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Bioengineering

荧光技术结合测定活细胞中的力敏感蛋白动力学

doi: 10.3791/58619 Published: November 2, 2018

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 同时使用 förster 共振能量转移的张力传感器来测量光漂白后的蛋白质负荷和荧光恢复, 以测量蛋白质动力学, 从而能够测量对力敏感的测量活细胞内的蛋白质动力学。

Abstract

细胞通过将机械刺激转化为生物化学可检测信号, 在称为机械传导的过程中感知和响应其环境中的物理线索。机械传导的一个关键步骤是外部和内部环境之间的力传递。要传递力量, 必须有一个持续的, 完整的物理联系, 创造了一系列的蛋白质-蛋白质相互作用。对于给定的蛋白质-蛋白质相互作用, 机械负荷要么对相互作用没有影响, 要么导致相互作用的更快分离, 甚至稳定相互作用。了解分子负载如何决定活细胞中蛋白质的周转, 可以提供有关蛋白质机械状态的有价值的信息, 进而阐明蛋白质在机械转导中的作用。现有的测量力敏感蛋白质动力学的技术要么缺乏对蛋白质负荷的直接测量, 要么依赖于在细胞环境之外进行的测量。在这里, 我们描述了光漂白 (fret-frap) 技术后 förster 共振能量转移-荧光恢复的协议, 该方法能够测量活细胞内的力敏感蛋白质动力学。这项技术有可能适用于任何基于 fret 的张力传感器, 有助于研究各种亚细胞结构和不同细胞类型的力敏感蛋白动力学。

Introduction

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细胞外环境是决定细胞行为的生化和物理线索的丰富来源。特别是, 微环境的物理性质可以介导关键的细胞功能, 包括细胞生长、迁移和分化12、3、4。微环境力学的失调是许多疾病的关键组成部分, 这些疾病还没有得到足够的治疗, 如癌症5、动脉粥样硬化6和纤维化7。要完全了解细胞如何将物理刺激转化为生化检测信号, 这一过程被称为机械传导, 需要阐明介导力量进出细胞的分子机制。在多个亚细胞结构内。

在亚细胞结构内, 蛋白质不断翻转;根据与具有约束力的伙伴的互动强度而具有约束力和不具有约束力8。要使力成功地在物理距离上传递, 必须有一个完整的蛋白质-蛋白质相互作用链, 这意味着蛋白质的周转必须足够缓慢, 以维持力并将其传递给其结合伙伴9。虽然蛋白质-蛋白质相互作用通常由蛋白质域之间的几个非共价键组成, 但这种相互作用通常被概念化为一种约束状态, 可以在不同条件下过渡到无约束状态 10,11. 对于给定的蛋白质-蛋白质相互作用, 力可能不会对相互作用的寿命产生影响, 被称为 "理想键", 减少相互作用的寿命, 称为 "滑移键", 或增加相互作用的寿命, 被称为 "捕获债券"10。因此, 蛋白质负载和蛋白质动力学之间存在着复杂的关系, 我们称之为力敏感动力学。

为了了解载荷对键动力学的影响, 在单分子水平上进行了大量的信息实验。利用孤立的蛋白质, 或蛋白质碎片和操作技术, 如磁推子, 光学推子, 原子力显微镜, 这些研究已经证明了力敏感蛋白相互作用的几个相关蛋白质11,12。整合素13和钙粘蛋白14分别是对形成细胞基质和细胞细胞相互作用很重要的跨膜蛋白, 它们都表现出负载引起的动力学改变。在细胞内, 长春英被招募到两者的滑石素15和α-儿茶素16在力依赖的方式, 并可以形成捕获键与肌动蛋白17, 这表明长春新蛋白在焦点粘连 (fa) 和粘附连接 (ajs) 的关键作用) 在负载下。单分子研究允许分离特定的蛋白质-蛋白质相互作用, 并产生明确的结果, 但它们没有考虑到细胞环境的复杂性。

具有里程碑意义的实验表明, 包括 fa 和 ajs 在内的几种亚细胞结构对机械敏感, 并表现出增强的装配性, 以响应内部产生或外部施加的载荷18,19, 20,21,22。此外, 一些理论模型表明, 机械敏感组装可以驱动的力敏感蛋白质动力学23,24,25。为了研究这些对力敏感的动态在活细胞内, 已经采取了一些间接的方法。frap 和相关技术为测量细胞 262728、29中的蛋白质动力学提供了一个相对简单的方法。然而, 蛋白质负荷的测量已经更加有限。一个典型的方法是比较细胞中的蛋白质动力学, 有和没有接触细胞骨架抑制剂, 用于减少细胞的整体收缩力8,30,31。从概念上讲, 这是高负载和低负载状态之间的比较。然而, 没有定量的负载整个蛋白质在这两个状态, 并可能有意外的生化效应的抑制剂, 如失去沿 f-肌动蛋白长丝的关键结合位点。另一种特定于 fa 的方法是通过利用牵引力显微镜测量基板上的总力消耗, 以近似分子负荷, 并检查与 fa32中单个蛋白质的动力学的关系。虽然这种方法允许对总力进行量化, 但它不提供分子特定的信息。fa 由200多种不同的蛋白质组成, 其中许多蛋白质可以承受33种蛋白质的负荷。因此, 测量 fa 的总力输出可能掩盖了多力传递途径的可能性, 并且不能可靠地提供对特定蛋白质的负载测量。

与以往机械生物学方法不同的是, 基于 fret 的张力传感器的出现允许直接测量活细胞3435、36特定蛋白质的负载。在这里, 我们提出了一个协议, 结合了基于 fret 的张力传感器和基于 frab 的蛋白质动力学测量。我们把这种技术称为 fret-frap。这种方法可以同时测量蛋白质负载和蛋白质动力学, 从而可以评估活细胞中的力敏感蛋白质动力学 (图 1)。fret-frap 技术已经应用于机械链接蛋白长春新蛋白37的力敏感动力学研究.张力传感器已经开发出用于许多与各种亚细胞结构相关的蛋白质。例如, 在 fa 开发了长春蛋白34和他林 3839ajs 40、41、42、nesprin 中的 nesprin 传感器43, α-放线素44和维生素36在细胞骨架和 muc-1 在糖酵解45, 除其他46。同样, frap 是一种常用的技术, 已被用于机械敏感蛋白内的局灶性粘连8,31, 粘附连接点 47,肌动蛋白皮层 26, 核 48.展望未来, fret-frap 技术应广泛适用于任何现有的传感器或新开发的传感器, 允许在各种亚蜂窝结构和背景下测量力敏感动力学。为此, 我们提供了一个详细的通用协议, 用于实现适用于这些不同系统的 fret-frap 技术。希望这将使各种各样的实验能够阐明各种机械敏感蛋白在调节力传递和调节细胞行为方面的作用。

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Protocol

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1. 生成用于成像的样品

  1. 在所需的细胞类型中稳定地表达张力传感器结构。
    1. 克隆张力传感器构造成 prrl 载体或其他病毒表达质粒。
      注: 有几种不同的分子克隆工具可用于实现此步骤, 包括使用限制性酶、重叠扩展和 gibson 组装35。prrl 载体用于 lenti 病毒转导, 并通过使用人巨细胞病毒 (cmv) 启动子, 实现了相当程度的蛋白质生产。对于特定的上下文, 可能需要不同的向量。例如, cmv 启动子在某些细胞类型49中被沉默。此外, 只有含有缺乏强序列同源性的荧光蛋白的 fret 传感器 (如 mtfp1 和 venus a206k) 才能用于创建稳定的细胞系。含有青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的传感器很可能会进行同源重组50
    2. 利用 psPax2 和 pmd2. g 标准病毒生产方法在人胚胎肾 (hek) 293t 细胞中产生慢病毒 51.
      注意: 应只由经过适当培训的人员在生物安全2级实验室环境中处理慢病毒。
      注: 这种细胞和包装质粒的组合适合与 prrl 一起使用。可能需要其他系统与其他向量。
    3. 利用标准转导协议52用病毒推断所需的细胞, 并使用流式细胞术对细胞53进行排序, 选择在大约内源水平表达每个结构的同质种群37。选择细胞后, 可以立即进行实验, 也可以将细胞冷冻冷冻供以后使用。对于给定的稳定细胞系, 不要超过2个冻融周期。
      注: 使用缺乏蛋白质的细胞系 (例如, 用于长春林张力传感器的 vinculin-mef) 将增加 fret 实验中的信噪比, 并限制过度表达伪影。这种稳定的小鼠胚胎成纤维细胞 (mef) 线可以用于大约15个通道之前, 传感器的显出或退化的显著损失是显而易见的。如果不需要基于病毒的方法, 可以根据制造商的协议使用大量的商业试剂, 在适当的质粒 (如 pcdna3.1) 中使用张力传感器对各种细胞类型进行瞬态转染。转染后的最佳表达式为24-48。
  2. 准备用于细胞播种的基板。
    1. 获取 4, 35 毫米玻璃底菜肴。
    2. 在细胞培养罩中工作, 在15毫升的规范管中, 利用细胞培养罩中的无菌 pbs, 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中制备4ml 的10μgml 纤维连接蛋白溶液。轻轻反转管一次混合, 让溶液坐在细胞培养罩5分钟。
      注: ecm 蛋白的浓度或类型可能需要根据其他细胞类型进行调整。所提供的条件适用于计量基金。
    3. 将1毫升纤维连接蛋白溶液滴入每个玻璃底盘上。
    4. 在室温下将纤维连接蛋白溶液放在盘子上 1小时, 在4°c 下过夜。
    5. 吸入纤维连接蛋白溶液, 用 pbs 冲洗一次, 并添加1毫升的 pbs。
  3. 将细胞播种到准备好的基板上。
    1. 从6厘米培养皿中适合亚培养的融合百分比的感兴趣的细胞开始。
      注: 不同的细胞类型将需要不同的细胞培养条件和亚培养方案。本节提供了适合计量和指标的准则。通常情况下, 多元气体在种植前生长到85% 的汇合点。
    2. 在细胞培养罩内工作, 用3毫升的 pbs 冲洗细胞一次。加入1毫升0.05% 胰蛋白酶 edta, 在37°c 孵育5分钟。
    3. 在6厘米的盘子中加入3毫升的完整培养基, 收集细胞, 放入15毫升的锥形管中。
      注: 完整介质的组成将取决于所使用的单元格类型。对于 mef, 完整培养基通常被定义为高血糖 dulbecco 的修饰鹰培养基, 含有10% 的胎牛血清、1% 的抗生素-抗真菌药 (含安非霉素 b、青霉素和链霉素) 和1% 的非必需氨基酸 (neaa) 溶液。
    4. 将细胞向下旋转 5分钟, 以 1000 x g 的速度旋转。
    5. 在1毫升的完整培养基中吸气并重新悬浮细胞颗粒。
    6. 从纤维镀膜玻璃盘中取出 pbs。用适当的完整介质将细胞和种子 30, 000个细胞数到每个纤维细胞涂层的玻璃盘上, 最终体积为 1.5 ml。
      注: 这种细胞密度适用于多元气体, 并将导致不接触, 但不是极其稀疏的细胞群。确切的细胞数量可能需要根据其他细胞类型或其他成像室进行调整。
    7. 在播种后, 让细胞扩散4小时。在传播2小时时, 吸气生长介质, 用成像介质冲洗一次, 留下1.5 毫升的成像介质。
      注: 此传播时间适用于 mef, 但可能需要为其他单元格进行更改。然而, 孵育时间超过6-8 将导致明显的 ecm 蛋白沉积从血清在完整的培养基。成像介质应包含与完整介质相同的添加物, 但应光学清晰, 并且不包含任何在成像通道中发光的化合物, 如黄素或荧光, 如苯酚红。一个通常有用的成像媒体是 dmem-gfp 活细胞可视化介质, 并辅以10% 的 fbs 和 1% neaa 解决方案。如果背景自荧光高得令人无法接受, 那么血清的数量就会减少。如果在初始电镀后介质无法改变, 细胞可以在成像介质中直接重新悬浮, 辅以胰蛋白酶抑制剂。

2. 设置成像显微镜

  1. 打开显微镜。
    1. 首先打开电弧灯。
      注: 电弧灯将释放电磁脉冲, 这可能会损坏已打开的其他设备。
    2. 打开过滤轮控制器、自动舞台控制器、显微镜计算机接口和摄像头。
    3. 打开 frap 激光和激光位置控制器。
      注意: 如果直接查看, 高功率激光可能会对眼睛造成损害。建议配置显微镜系统, 以阻止激光激发被定向到眼片, 这可以通过在漂白过程中将一面镜子移动到 frap 光束路径来实现, 以反映激光对样品的影响, 并防止传输到目镜。
    4. 打开计算机和打开显微镜控制软件。
    5. 让电弧灯和 frap 激光器预热15分钟。
  2. 校准 frap 激光器。
    1. 打开激光配置窗口。将照明设置(脉冲期间) 设置为适当的 frap 照明设置, 以便激光接触样品。将"照明设置" (在成像过程中) 设置为仅用于成像受体荧光体的照明设置。
    2. "坐标系设置" 下选择要校准的目标。取消选中"手动单击校准点" , 并在校准过程中检查 "显示图像"。
    3. 将 dwell 时间设置为 10, 000μs, 将脉冲数设置为100。
    4. 将由溴化物密封在玻璃滑块和覆盖物之间制成的校准幻灯片放入带盖板侧的舞台适配器中。
      注意: 溴化乙酯是一种诱变剂, 应使用手套处理。如果滑梯受损, 请按照机构的指导原则处置。
    5. 使用接收器照明设置将焦点放在幻灯片表面上, 可识别为具有最亮信号的焦平面。涂层中的小缺陷将是可见的, 以帮助聚焦。
    6. 将幻灯片移动到成像平面上具有均匀荧光的区域。
    7. 单击"创建设置"。该软件将初始化校准过程, 自动漂白和检测漂白点的位置。
    8. 通过评估最终图像, 确保成功校准, 最终图像将是一个 3 x 3 网格的漂白点, 应均匀分布和对焦。保存校准图像以供将来参考。
    9. 卸下校准幻灯片并安全存储。每个实验开始之前都应进行校准, 但不需要在样品之间进行校准。

3. 选择用于自由成像的参数

  1. 将表达4% 对甲醛张力传感器的细胞的一个生成样本固定 10分钟. 对甲醛溶液应不含甲醇, 通常称为 em 级, 以防止荧光蛋白变性。固定后放置在 pbs 中。
    注意: 对苯二甲醛溶液是有毒的。这一步骤应在通风罩中进行, 解决方案应根据体制政策加以处理。
    注: 此优化不依赖于蛋白质动力学, 固定样本可提供最大的成像时间, 而无需担心细胞健康问题。
  2. 用 pbs 冲洗样品三次, 然后留在 pbs 中。
    注: 使用大多数商业上可用的安装介质将影响荧光体的特性, 使样品不适合 fret 成像54。理想情况下, 细胞将立即成像, 但可能会在4°c 下过夜。更长的等待时间将导致样品的恶化。
  3. 将样品放入显微镜舞台支架中进行成像。
  4. 打开多维采集 (mda) 工具。建立三个通道的顺序成像: 仅受体激励和发射 (受体通道)、供体激励和受体发射 (fret 通道) 和供体仅激励和发射 (供体通道)。
    注: 有多种方法来成像 fret 样本。对于基于 fret 的张力传感器5556, 建议采用三通道或 "三立方" 成像方法, 并对系统进行校准以测量 fret 效率。这种方法快速、简单、无损, 只需要标准的荧光成像显微镜, 可以比较不同日期的实验和成像设置。
  5. 使用500毫秒的曝光时间和10% 的中性密度 (nd) 过滤器扫描样品。找到一个细胞, 将张力传感器表达到感兴趣的结构中, 并具有清晰的定位。
  6. 为每个成像通道选择500毫秒的曝光时间或所需长度, 并选择100% 的 nd 滤波器, 获取 fret 图像序列。
  7. 估计传感器在每个成像通道中感兴趣的亚细胞结构处的平均强度。由于校正估计不正确、探测器中的非线性或背景信号的重大贡献, 低信号可能会导致不准确的结果。一个近似的准则是针对相机动态范围的10% 以上的强度 (, 对于16位摄像机, 强度应在 6, 000 以上)。
    注: 所有将进行比较的 fret 实验都必须使用相同的光学设置 (曝光时间、滤波器、目标和其他变量, 如相机增益或分页)。更改这些设置中的任何一个都将导致在显微镜设置中生成和/检测到的 fret 量的更改。fret 效率测量与这些设置无关, 但用于确定 fret 效率的校准因子则不是。从理论上讲, 可以使用不同的校准因子从不同的光学设置中产生 fret 效率, 但不建议这样做。漂白或光毒性可以在不同的设置之间不同, 产生虚假的结果。
  8. 获取相同视场的第二个 fret 图像序列。通过比较每个成像通道中传感器的平均强度来估计帧之间的光漂白。光漂白应保持在最低限度, 最好小于1-5 的信号损失。
  9. 调整成像参数, 最大限度地提高强度, 同时最大限度地减少光漂白。对于粗调整, 请更改采集过程中使用的 nd 筛选器。为了进行更精细的调整, 请按250毫秒的步骤更改曝光时间。
  10. 重复第3.5-3.8 步, 直到获得足够的信号, 同时最大限度地减少光漂白。
    注: 通常情况下, 长春林-/mef 中的长春林张力传感器的设置分别为 1, 500 毫秒、1, 500 毫秒和 1, 000 毫秒, 用于供体、fret 和受体通道。最佳值将随照明系统的类型、目标、滤波器集和传感器表达级别的不同而不同。

4. 选择 frap 成像的参数

  1. 优化激光设置, 确保对感兴趣的区域 (roi) 进行完全漂白, 而不会使周围区域变白或导致光斑。
    1. 用4% 的甲醛固定其中一个细胞的样品, 表达张力传感器10分钟。
      注: 此优化不依赖于蛋白质动力学, 固定样本可提供最大的成像时间, 而无需担心细胞健康问题。这也将防止通过移动蛋白进行漂白的恢复, 从而能够分离出漂白的效果, 避免在漂白和采取漂白的发生率之间发生快速的扩散介导的荧光恢复的任何影响。第一次漂白剂后的图像。
      注意: 对苯二甲醛溶液是有毒的。这一步骤应在通风罩中进行, 解决方案应根据体制政策加以处理。
    2. 用 pbs 冲洗样品 3次, 然后留在 pbs 中。
      注: 使用大多数商业上可用的安装介质将影响荧光体的特性, 使样品不适合 frap 成像54。理想情况下, 细胞将立即成像, 但可能会在4°c 下过夜。更长的等待时间将导致样品的恶化。
    3. 将样品放入显微镜舞台支架中进行成像。
    4. 打开激光配置窗口。从设置 1, 000μs 和10个脉冲的激光停留时间开始, 这意味着整个投资回报率扫描中的每个点都将接收 10, 000μn 的全功率激光
      注: 采用500mw、515纳米激光进行漂白。这被选择漂白金星 a206k, 受体在长春林张力传感器, 以最大的效率。如果使用基于 fret 的张力传感器和其他荧光蛋白, 则可能需要使用另一种类型的激光。
    5. 找到一个单元, 将张力传感器清晰地定位到感兴趣的结构中, 并获得图像。
    6. 绘制一个矩形 roi, 概述区域以漂白和存储 roi 位置。脉冲激光。捕捉示例的另一个图像。
      注: 箱体大小应与整个 fa 的大小大致相当。应注意的是, 盒子的大小不会在不同的实验中有很大的差异。漂白区域必须在其动态受到扩散影响的蛋白质中进行仔细监测。这是跨膜蛋白的一个潜在问题, 如钙粘蛋白47,或缓慢扩散 27,57的蛋白质。
    7. 检查光漂白的质量, 检查整个 roi 是否漂白, 使强度接近背景水平。此外, 请确保在投资回报率之外没有漂白。
    8. 根据需要调整激光设置, 以便在投资回报率范围内实现大量漂白, 而不会导致投资回报率之外的大量漂白。对于粗调整, 以100μs 的步长提高和降低停留时间, 对于精细调整, 以5个脉冲的步长提高和降低脉冲数。
    9. 重复4.1.5 步骤– 4.1.8, 直到达到在没有非目标光漂白的情况下完全漂白 roi 的最低设置。
      注: 在不诱导光毒性的情况下实现实质性的初始漂白值是 frap 分析的一个关键方面。使用激光设置, 在固定样品中产生完全的漂白剂。一般情况下, 应使用最小数量的光子来达到所需的漂白水平。此外, 漂白协议应保持相对一致的实验, 因为改变可能会影响蛋白质动力学测量58。
  2. 优化延时参数, 以充分捕获感兴趣的蛋白质的动态, 同时最大限度地减少光漂白。
    1. 准备用于活细胞成像的显微镜设置, 最好是具有加热阶段和目标以及 co2 控制 。允许平衡20分钟。
      注: 为了保持成像细胞的健康, 成像容器中必须保持温度和 ph 值。各种加热阶段和目标加热器可以很容易地将电池温度保持在37°c。许多介质类型的 ph 值控制可以通过使用蠕动泵在 15 mL/min 时通过加湿5% 的 co 2 在样品上通过. 或者, 如果没有 co2 控制, 则应使用含有 hepes 的实时成像介质防止 ph 值的大变化。
    2. 将表达张力传感器的细胞的一个生成样本放入显微镜舞台支架中进行成像。允许平衡10分钟。
    3. 使用 mda 工具, 设置延时以获取3-5 个图像预漂白、漂白 roi, 并继续拍摄10-60 张图像。
      注: 对于 fa 中的长春花素, 每5秒成像5分钟后漂白剂就足以观察动态, 而不会引入过多的漂白31。在文献47485960中可以找到许多其他蛋白质成像率和持续时间的有用起点。
    4. 使用受体成像设置, 最大限度地减少样品对光线的曝光, 同时保持足够的信噪比, 以成像感兴趣的结构。一个好的起点是 nd 滤波器的一半和在 fret 期间对受体进行成像所需的曝光时间。
    5. 找到一个单元, 将张力传感器清晰地定位到感兴趣的结构中, 并捕捉图像。
    6. 绘制一个矩形 roi, 以突出显示在何处漂白和存储 roi 位置。启动延时。
    7. 检查生成的图像集是否存在潜在问题。
      1. 如果帧之间的荧光恢复有大量跳跃 (大于初始强度的 10%), 请减少帧之间的时间步长。
      2. 如果随着时间的推移, 全球荧光损失显著 (大于初始强度的 5-10), 请减少漂白后拍摄的图像数量, 或更改成像设置, 以减少样品暴露在光线下。
      3. 如果荧光恢复在延时结束时还没有平展, 则增加延时的总长度。
    8. 相应地调整延时参数, 并重复步骤 4.2.5, 4.2.7, 直到充分捕获荧光恢复, 而不会对样品造成全局光损坏。

5. 获取 fret-frap 数据

  1. 准备用于活细胞成像的显微镜设置, 最好是具有加热阶段和目标以及 co2 控制 。允许平衡20分钟。
    1. 为确保成像细胞的健康, 请将成像室的温度保持在37°c。使用蠕动泵在 15 ml/min 的样品上通过加湿5% 的 co2, 以保持 ph 值。
    2. 或者, 如果co2控制不可用, 请使用包含 hepes 的实时成像介质, 以防止 ph 值的较大变化。
  2. 打开 mda 工具, 并使用 fret 成像参数 (包括不同的筛选器集) 进行设置。
  3. 将此 mda保存到具有 mda _ fret _ date的名称的实验文件夹中。
  4. 使用 frap 成像参数设置另一个 mda, 包括不同的滤波器组、延时设置以及在预漂白剂采集后脉冲激光的日志。
  5. 将此 mda 保存到具有mda _ frap _ date的名称的实验文件夹中。关闭 mda 窗口。
  6. 在屏幕顶部的工具栏中, 选择"日记"开始录制
  7. 打开 mda 窗口, 加载mda _ fret _ date状态, 然后按"获取"。然后加载mda _ frap _ date状态, 然后按"获取"
  8. 在获取结束时, 在屏幕顶部的工具栏中, 选择"日记"停止录制
  9. 将此日志保存到具有frettrap _ date名称的实验文件夹中, 并将其添加到工具栏中, 以便于访问。关闭 mda 窗口。
  10. 将表达张力传感器的细胞的一个生成样本放入显微镜支架中进行成像。允许平衡10分钟。
  11. 使用 "获取" 下的图像采集导航示例最少的曝光时间和 nd 过滤器识别感兴趣的细胞。
  12. 通过导航到设备设置连续自动对焦集中注意力, 集中注意力手动将焦点放在样品上, 直到到达正确的成像平面。
  13. 单击 "设置连续对焦", 等待系统进行调整, 然后单击 "开始连续对焦"。
    注: 这不是必需的, 但显著提高了 frap 恢复曲线的质量, 因为它可以防止样本偏离焦点。
  14. 找到一个单元, 将张力传感器清晰地定位到感兴趣的结构中, 并捕捉图像。
  15. 绘制一个矩形 roi, 以突出显示漂白的位置。存储投资回报率位置。
  16. 初始化fretfrap _ date日志, 它将开始获取 fret 图像, 然后初始化 frap 延时。
  17. 重复步骤 5.14-5.16, 直到获取10-15 个图像集。
    注: 测量不能在同一单元中重复进行。一旦发生光漂白, fret 数据是不可靠的。

6. 分析 fret-frap 数据

  1. 使用所选的软件对 fret 图像进行分析。
    注: 有几种方法来图像和量化 fret61,包括比率 fret62和 fret 索引34,35。但是, 强烈建议使用 fret 效率估计 55,63来解释 fret-frap 数据。有关此主题的进一步探索, 请参阅讨论。为了提高排放灵敏度和计算 fret 效率, https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public 的霍夫曼实验室提供定制软件。
  2. 量化漂白的每个亚细胞结构的相关参数。这应该包括平均 fret 索引效率和平均初始受体强度 (与浓度成比例), 但也可以包括物理参数, 如 roi 大小。
  3. 使用所选软件分析 frap 图像。
    注: 有几种方法对 frap26272829进行量化。主要的实验问题包括漂白后成像过程中的漂白、背景强度的变化以及高度动态的亚细胞结构 (如焦点粘连) 的移位。通过对图像的非漂白和非荧光区域的分析, 可以实现背景照明的漂白校正和变化。高动态亚细胞结构, 特别是那些显示过度生长或拆卸动力学的结构与标准的 frap 分析不兼容, 不应进行分析。此外, 还有多种方法可以对数据进行规范化。提供的指南用于最简单的分析。
  4. 更正漂白效果的恢复数据, 然后归一化到预漂白强度。根据以下公式2834 量化恢复的一半时间和移动部分:
    mf-(mf-r o)-kt
    其中 mf是移动分数, ro 是初始恢复, k是恢复速率。恢复的一半时间由以下因素决定:
    =
    注: 有各种公开可用的软件包来完成这些分析64以及各种 imagej 插件.https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public 的霍夫曼实验室提供自定义软件。对于扩散影响感兴趣的蛋白质动态、多个时间尺度在回收过程中明显存在或使用非标准漂白几何形状的情况, 应使用更多的分析。

7. 解释 fret-frap 数据

  1. 编制每个 roi 的相关信息, 包括: fret 指标/效率、接受强度、frap 中场休息、frap 移动分数。
    注: fret 指数或效率用于确定投资回报率内蛋白质的平均负荷。接受强度测量蛋白质的局部浓度。恢复的一半时间是衡量蛋白质动力学的指标。中场休息较小表示营业额较快。frap 移动分数测量正在积极翻转的投资回报率内的蛋白质含量。较大的移动分数表明, 投资回报率中较大比例的蛋白质正在翻转。
  2. 探讨局部浓度对蛋白质转化率和含量的影响, 绘制 frap 半场和移动分数对初始受体强度的影响。
  3. 探讨蛋白质负荷对蛋白质转化率和含量的影响, 绘制 frap 半场和移动分数对抗 fret 指数/效率。
    注: 根据蛋白质或结构的不同, 检查物理参数 (如结构大小或偏心) 对蛋白质负载或周转的影响也可能很有趣。

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Representative Results

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fret-frap 由 fret 和 frap 两种荧光技术的结合而成。当我们关注蛋白质负载的影响时, 我们使用了基于 fret 的张力传感器34,46。这些传感器通常基于由两种荧光蛋白组成的张力传感模块, 如 mtfp1 和 venusa206k, 由鞭毛连接器连接 (图 1 a)。当模块放置在蛋白质的头部和尾部之间时, 可以测量在蛋白质上施加的负荷。在分析 fret 数据时, 在接收通道中拍摄的图像用于评估张力传感器的位置和浓度, 因为该信号与 fret 无关 (图 1b)。在计算了 fret 效率后, 蛋白质负荷可以在比色尺度上可视化, 在比色尺度上, 对较冷颜色的 fret 效率的降低表明蛋白质负荷的增加, 而在红色范围内的 fret 效率表明蛋白质负载较低 (图 1 b)。frap 成像是通过使用激光在单个亚细胞结构中漂白受体荧光体并监测一段时间内的恢复情况 (图 1c)。由此产生的归一化 frap 曲线可以进行分析, 以提取描述蛋白质动力学的参数, 包括恢复的一半时间和移动分数 (图 1d)。由于 fret 和 frap 分析是在同一细胞上进行的, 因此可以将亚细胞结构中的平均蛋白质负荷和周转绘制为单点。成像多个细胞会产生多个点, 一个新出现的趋势可以表明蛋白质是不稳定的 (图 1e) 还是由分子负载稳定的 (图 1E)。

长春林张力传感器 (vints) 在长春林空多元结构中稳定地表示, 非常清楚地定位到在整个细胞中传播的 fa, 通过查看受体通道图像可以看出这一点 (图 2 a)。接收通道图像用于创建一个分割掩码, 该掩码使用唯一的 id 标识每个 fa, 视觉上由不同的颜色指定 (图 2b)。分割算法基于 "水" 方法, 并按亮度顺序对 fa 进行近似标记, 如前面所述的34,65。分割结果被转换为二进制掩码, 然后应用于 fret 效率结果 (图 2c), 并计算每个唯一 fa 中的平均 fret 效率 (图 2d)。可以以类似的方式计算每个 fa 的其他属性, 包括平均受体强度、大小、偏心度和细胞内的位置。这样, 无论为 frap 选择哪种 fa, 都可以与唯一的 fa id 和相关属性相匹配。

frap 成像和分析对可以控制的几个因素非常敏感, 包括激光和成像参数, 以及一些无法控制的因素, 如 fa 稳定性为 262728 29岁例如, 在延时成像过程中, 过多的光线照射可能会导致解释 frap 数据的重大问题。尽管对未漂白的控制 fa 的分析可用于随着时间的推移对轻微的光漂白进行归一化, 而样品对光线的暴露过多, 但由此产生的 frap 曲线显示了初始恢复, 然后是归一化强度的下降, 即无法精确地与指数函数相适应。如果在数据中一致观察到这种影响, 则有必要重新优化成像参数, 以减少曝光时间, 增加成像帧之间的时间步长, 或缩短延时长度, 以减少样品的曝光光。

另一个无法解释的 frap 数据示例是, 在恢复28期间, 被光浸出的 fa 会快速传输。图 3显示了过度易位的典型情况。选择 roi 的初始图像并不表示 fa 稳定性 (图 3 a)。随着时间的推移, 监测漂白 fa, 它将迅速远离初始位置, 由于光漂白后的荧光信号较低, 自动跟踪无法立即跟踪 (图 3 a)。由此产生的 frap 曲线显示了一个初步的初步阶段轻微恢复与跳跃时, 荧光恢复足够的软件检测 fa 和移动 roi (图 3b)。这个曲线不能通过指数函数成功地拟合。足协的快速易位也表明足协结构不稳定。因此, 由于技术和生物问题, 不稳定的 fa 不应作为稳定的 frap 分析包括在同一分析中。

利用令人满意的 fret 和 frap 数据, 下一步是通过同时评估蛋白质负载和动态来完成 fret-frap 分析。图 4a显示了三个长春花素空多元气体的 fret 效率图, 稳定地表示了 vints。选择白色的 fa 进行 frap 分析, 并随着时间的推移显示接受强度。这三个 fa 在不同的负载量下具有长春花素, 并显示不同的长春新蛋白恢复配置文件。通过计算回收的中场休息时间和根据每个 fa 的平均 fret 效率绘制这些属性来量化这些属性, 这表明了通过增加负荷来稳定长春林的总体趋势 (图 4 b)。然而, 针对 fret 效率绘制的移动分数没有显示出任何趋势, 表明移动分数不受分子负载的调节 (图 4c)。在氨基酸 50 (a50i) 的 vints 中引入点突变已被证明可以防止长春新碱与 fa 中的主要结合伙伴结合, talin66。这种蛋白质-蛋白质相互作用的改变会影响长春细胞对力敏感的动力学。长春新空多元结构稳定地表达 vints a50i 有不同的细胞和 fa 形态, 不同的长春花素负载剖面, 和不同的长春花素动力学 (图 4d)。量化恢复和 fret 效率的一半时间和绘图表明, 当长春花素相互作用受到干扰时, 在 fa 处的长春花素因负载增加而不稳定 (图 4e), 而移动分数则没有显示趋势 (图 4E)).

Figure 1
图 1: fret-frap 技术的原理.(a) 插入感兴趣的蛋白质的基于 fret 的张力传感器模块 (tsmod) 的原理图以及张力对 fret 信号的影响。(b) 为了量化 fret 使用敏化发射, 图像被用来捕捉供体信号 (不显示)、受体信号和 fret 信号。通过适当的校正, 可以为 fret 图像分配一个比色刻度, 以可视化传感器施加的张力。(c) frap 是使用受体信号进行的, 该信号与浓度成正比。(d) frap 成像分析产生的荧光强度曲线随着时间的推移, 可以适合使用数学模型来确定蛋白质动力学。(英、法)当 fret 和 frap 结合在一起时, 可以测量单个 fa 中的力和转换。测量多个细胞中的多个 fa 会产生蛋白质负载和蛋白质周转之间的关系。在这种分析中, 负载增加与营业额增加相关的关系被称为力不稳定状态 (e)。在这种分析中, 负载增加与减少周转相关的关系被称为强制稳定状态 (f)。这一数字已从 rothenberg等人那里修改。37.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: fa 识别和 fret 分析.(a) 表达在受体通道中可视化的 vinculin null mef, 其强度表示长春花素的局部浓度。刻度条 = 30μm. (b) fa 根据受体通道进行分割, 以创建一个 fa id 掩码, 其中每个 fa 被分配一个唯一的 id, 这里显示为不同的颜色, 大约按亮度的顺序。(c) fa id 掩码转换为二进制掩码, 并应用于 fret 效率图像, 仅在 fa 时显示 fret 效率值。(d) 每个 fa 内的 fret 效率是平均值, 以获得每个 fa 的单个值, 该值与输出数据表中的 fa id 相关联。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 转移 fa 的示例.(a) 在受体通道中显示了表示 vints a50i 突变传感器的长春素空 mef, 颜色表倒置以保持清晰度。刻度杆 = 30μm。选择黑色的英足总进行漂白。放大图像显示了随着时间的推移 fa 的进展, 红色轮廓表示软件识别 fa 的位置。刻度条 = 2μm (b) 由此产生的归一化 frap 曲线来自 (a) 中的数据。在软件进行足够的恢复以检测 fa 位置的变化之前, 由于 fa 快速转移, 导致强度在第3点之后有大约5% 的跃升。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 具有代表性的 fret-frap 结果.(a) vinculin 空多元性表示 vints 显示为整个细胞的平均 fret 效率图像 (刻度柱 = 30μm), 并放大倒置受体通道图像, 显示 frap 恢复进展 (刻度条 = 2μm)。(b) frap 恢复的一半时间针对32个单元的 fret 效率进行了规划, (a) 中代表单元的点以红色突出显示。(c) 为 (b) 中相同的细胞绘制了 frap 移动分数, 以提高 fret 效率。(d) vinculin 空多元结构表示 vints a50i 突变传感器, 显示为整个细胞的平均 fret 效率图像 (刻度柱 = 30μm), 并放大反向受体通道图像, 显示 frap 恢复进展 (刻度柱 = 2μm)。(e) frap 恢复的一半时间针对21个单元的 fret 效率进行了规划, (d) 中表示单元的点以红色突出显示。(f) 为 (e) 中相同的细胞绘制了 frap 移动分数, 以提高 fret 效率。数据最初发表在 rothenberg等人的报告中.37 , 并在这里以一种新的格式显示。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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fret-frap 方法允许直接测量力敏感蛋白动力学, 这种特性一直难以直接探测到活细胞内部。蛋白质动力学对分子负载的敏感性对蛋白质作为力传递器或传感器的功能至关重要。需要加载才能传递内部产生的和外部施加的力, 称为机械传递, 并将这些力转化为生物化学可检测的信号, 称为机械传导。然而, 负载的变化会影响蛋白质保持约束的持续时间, 因此, 蛋白质负载所花费的时间越短, 力被传递到其他蛋白质或转化为生物化学可检测信号和感知的可能性就越小。fret-frap 方法允许在更广泛的细胞环境中访问分子敏感动力学的分子尺度测量, 从而弥合分子和细胞水平之间的差距。此外, 它还允许在对细胞内或细胞外环境进行生物化学或机械干扰的同时进行这些测量。这种技术应适用于任何基于 fret 的张力传感器, 允许研究蛋白质在各种亚细胞结构和细胞外环境中的机械状态。

确保获得所需的 fret-frap 测量结果的关键步骤包括优化成像参数和执行数据分析和解释。如协议中所述, 优化成像参数是必要的, 以限制样品的光值, 同时允许区分所需的结构和动态, 并为 fret 的计算提供足够的信号强度。尽早为特定的细胞系和感兴趣的蛋白质建立这些成像参数将有助于不同实验组之间的直接比较。值得注意的是, 系统的改变, 如改变感兴趣的蛋白质或引入抑制剂, 可能会导致蛋白质定位 (从而改变信号强度) 和动态的变化。优化后的参数应能在所有实验条件下进行清晰、准确的测量。因此, 建议选择的参数并不在有用的极端端, 例如, 能够几乎区分信号和噪声。

该协议中的成像被描述为荧光显微镜和附加的 frap 激光模块, fret-frap 适用于其他成像系统。例如, 这种技术可以适用于线扫描共聚焦显微镜以及带有附加光漂白模块的纺盘共聚焦显微镜。应以类似的方式优化成像设置, 以实现足够的信噪比, 而不会造成光污染或过度的光漂白。特别是在 fret 成像方面, 需要高量子效率探测器来获得足够的信号, 以便在不引起荧光粉损伤的情况下成功地进行 fret 计算。有许多出版物描述单独的 fret 或 frap 成像使用共聚焦显微镜67,68, 69, 可用于指导 fret-frap 成像的优化。

实验结束后, 应仔细处理数据分析, 并以可重复的方式进行, 最好是自动进行。由于在漂白过多的可用蛋白质池之前, 无法在单个细胞中漂白超过2-3 个亚细胞区域, 因此这项技术的吞吐量相对有限。因此, 数据集通常在多个成像的时间内组合在一起, 需要对数据进行一致的处理。fret 和 frap 都在数据分析方面提供了挑战。fret 指数和 fret 效率测量允许对蛋白质负载进行量化。fret 指数是一种高度依赖显微镜设置的相对测量指标, 而 fret 效率测量是绝对的, 独立于显微镜设置 55,70。我们最近已经证明, 以前开发的一种使用 "三立方体" 成像的方法可以用来确定 fret 效率, 从敏化排放的测量, 通常用 fret 指数量化时使用基于 fret 的张力传感器56.如果要计算张力传感器对绝对力体验的测量,则需要测量 fret 效率。表达基于 fret 的张力传感器的细胞, 特别是高通道数的稳定单元, 可能会重新组合或降解传感器, 从而导致 fret 数据50无法使用。在计算 fret 效率 37,56时, 在计算托者与受体比率很容易发现这一点, 但使用 fret 指数可能更难检测到。当从基于 fret 的张力传感器开始时, 获取一个只有 fret 数据的大型数据集 (和 gt;50 单元) 对于感兴趣的构造来确定 fret 效率的预期范围是有帮助的。此外, 可能很难从移动性很强的结构中提取 frap 数据, 例如快速滑动或拆卸的 fa。选择结构的子群或优化细胞电镀条件以减轻这种影响有助于最大限度地减少此问题。

从概念上看, fret-frap 可以应用于任何亚蜂窝区域的任何基于 fret 的传感器, 并进行适当的优化。实际上, 可能很难捕获不在大量机械负荷下的蛋白质的力敏感动力学, 或者在几秒钟的很短的时间刻度内或在几十分钟的长时间刻度内恢复一半的蛋白质。单分子研究的结果可以指向蛋白质, 这些蛋白质可以在活细胞内证明力敏感的动力学。到目前为止, 这包括许多 fa 和 aj 蛋白13,14,15,16以及一些细胞骨架元素71,72,73。很偶然, 基于 fret 的传感器已经为其中的许多蛋白质设计了46。这些结果可以指导感兴趣的蛋白质的选择;然而, 不应该预期 fret-frap 数据会准确地反映这些单分子研究的结果。事实上, 生化调节、与其他蛋白质的相互作用以及局部细胞骨架结构可能会掩盖或改变力量对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。观察这些复杂性的能力是 fret-frap 方法的独特优势。

对细胞和感兴趣的蛋白质的操作组合可以用来阐明调节蛋白质动力学的重要因素。例如, 它可以是有益的, 有一个传感器是力不敏感的, 无论是通过删除或突变的力结合域35,74, 因为不应依赖蛋白质周转动态的力量报告的力传感器。此外, 蛋白质中其他关键结合位点或磷酸化位点的突变可以更完整地了解感兴趣的蛋白质是如何被调控的。通过细胞骨架抑制剂或通过改变基板特性 (例如细胞外基质或刚度) 对细胞或环境进行全局改变, 可以帮助确定蛋白质的力敏感动力学如何响应机械扰动。将蛋白质负载和力敏感动力学的信息与蛋白质的其他生物物理特性结合起来, 有助于建立感兴趣的蛋白质的机械状态。这可能包括亚细胞结构 75, 76 内的定位和局部蛋白-蛋白质相互作用.此外, 蛋白质可以存在于不同的构象状态中, 即使在相同的亚细胞结构中, 取决于上下文 76,77。蛋白质负载、动力学、定位和构象都可能同时受到内部产生和外部施加的力量37767879、蛋白质在力传递和机械传导中的作用。fret-frap 方法的多功能性及其与各种蛋白质和操作的潜在兼容性应能阐明体积力学、蛋白质动力学和机械敏感信号之间的相互作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家科学基金会 career 奖 (nsf-cmmi-14-5457) 以及美国心脏协会 (16grnt309919") 和国家卫生研究院 (r01gm121799-01) 颁发给 brenton hoffman 博士和一名国家机构的资助。科学基金会研究生研究奖学金颁发给卡瑟琳·罗滕贝格。内容完全由作者负责, 不一定代表 nsf 或 nih 的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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荧光技术结合测定活细胞中的力敏感蛋白动力学
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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