kontrolle FAs, die nicht gebleicht wurden im Laufe der Zeit mit zu viel Belastung der Probe ans Licht, für kleinere Immunofluoreszenz normalisieren verwendet werden kann die resultierende FRAP-Kurve zeigt einen anfänglichen Besserung gefolgt von einem Sprung im normalisierten Intensität, die kann nicht genau mit einer Exponentialfunktion fit zu sein. Wenn dieser Effekt in den Daten konsequent eingehalten wird, ist es notwendig, wieder optimieren die bildgebenden Parameter, um die Belichtungszeit zu verringern, den Zeitschritt zwischen bildgebenden Frames zu erhöhen oder verringern Sie die Länge der den Zeitraffer zur Verringerung der Exposition der Probe ans Licht.

Ein weiteres Beispiel für FRAP-Daten, die nicht interpretierbar ist, ist, wenn die FA, die Photobleached wurde schnell während der Wiederherstellung28translocates. Ein repräsentativer Fall übermäßige Translokation ist in Abbildung 3dargestellt. Das erste Bild, geben wo ROIs gewählt werden, einen Hinweis auf FA Stabilität (Abb. 3A) nicht. Überwachung der gebleichten FA im Laufe der Zeit, es bewegt sich schnell von der ursprünglichen Position und das automatische Tracking ist nicht in der Lage, sofort aufgrund der niedrigen Fluoreszenzsignal nach Immunofluoreszenz (Abbildung 3A) zu folgen. Die resultierende FRAP Kurve zeigt, dass eine Anfangsphase leichte Erholung mit einem Sprung bei der Fluoreszenz ist genesen genug für die Software zur Erkennung der FA und den ROI (Abb. 3 b) verschieben. Diese Kurve kann nicht erfolgreich durch eine Exponentialfunktion fit zu sein. Die schnelle Translokation des FA schlägt auch vor, dass die FA-Struktur instabil ist. So sind instabile FAs nicht in der gleichen Bund FRAP Analyse als stabile FAs, aufgrund von technischen und biologischen Problemen einzubeziehen.

Mit zufriedenstellenden Bund und FRAP Daten komplettiert im nächste Schritt die Bund-FRAP-Analyse durch die gleichzeitig Bewertung Protein Last und Dynamik. Abbildung 4A zeigt der FRET-Effizienz-Karten von drei Vinkulin null MEFs VinTS stabil zum Ausdruck zu bringen. Die FAs weiß konturierten wurden für FRAP Analyse gewählt, und die Akzeptor-Intensitäten sind im Laufe der Zeit gezeigt. Diese drei FAs haben Vinkulin unter unterschiedlich geladen und ein anderes Vinkulin Recovery-Profil angezeigt. Diese Eigenschaften durch Berechnung die halbe Zeit der Erholung und Verschwörung gegen die durchschnittliche FRET-Effizienz in jedem FA Quantifizierung zeigt den allgemeinen Trend des Vinkulin wird durch erhöhte Belastung (Abbildung 4 b) stabilisiert. Die mobile Bruchteil aufgetragen gegen FRET-Effizienz zeigt jedoch kein Trend, was darauf hindeutet, dass mobile Bruchteil nicht durch molekulare Last (Abbildung 4) geregelt ist. Einführung einer Punktmutation in der VinTS an Aminosäure 50 (A50I) hat sich gezeigt, Vinkulin binden an einen wichtigen Bindungspartner in FAs, Talin66zu verhindern. Die Änderung dieser Protein-Protein-Interaktion betrifft Vinkulin Kraft-und Kleinschreibung Dynamik. Vinkulin null MEFs stabil auszudrücken VinTS A50I haben verschiedene Zell- und FA Morphologien, verschiedene Vinkulin Laden von Profilen und verschiedene Vinkulin Dynamik (Abbildung 4). Das Zweieinhalbfache der Erholung und FRET-Effizienz zu quantifizieren und Plotten zeigt, dass wenn die Vinkulin-Talin Interaktion gestört ist, Vinkulin bei FAs durch erhöhte Belastung (Abbildung 4E) destabilisiert ist während mobile Bruchteil keine Tendenz (Abbildung 4F zeigt ).

Figure 1
Abbildung 1: Prinzipien der Bund FRAP Technik. (A) schematische Darstellung der Bund-basierte Spannung Sensor-Modul (TSMod) in ein Protein des Interesses und die Wirkung der Spannung auf das FRET Signal eingefügt. (B) Quantifizierung der Bund mit sensibilisierten Emission, sind Bilder zu erfassen-Geber-Signal (nicht dargestellt), Akzeptor Signal und FRET Signal aufgenommen. Mit entsprechenden Korrekturen kann der Bund Bild zugewiesen eine kolorimetrischen Skala zu visualisieren, wie viel Spannung auf dem Sensor angewendet wird. (C) FRAP erfolgt mittels der Akzeptor-Signal, das direkt proportional zur Konzentration ist. (D) FRAP bildgebende Analyse erzeugt Kurven der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit, die Proteindynamik bestimmen mithilfe mathematischer Modelle passen kann. (E, F) Wenn Bund und FRAP kombiniert werden, können Kraft und Umsatz in einer einzigen FA gemessen werden. Messung von mehreren FAs in mehreren Zellen ergibt sich eine Beziehung zwischen Protein Last und Protein-Umsatz. In dieser Analyse wird eine Beziehung in die erhöhte Last korreliert mit mehr Umsatz als eine Kraft destabilisiert Staat (E) bezeichnet. In dieser Analyse ist eine Beziehung, in denen erhöhte Last korreliert mit Umsatz verringern, einen Kraft-stabilisierten Zustand (F) genannt. Diese Zahl wurde von Rothenberg Et Al. modifiziert 37. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: FA-Identifikation und Analyse der FRET. (A) "null" eine Vinkulin MEF mit dem Ausdruck der VinTS visualisiert in den Akzeptor-Kanal, wobei die Intensität lokale Konzentration Vinkulin angibt. Maßstabsleiste = 30 µm. (B) FAs werden basierend auf den Akzeptor-Kanal eine FA ID Maske erstellen wo jeder FA eine eindeutige ID erhält, hier dargestellt als verschiedene Farben, etwa in der Reihenfolge der Helligkeit segmentiert. (C) die FA ID Maske wird umgewandelt in eine binäre Maske und Bund Effizienz Bild der FRET-Effizienz-Werte nur bei FAs zeigen angewendet. (D) die FRET-Effizienz innerhalb jeder FA wird gemittelt, um einen einzelnen Wert für jeden FA erhalten, die der FA-ID in der Ausgabe-Daten-Tabelle zugeordnet ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel für eine translocating FA. (A) einer Vinkulin invertiert null MEF mit dem Ausdruck der VinTS A50I mutierte Sensor in den Akzeptor-Kanal mit der Farbtabelle visualisiert wird aus Gründen der Übersichtlichkeit. Maßstabsleiste = 30 µm. Die FA in schwarzen umrissen wurde zum Bleichen ausgewählt. Vergrößerte Bilder zeigen den FA-Verlauf im Laufe der Zeit mit roten Umriss, die angibt, wo die Software identifiziert die FA. Maßstabsleiste = 2 µm. (B) die resultierende normalisierte FRAP-Kurve von Daten in (A). Es ist ein ca. 5 % Sprung in der Intensität im folgenden Punkt 3 infolge der FA translocating schnell vor ausreichend Erholung für die Software, um die Änderung in Anlagenstandort zu erkennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter Bund-FRAP Ergebnisse. (A) Vinkulin null MEFs mit dem Ausdruck der VinTS als durchschnittliche FRET-Effizienz-Bilder der gesamten Zelle angezeigt (Maßstabsleiste = 30 µm) mit vergrößerten invertiert Akzeptor Kanal Bilder zeigen FRAP Erholung fortschreiten (Maßstabsleiste = 2 µm). (B) FRAP-Halbzeit der Erholung aufgetragen gegen FRET-Effizienz für 32 Zellen mit den Punkten, die in Rot hervorgehobene Zellen in (A) vertreten. (C) FRAP mobile Bruchteil aufgetragen gegen FRET-Effizienz für die gleichen Zellen (b). (D) Vinkulin null MEFs mit dem Ausdruck des VinTS A50I mutierte Sensors als durchschnittliche FRET-Effizienz-Bilder der gesamten Zelle angezeigt (Maßstabsleiste = 30 µm) mit vergrößerten invertiert Akzeptor Kanal Bilder zeigen FRAP Erholung fortschreiten (Maßstabsleiste = 2 µm). (E) FRAP-Halbzeit der Erholung aufgetragen gegen FRET-Effizienz für 21 Zellen mit der Punkte, die in Rot hervorgehobene Zellen in (D). (F) FRAP mobile Bruchteil aufgetragen gegen FRET-Effizienz für die gleichen Zellen in (E). Daten wurden ursprünglich in Rothenberg Et Al. veröffentlicht. 37 und sind hier in einem neuen Format visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Bund-FRAP-Methode ermöglicht direkte Messung von Kraft-Sensitive Protein Dynamics, eine Eigenschaft, die schwierig war, direkt in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Empfindlichkeit der Proteindynamik molekulare Belastung ist entscheidend für die Funktion des Proteins als Kraft Sender oder Wandler. Beladung ist erforderlich für die Übertragung der beiden intern generierten und äußerlicher Anwendung Kräfte, genannt Mechanotransmission und für die Umwandlung von jenen Kräften in biochemisch nachweisbar Signale Mechanotransduktion. Aber die Veränderungen der Belastung beeinflussen die Dauer, die ein Protein gebunden bleibt, so, desto weniger Zeit verbringt ein Protein Lagerbelastung, desto geringer die Chance, die die Kraft hat, an andere Proteine übertragen oder in ein biochemisch nachweisbar Signal ausgestrahlt und spürte. Die Bund-FRAP-Methode schließt die Lücke zwischen molekularer und zellulärer Ebene dadurch, dass molekulare Skala Messungen des Kraft-Sensitive Dynamik in einem breiteren Kontext der zellulären zugegriffen werden. Darüber hinaus ermöglicht es diese Messungen getroffen werden, während die intrazelluläre oder extrazelluläre Umgebung stören, biochemisch oder mechanisch. Diese Technik sollte für jeden Bund-basierte Spannung Sensor ermöglicht die Untersuchung von Protein mechanischen Zustand in einer Vielzahl von subzellulären Strukturen und extrazelluläre Kontexten anwendbar.

Wichtige Schritte bei der Gewährleistung, die die gewünschten Bund FRAP Messungen gewonnen werden beinhalten Optimierung der bildgebenden Parameter und Durchführung, Analyse und Interpretation. Optimierung der bildgebenden Parameter, wie im Rahmen des Protokolls beschrieben ist notwendig, der lichtbedingten auf die Probe zu begrenzen, wobei für die gewünschten Strukturen und Dynamiken zu unterscheiden und für ausreichende Signalstärke für die Berechnung der FRET. Zur Gründung dieser bildgebenden Parameter für eine bestimmte Zelle Linie und Protein des Interesses frühzeitig erleichtert Direktvergleich zwischen verschiedenen Versuchsgruppen. Es ist erwähnenswert, dass Änderungen an das System, wie z. B. mutiert das Protein des Interesses oder der Einführung von Inhibitoren, zu Änderungen im Protein-Lokalisierung (damit eine Veränderung Signalintensität) und Dynamik führen können. Die optimierte Parameter sollten klare und präzise Messungen in allen Versuchsbedingungen ermöglichen. Daher empfiehlt es sich, die Parameter auswählen, die nicht am äußersten Ende des Seins nützlich, zum Beispiel kaum Signal vom Rauschen unterscheiden werden.

Während die Bildgebung in diesem Protokoll für eine Epifluoreszenz Mikroskop und angehängten FRAP Lasermodul beschrieben wurde, ist FRET-FRAP auf anderen bildgebenden Systemen anwendbar. Beispielsweise kann diese Technik Linie scannen konfokale Mikroskope als auch rotierende Festplatten konfokale Mikroskope mit einem angehängten Immunofluoreszenz-Modul angepasst werden. Imaging-Einstellungen sollten auf analoge Weise angemessene Signal-Rausch-zu erreichen, ohne dass lichtbedingten oder übermäßige Immunofluoreszenz optimiert werden. Besonders bezüglich Bund Bildgebung sind hohe Effizienz Quantendetektoren ausreichendes Signal für erfolgreiche Bund-Berechnung zu erhalten, ohne Induktion Fluorophor Schäden verpflichtet. Es gibt eine Reihe von Publikationen, beschreiben separate Bund oder FRAP Bildgebung mit einem confocal Mikroskop67,68,69, die zur Optimierung für die Bund-FRAP Bildgebung führen können.

Im Anschluss an das Experiment sollte Datenanalyse sorgfältig behandelt und in gewissem Sinne reproduzierbar, vorzugsweise automatisiert, durchgeführt. Aufgrund der Unfähigkeit, mehr als 2-3 subzelluläre Regionen in einer einzelnen Zelle bleichen vor dem Bleichen zuviel von dem verfügbaren Pool des Proteins, der Durchsatz dieser Technik ist relativ begrenzt. So werden Datensätze oft über mehrere Tage der Bildgebung, erfordern eine konsequente Behandlung Daten kombiniert. Bund und FRAP bieten Herausforderungen mit Datenanalyse. Bund-Index und FRET-Effizienz-Messungen ermöglichen eine Quantifizierung der Protein-Last. Bund-Index ist ein relatives Maß, die stark abhängig von Mikroskop-Einstellungen, während FRET-Effizienz-Messungen sind absolut und unabhängig vom Mikroskop Einstellungen55,70. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass eine zuvor entwickelte Methode mit "drei-Cube" Bildgebung FRET-Effizienz von Messungen der sensibilisierten Emission zu bestimmen, die in der Regel mit Bund Index quantifiziert werden, beim Bund-basierte Spannung Sensoren56 mit einsetzbar . Die Messungen der FRET-Effizienz sind erforderlich, wenn die Messungen der absoluten Kräfte Erfahrung durch die Spannung Sensoren berechneten34sein sollen. Die Zellen Spannung FRET-basierte Sensoren zum Ausdruck zu bringen, können besonders stabile Zellen an hoher Stelle zahlen, rekombinieren oder degradieren Sensoren, was zu unbrauchbaren Bund Daten50. Dies ist leicht zu erkennen bei der Berechnung des Donor-Akzeptor-Verhältnisse bei der Berechnung der FRET-Effizienz37,56 aber möglicherweise schwieriger zu erkennen, über Bund Index. Beim Starten mit einem Bund-basierte Spannung Sensor, es kann hilfreich sein, ein großes Dataset zu erhalten (> 50 Zellen) nur Bund Daten für die Konstrukte von Interesse, die erwarteten Bereich Bund Wirkungsgrade zu identifizieren. Darüber hinaus können FRAP Daten extrahieren aus Strukturen, die sehr mobil sind, wie FAs, die schnell gleiten oder Demontage schwierig sein. Auswahl einer Subpopulation von Strukturen oder Optimierung der Zelle Beschichtung Bedingungen, um diesen Effekt abzumildern kann helfen, um dieses Problem zu minimieren.

Im Konzept können Bund FRAP auf jeder Bund basierende Sensor in jeder subzelluläre Region, mit der richtigen Optimierung angewendet werden. In der Praxis ist es möglicherweise schwierig, Kraft-und Kleinschreibung Dynamik der Proteine, die nicht unter erhebliche mechanische Belastung oder haben Hälfte-Zeiten der Erholung auf der sehr kurzen Zeitskala von wenigen Sekunden oder auf den langen Zeitrahmen von zehn Minuten, zu erfassen. Ergebnisse aus Einzelmolekül-Studien können auf die Proteine zeigen, die Kraft-Sensitive Dynamik innerhalb von lebenden Zellen zeigen kann. Dazu gehören bisher viele FA und AJ Proteine13,14,15,16 , sowie einige Zellskelett Elemente71,72,73. Zufällig wurden für viele dieser Proteine46Bund-basierte Sensoren konzipiert. Diese Ergebnisse können die Auswahl eines Proteins des Interesses zu führen; Allerdings sollte nicht erwartet werden, dass Bund FRAP Daten genau die Ergebnisse aus diesen Studien Einzelmolekül-gespiegelt werden. In der Tat kann biochemische Verordnung, Interaktionen mit anderen Proteinen und lokale Zellskelett Struktur verdecken oder zu ändern, die Auswirkungen von Kräften auf Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die Fähigkeit, diese Komplexität zu beobachten ist eine einzigartige Stärke des Bund-FRAP-Ansatzes.

Eine Kombination von Manipulationen an der Zelle und das Protein des Interesses können verwendet werden, die wichtigen Faktoren bei der Regulierung der Proteindynamik aufzuklären. Zum Beispiel kann es hilfreich sein, einen Sensor haben, der Kraft-unempfindlich, entweder durch die Löschung oder Mutation der einen Kraft-bindende Domäne35,74 ist, da sollte es keine Umsatz Proteindynamik Abhängigkeit der Kraft von gemeldet der Sensor. Darüber hinaus bieten die Mutationen der anderen kritischen Bindungsstellen oder Phosphorylierung Websites im Protein ein vollständigeres Bild des Proteins des Interesses wie reguliert wird. Globale Änderungen an der Zelle oder die Umwelt durch Zellskelett Inhibitoren oder durch Ändern der Substrat-Eigenschaften (z. B. extrazelluläre Matrix oder Steifigkeit), bzw. kann helfen, festzustellen, wie die Kraft-Sensitive Dynamik des Proteins zu reagieren mechanische Störungen. Die Informationen über Protein Last und Kraft-Sensitive Dynamik mit anderen biophysikalischen Eigenschaften des Proteins kombinieren kann helfen, um den mechanischen Zustand des Proteins des Interesses zu etablieren. Dazu zählen die Lokalisierung und lokalen Proteinprotein Interaktionen innerhalb einer subzellulären Struktur75,76. Darüber hinaus könnte das Protein in unterschiedlichen Konformation Staaten, sogar innerhalb der gleichen subzelluläre Struktur, je nach Kontext76,77befinden. Protein-Last, Dynamik, Lokalisierung und Konformation können alle intern generierten und äußerlicher Anwendung Kräfte37,76,78,79, gleichzeitig betroffen sein diktieren eine des Proteins bei der Kraftübertragung und Mechanotransduktion. Die Vielseitigkeit der Bund FRAP Methode und seine mögliche Kompatibilität mit einer Vielzahl von Proteinen und Manipulationen sollen die Aufklärung der Interaktion zwischen Masse Mechanik und Proteindynamik Mechanosensitive Signalisierung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) sowie Zuschüsse aus der American Heart Association (16GRNT30930019) und die National Institutes of Health (R01GM121739-01) verliehen an Dr. Brenton Hoffman und Angehöriger unterstützt. Science Foundation Graduate Research Fellowship an Katheryn Rothenberg vergeben. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NSF oder NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Rothenberg, K. E., Puranam, I.,… More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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