Qui, presentiamo un protocollo per l’uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.
Cellule di percepiscono e rispondono ai segnali fisici nel loro ambiente convertendo stimoli meccanici in segnali biochimicamente rilevabili in un processo chiamato mechanotransduction. Un passo fondamentale nella meccanotrasduzione è la trasmissione di forze tra gli ambienti interni ed esterni. Per la trasmissione di forze, ci deve essere una continua, ininterrotta sollevatore fisico creato da una serie di interazioni proteina-proteina. Per un’interazione proteina-proteina data, carico meccanico non può avere alcun effetto sull’interazione, portare alla dissociazione più veloce dell’interazione, o addirittura stabilizza l’interazione. Comprendere come molecolare carico detta turnover delle proteine in cellule viventi in grado di fornire preziose informazioni circa lo stato meccanico di una proteina, a sua volta chiarire il suo ruolo nella meccanotrasduzione. Le tecniche esistenti per la misurazione dinamica di proteine sensibili alla forza mancano misure dirette di carico proteico o si basano su misure effettuate di fuori del contesto cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per il recupero di trasferimento-fluorescenza Förster energia di risonanza dopo tecnica photobleaching (FRET-FRAP), che consente la misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina nelle cellule viventi. Questa tecnica è potenzialmente applicabile a qualsiasi sensore di tensione basato su FRET, facilitare lo studio della dinamica di proteine sensibili alla forza in varietà di strutture subcellulari e in diversi tipi cellulari.
L’ambiente extracellulare è una fonte ricca di spunti sia biochimici e fisici che determinano il comportamento delle cellule. In particolare, la natura fisica del microambiente possa mediare principali funzioni cellulari, tra cui la crescita delle cellule, migrazione e differenziazione1,2,3,4. Disregolazione della meccanica del microambiente è una componente critica per molte malattie che non hanno ancora adeguato trattamento, quali cancro5, aterosclerosi6e7di fibrosi. Una comprensione completa di come le cellule convertono stimoli fisici in segnali biochimicamente rilevabili, un processo chiamato meccanotrasduzione, richiede la delucidazione dei meccanismi molecolari che mediano la trasmissione della forza, sia all’interno e all’esterno delle cellule e all’interno di più strutture subcellulari.
All’interno di strutture subcellulari, proteine si rivolgono costantemente sopra; associazione e separazione basata sulla forza del loro interazioni con l’associazione partner8. Per le forze per essere trasmesso con successo attraverso una distanza fisica, ci devono essere una catena ininterrotta di interazioni proteina-proteina, significante che il fatturato di una proteina deve essere abbastanza lento per sostenere e trasmettere forza alla sua associazione partner9. Mentre interazioni proteina-proteina consistono generalmente di diversi legami non covalenti tra i domini della proteina, l’interazione spesso è concettualizzato come uno stato legato che può eseguire la transizione a uno stato non associato sotto diverse condizioni10, 11. per un’interazione proteina-proteina data, è possibile che in vigore non può avere effetto sulla durata dell’interazione, conosciuto come un “legame ideale”, ridurre la durata dell’interazione, conosciuto come un “legame di slittamento” o aumentare la durata dell’interazione , conosciuto come un “legame di cattura”10. Così, c’è un intricato rapporto tra carico proteico e dinamica di proteine che ci riferiamo come sensibili alla forza dinamica.
Verso la comprensione l’effetto del carico sulle dinamiche di vincolo, è stata effettuata una serie di esperimenti altamente informativi a livello di singola molecola. Utilizzando proteine isolate, o frammenti di proteine e tecniche di manipolazione come magnetiche pinzette, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica, questi studi hanno dimostrato interazioni della proteina-proteina di sensibili alla forza per più rilevanti proteine11,12. Entrambe le integrine13 e caderine14, che sono proteine transmembrana importante per formare interazioni cellula-matrice e cellula-cellula, rispettivamente, hanno dimostrato alterazioni nella dinamica dovuta a caricare. All’interno della cellula, vinculina viene reclutato a entrambi talin15 e α-catenina16 in un modo dipendente dalla forza e può formare un legame di cattura con l’actina17, che indica un ruolo cruciale per vinculin sia adesioni focali (FAs) e giunzioni intermedie (AJs ) sotto carico. Studi di singola molecola consentono per l’isolamento delle interazioni specifiche proteina-proteina e producono risultati inequivocabili, ma essi non tengono conto della complessità dell’ambiente cellulare.
Pietra miliare gli esperimenti hanno dimostrato che diverse strutture subcellulari, tra cui FAs e AJs, mechanosensitive ed esibiscono Assemblea avanzata in risposta a carichi generati internamente o esternamente applicato18,19, 20,21,22. Inoltre, diversi modelli teorici hanno suggerito che potrebbe essere guidato mechanosensitive assemblaggio di proteine sensibili alla forza dinamica23,24,25. Per esaminare queste dinamiche di sensibili alla forza nelle cellule viventi, sono stati presi alcuni approcci indiretti. FRAP e relative tecniche forniscono una metodologia relativamente semplice per la misurazione dinamica della proteina in cellule26,27,28,29. Tuttavia, la misurazione del carico proteico è stato più limitata. Un approccio tipico è quello di confrontare la dinamica della proteina in cellule con e senza l’esposizione ad un inibitore del citoscheletro utilizzato per ridurre il generale cella contrattilità8,30,31. Concettualmente, questo è un confronto tra un carico elevato e basso carico stato. Tuttavia, non c’è nessuna quantificazione del carico attraverso la proteina in entrambi gli Stati, e ci possono essere effetti biochimici non intenzionali dell’inibitore, tale perdita di siti di legame chiave lungo un filamento di F-actina. Un altro approccio, specifico per FAs, è stato per misurare lo sforzo di forza totale sul substrato dalla FA usando microscopia di forza di trazione per approssimare carico molecolare ed esaminare la relazione con le dinamiche di una singola proteina all’interno la FA32. Mentre questo approccio consente per la quantificazione della forza totale, non fornisce informazioni specifiche molecolarmente. FAs sono costituiti da più di 200 differenti proteine, molte delle quali può sopportare carico33. Così, misurare la produzione di forza totale di un FA potenzialmente oscura la possibilità di molteplici vie di trasmissione di forza e in modo affidabile non fornisce una misura del carico su una proteina specifica.
A differenza di precedenti approcci in mechanobiology, l’avvento dei sensori di tensione basato su FRET permette diretta misurazione del carico di proteine specifiche all’interno di vita di cellule34,35,36. Qui, presentiamo un protocollo che combina sensori di tensione basato su FRET con la misura di FRAP-base della dinamica della proteina. Ci riferiamo a questa tecnica come FRET-FRAP. Questo approccio permette la misurazione simultanea di carico proteico e la dinamica della proteina, permettendo la valutazione delle dinamiche sensibili alla forza della proteina in cellule viventi (Figura 1). Già, la tecnica FRET-FRAP è stata applicata allo studio delle dinamiche sensibili alla forza della meccanica del linker proteina vinculin37. Sensori di tensione sono stati sviluppati per numerose proteine che sono rilevanti in una varietà di strutture subcellulari. Ad esempio, i sensori sono stati sviluppati per vinculin34 e talin38,39 a FAs, caderine e catenine in AJs40,41,42, nesprin nel complesso nucleare LINC 43, α-actinina44 e filamina36 del citoscheletro e MUC-1 nel glicocalice45, tra gli altri46. Allo stesso modo, FRAP è che una tecnica comunemente usata è stata utilizzata sulle proteine meccanosensibili entro le adesioni focali8,31, adherens junctions47, actina corteccia26e nucleo48. Movimento in avanti, che la tecnica FRET-FRAP dovrebbe essere ampiamente applicabile a uno qualsiasi di questi sensori esistenti o appena sviluppato sensori, consentendo per le misurazioni di sensibili alla forza dinamica in un’ampia varietà di contesti e strutture subcellulari. A tal fine, forniamo un dettagliato protocollo generalizzato per implementare la tecnica FRET-FRAP applicabile a questi diversi sistemi. Speriamo che questo vi permetterà una vasta gamma di esperimenti chiarire i ruoli delle varie proteine meccanosensibili nella regolazione della trasmissione della forza e nel mediare il comportamento delle cellule.
Il metodo FRAP FRET consente per la misura diretta della dinamica della proteina sensibile alla forza, una proprietà che è stato difficile sondare direttamente all’interno di cellule viventi. La sensibilità del dynamics della proteina per carico molecolare è critica alla funzione della proteina come un trasmettitore di forza o trasduttore. Caricamento è necessaria per la trasmissione di entrambi generato internamente ed esternamente applicate forze, chiamato mechanotransmission e per la conversione di tali forze in …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation CAREER (NSF-CMMI-14-54257) così come di sovvenzioni da parte della American Heart Association (16GRNT30930019) e il National Institutes of Health (R01GM121739-01) assegnato al Dr. Brenton Hoffman e un nazionale Science Foundation Graduate Research Fellowship assegnato a Katheryn Rothenberg. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF o NIH.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |