Summary

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Published: November 02, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l’uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

Abstract

Cellule di percepiscono e rispondono ai segnali fisici nel loro ambiente convertendo stimoli meccanici in segnali biochimicamente rilevabili in un processo chiamato mechanotransduction. Un passo fondamentale nella meccanotrasduzione è la trasmissione di forze tra gli ambienti interni ed esterni. Per la trasmissione di forze, ci deve essere una continua, ininterrotta sollevatore fisico creato da una serie di interazioni proteina-proteina. Per un’interazione proteina-proteina data, carico meccanico non può avere alcun effetto sull’interazione, portare alla dissociazione più veloce dell’interazione, o addirittura stabilizza l’interazione. Comprendere come molecolare carico detta turnover delle proteine in cellule viventi in grado di fornire preziose informazioni circa lo stato meccanico di una proteina, a sua volta chiarire il suo ruolo nella meccanotrasduzione. Le tecniche esistenti per la misurazione dinamica di proteine sensibili alla forza mancano misure dirette di carico proteico o si basano su misure effettuate di fuori del contesto cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per il recupero di trasferimento-fluorescenza Förster energia di risonanza dopo tecnica photobleaching (FRET-FRAP), che consente la misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina nelle cellule viventi. Questa tecnica è potenzialmente applicabile a qualsiasi sensore di tensione basato su FRET, facilitare lo studio della dinamica di proteine sensibili alla forza in varietà di strutture subcellulari e in diversi tipi cellulari.

Introduction

L’ambiente extracellulare è una fonte ricca di spunti sia biochimici e fisici che determinano il comportamento delle cellule. In particolare, la natura fisica del microambiente possa mediare principali funzioni cellulari, tra cui la crescita delle cellule, migrazione e differenziazione1,2,3,4. Disregolazione della meccanica del microambiente è una componente critica per molte malattie che non hanno ancora adeguato trattamento, quali cancro5, aterosclerosi6e7di fibrosi. Una comprensione completa di come le cellule convertono stimoli fisici in segnali biochimicamente rilevabili, un processo chiamato meccanotrasduzione, richiede la delucidazione dei meccanismi molecolari che mediano la trasmissione della forza, sia all’interno e all’esterno delle cellule e all’interno di più strutture subcellulari.

All’interno di strutture subcellulari, proteine si rivolgono costantemente sopra; associazione e separazione basata sulla forza del loro interazioni con l’associazione partner8. Per le forze per essere trasmesso con successo attraverso una distanza fisica, ci devono essere una catena ininterrotta di interazioni proteina-proteina, significante che il fatturato di una proteina deve essere abbastanza lento per sostenere e trasmettere forza alla sua associazione partner9. Mentre interazioni proteina-proteina consistono generalmente di diversi legami non covalenti tra i domini della proteina, l’interazione spesso è concettualizzato come uno stato legato che può eseguire la transizione a uno stato non associato sotto diverse condizioni10, 11. per un’interazione proteina-proteina data, è possibile che in vigore non può avere effetto sulla durata dell’interazione, conosciuto come un “legame ideale”, ridurre la durata dell’interazione, conosciuto come un “legame di slittamento” o aumentare la durata dell’interazione , conosciuto come un “legame di cattura”10. Così, c’è un intricato rapporto tra carico proteico e dinamica di proteine che ci riferiamo come sensibili alla forza dinamica.

Verso la comprensione l’effetto del carico sulle dinamiche di vincolo, è stata effettuata una serie di esperimenti altamente informativi a livello di singola molecola. Utilizzando proteine isolate, o frammenti di proteine e tecniche di manipolazione come magnetiche pinzette, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica, questi studi hanno dimostrato interazioni della proteina-proteina di sensibili alla forza per più rilevanti proteine11,12. Entrambe le integrine13 e caderine14, che sono proteine transmembrana importante per formare interazioni cellula-matrice e cellula-cellula, rispettivamente, hanno dimostrato alterazioni nella dinamica dovuta a caricare. All’interno della cellula, vinculina viene reclutato a entrambi talin15 e α-catenina16 in un modo dipendente dalla forza e può formare un legame di cattura con l’actina17, che indica un ruolo cruciale per vinculin sia adesioni focali (FAs) e giunzioni intermedie (AJs ) sotto carico. Studi di singola molecola consentono per l’isolamento delle interazioni specifiche proteina-proteina e producono risultati inequivocabili, ma essi non tengono conto della complessità dell’ambiente cellulare.

Pietra miliare gli esperimenti hanno dimostrato che diverse strutture subcellulari, tra cui FAs e AJs, mechanosensitive ed esibiscono Assemblea avanzata in risposta a carichi generati internamente o esternamente applicato18,19, 20,21,22. Inoltre, diversi modelli teorici hanno suggerito che potrebbe essere guidato mechanosensitive assemblaggio di proteine sensibili alla forza dinamica23,24,25. Per esaminare queste dinamiche di sensibili alla forza nelle cellule viventi, sono stati presi alcuni approcci indiretti. FRAP e relative tecniche forniscono una metodologia relativamente semplice per la misurazione dinamica della proteina in cellule26,27,28,29. Tuttavia, la misurazione del carico proteico è stato più limitata. Un approccio tipico è quello di confrontare la dinamica della proteina in cellule con e senza l’esposizione ad un inibitore del citoscheletro utilizzato per ridurre il generale cella contrattilità8,30,31. Concettualmente, questo è un confronto tra un carico elevato e basso carico stato. Tuttavia, non c’è nessuna quantificazione del carico attraverso la proteina in entrambi gli Stati, e ci possono essere effetti biochimici non intenzionali dell’inibitore, tale perdita di siti di legame chiave lungo un filamento di F-actina. Un altro approccio, specifico per FAs, è stato per misurare lo sforzo di forza totale sul substrato dalla FA usando microscopia di forza di trazione per approssimare carico molecolare ed esaminare la relazione con le dinamiche di una singola proteina all’interno la FA32. Mentre questo approccio consente per la quantificazione della forza totale, non fornisce informazioni specifiche molecolarmente. FAs sono costituiti da più di 200 differenti proteine, molte delle quali può sopportare carico33. Così, misurare la produzione di forza totale di un FA potenzialmente oscura la possibilità di molteplici vie di trasmissione di forza e in modo affidabile non fornisce una misura del carico su una proteina specifica.

A differenza di precedenti approcci in mechanobiology, l’avvento dei sensori di tensione basato su FRET permette diretta misurazione del carico di proteine specifiche all’interno di vita di cellule34,35,36. Qui, presentiamo un protocollo che combina sensori di tensione basato su FRET con la misura di FRAP-base della dinamica della proteina. Ci riferiamo a questa tecnica come FRET-FRAP. Questo approccio permette la misurazione simultanea di carico proteico e la dinamica della proteina, permettendo la valutazione delle dinamiche sensibili alla forza della proteina in cellule viventi (Figura 1). Già, la tecnica FRET-FRAP è stata applicata allo studio delle dinamiche sensibili alla forza della meccanica del linker proteina vinculin37. Sensori di tensione sono stati sviluppati per numerose proteine che sono rilevanti in una varietà di strutture subcellulari. Ad esempio, i sensori sono stati sviluppati per vinculin34 e talin38,39 a FAs, caderine e catenine in AJs40,41,42, nesprin nel complesso nucleare LINC 43, α-actinina44 e filamina36 del citoscheletro e MUC-1 nel glicocalice45, tra gli altri46. Allo stesso modo, FRAP è che una tecnica comunemente usata è stata utilizzata sulle proteine meccanosensibili entro le adesioni focali8,31, adherens junctions47, actina corteccia26e nucleo48. Movimento in avanti, che la tecnica FRET-FRAP dovrebbe essere ampiamente applicabile a uno qualsiasi di questi sensori esistenti o appena sviluppato sensori, consentendo per le misurazioni di sensibili alla forza dinamica in un’ampia varietà di contesti e strutture subcellulari. A tal fine, forniamo un dettagliato protocollo generalizzato per implementare la tecnica FRET-FRAP applicabile a questi diversi sistemi. Speriamo che questo vi permetterà una vasta gamma di esperimenti chiarire i ruoli delle varie proteine meccanosensibili nella regolazione della trasmissione della forza e nel mediare il comportamento delle cellule.

Protocol

1. generare i campioni per l’Imaging Costrutto di sensore tensione stabile espresso nel tipo cellulare desiderato. Clonare Tensione sensore costrutto in pRRL vettoriale o altri plasmidi di espressione virale.Nota: Diversi strumenti clonazione molecolare sono disponibili per realizzare questo passaggio compreso l’uso degli enzimi di restrizione, si sovrappongono estensione e Gibson Assembly35. Il vettore di pRRL è usato nella trasduzione virale lenti e consente un notevole gr…

Representative Results

FRET-FRAP si compone della combinazione di due tecniche di fluorescenza, FRET e FRAP. Come ci siamo concentrati sugli effetti del carico proteico, abbiamo usato tensione basato su FRET sensori34,46. Questi sensori sono spesso basati su un modulo composto da due proteine fluorescenti, come mTFP1 e VenusA206K, collegati da un linker flagelliform (Figura 1A) sensore di tensionamento. Quando il modulo vie…

Discussion

Il metodo FRAP FRET consente per la misura diretta della dinamica della proteina sensibile alla forza, una proprietà che è stato difficile sondare direttamente all’interno di cellule viventi. La sensibilità del dynamics della proteina per carico molecolare è critica alla funzione della proteina come un trasmettitore di forza o trasduttore. Caricamento è necessaria per la trasmissione di entrambi generato internamente ed esternamente applicate forze, chiamato mechanotransmission e per la conversione di tali forze in …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation CAREER (NSF-CMMI-14-54257) così come di sovvenzioni da parte della American Heart Association (16GRNT30930019) e il National Institutes of Health (R01GM121739-01) assegnato al Dr. Brenton Hoffman e un nazionale Science Foundation Graduate Research Fellowship assegnato a Katheryn Rothenberg. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF o NIH.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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