Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以解决潜在的使用血小板作为一个高度敏感的一氧化氮传感器在血液中。它描述了最初的血小板制备和使用亚硝酸盐和脱氧红细胞作为一氧化氮发生器。
Abstract
血小板是负责适当血液凝集的血液成分。它们的功能受到各种途径的高度调节。其中最有效的血管活性物质, 一氧化氮 (no), 也可以作为血小板聚集的强大抑制剂。血液中的直接 no 检测是非常具有挑战性的, 因为它具有高反应性与无细胞血红蛋白, 限制 no 的半衰期到毫秒的范围。目前, 干预后的 no 变化仅根据亚硝酸盐和硝酸盐 (亚硝酸盐-一氧化氮代谢途径的成员) 的测量变化进行估计。无论多么精确, 这些测量相对于实际 no 变化的情况很难解释, 因为自然基线亚硝酸盐和硝酸盐水平比 no 本身的预期变化高几个数量级。因此, 早就应该开发直接和简单的方法, 使人们能够直接检测到 no。该协议解决了血小板作为血液中高度敏感的 no 传感器的潜在用途。它描述了最初的血小板富糖血浆 (prp) 和洗血小板制剂, 以及亚硝酸盐和脱氧红细胞作为 no 发生器的使用。采用丝氨酸 239 (p-vaspserine) 法对 vasp 进行磷酸化检测。事实上, vasp 蛋白是高度表达在血小板, 它是快速磷酸化时, no 存在导致一个独特的机会, 使用这一途径直接检测血液中的 no 存在。
Introduction
血小板是从巨核细胞中提取的小圆盘状细胞碎片, 对凝血至关重要。凝血级联是由各种生物活性分子 (如胶原蛋白或 adp), 释放后的血管壁损伤。一氧化氮 (no) 在各种效应之间可以改变凝血过程。no 是由哺乳动物细胞自然产生的, 是最通用的生理信号之一。它作为一个强大的血管扩张剂, 神经递质和免疫调节剂, 仅举几例。在血液中, no 还有助于通过抑制血小板聚集来调节血液凝集的程度。在血液中 no 最可能的来源之一是亚硝酸盐, 这是一种无机离子, 已被证明是 no 的前体。与红细胞反应时, 亚硝酸盐还原为 no, 脱氧 hb 氧化为高铁血红蛋白 (methb)1。从红细胞释放的 no 是血管活性的, 并导致血管兴奋性 2。这种亚硝酸盐还原途径是一种交替的 no 生成途径, 在缺氧条件下, 通过内皮型一氧化氮合酶与经典 no 生成途径一起作用并补充该途径。
血小板本身不能将亚硝酸盐还原为 no, 但对其存在非常敏感。在完整的血小板中, 纳米摩尔范围内的 no 增加了 vasp (ec50 = 0.5 nm) 3 的 cgmp (ec50 = 10 nm)和磷酸化。因此, 血小板可以作为一个很好的传感器, 亚硝酸盐还原由 rbc 和 no 释放到血液中。有几种方法可以直接测量血小板活化的程度-如聚合和血栓弹性成像 (teg)4,5。然而, 这些方法需要昂贵的专门仪器和相当大量的材料。在从 rbc 释放 no 后, 也可以利用血小板表面蛋白表达的变化--如 p-选择素 6--来监测下游的事件.no 也被认为会增加血小板7中的 cgmp 量。以前, 我们使用 cgmp监测脱氧红细胞8还原亚硝酸盐后一氧化氮释放到血液中。这被证明是一个非常敏感的方法;然而, cgmp 是一种短命的分子, 它的检测涉及大量的劳动。另一种可能性, 在提交的协议中描述, 使用磷酸化的血管刺激荧光粉 (vasp)-蛋白检测 no 在血液中的存在。vasp 是蛋白激酶 g 活化的基础, 通过 sgccgmp 途径9与 no 相互作用时进行磷酸化。可检测的 vasp 磷酸化发生在非常低的 no 浓度下, 这可能使血小板成为血液中 no 存在的非常敏感的检测器。vasp 在血小板中表达很高, 但在其他血细胞中没有, 这使得有选择地跟踪涉及血小板10的事件。
该方案的主要目的是通过监测 vasp 磷酸化11,12, 详细描述利用其与血小板的相互作用检测全血一氧化氮释放的方法。该方法允许早期检测低 no 浓度-理论上在纳米摩尔范围内, 这使得目前的协议比 cgmp 的测定更敏感, 因为使用的标准西方印迹技术可以在大多数实验室实现设置。
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Protocol
请注意:血液样本来自国家卫生研究院血库 (irb 批准的协议:99-cc-0168)。
1. 血液样品制备
请注意:为了避免血小板活化, 慢慢抽血, 并通过多次倒置管与柠檬酸盐轻轻混合。
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富含血小板的血浆 (prp) 制备
- 用 20 g 或更大直径的针头绘制30-50 毫升的血液, 并以1:9 的比例或柠檬酸葡萄糖 (acd) (85 mm 柠檬酸三钠) 加入含有柠檬酸钠 (3.8%) 的试管中, 66.6 mm 柠檬酸, 111 mm 葡萄糖, ph 4.5), 比例为1:9。
- 将新鲜采集的全血液注入空的15毫升锥形管中。在室温下以 120 x g 离心全血10分钟。
- 用塑料转移移液器从上半部分仔细收集含有血小板 (富含血小板的血浆, prp) 的上清液。
请注意:prp 从步骤1.1.3 准备用于实验或进一步处理, 以准备清洗的血小板。离心后获得的软颗粒 (步骤 1.1.2) 含有红血球和白细胞, 可以进一步纯化以获得清洗的红血球 (rbc)--请参见步骤 1.3.实验需要在抽血后2小时内完成。在收集 prp (上清液) 时, 避免收集在 prp/rbc 界面上积累的含有脂肪的白细胞。
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洗过的血小板制备 (可选)
- 离心机在室温下以 400 x g收集 prp 10分钟。丢弃上清液并保留血小板颗粒。
- 在室温下加入5毫升 cgs 缓冲液 (120 mm 氯化钠、12.9 mm 柠檬酸三钠和 30 mL 葡萄糖, ph 6.5) 和离心机 10分钟, 轻轻清洗颗粒.
- 用3毫升改性的 ty伴随下缓冲液 (134 mm ncl, 0.34 mm nah 2 po4, 2.9 mm kcl, 12 mm nhaco3, 20 mm hepes, 1 mm mgcl2, 2 mm cicl2, 10 mm 葡萄糖 ph 7.4)。
- 用 rees ecker 溶液稀释血小板 (1:100--例如, 在990μl 的 rees-ecker 溶液中稀释10μl 的血小板), 并通过血细胞计进行计数。
- 通过添加 tyrode 缓冲液, 将血小板密度调整为 3 x10 8 cellslss/ml。
- 在开始实验前, 在37°c 下将血小板悬浮液培养1小时。
请注意:在37°c 下, 洗过的血小板稳定5-8小时。
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洗红血球 (rbc) 的制备
- 收集后, 离心机在步进中获得的软颗粒1.1.3 在 2, 500 x克, 在室温下10分钟。
- 在室温下以 2, 500 x 克离心 10分钟, 用5毫升的 pbs 离心, 将上清液丢弃, 用5毫升的 pbs 清洗 rbc 颗粒。重复此步骤3次。
- 放弃 pbs, 使用清洗的 rbc 进行进一步的实验。
2. 脱氧
- 在所需的红细胞压积中加入1毫升的 prp 混合物 (在步骤1.1.4 或1.2.4 中制备) 和 rbc (在步骤1.3 中制备), 加入用橡胶塞子关闭的聚丙烯瓶。例如, 在20% 的红细胞压积时, 将200μl 的红细胞添加到800μl 的 prp 中。
请注意:建议的血肿是从0% 到40%。不要使用玻璃瓶或烧瓶, 因为血小板粘附在玻璃表面。 - 将连接到氦气罐的针头插入密闭的瓶子, 通过插入 26 g 针使气体出口成为气体出口 (图 1)。
- 在室温下慢慢地旋转瓶子。
请注意:不要让他的气体通过血液准备泡沫。慢速气流是可取的这个做法, 和过快他的气体流动导致增加溶血。最有效的气体流动需要通过试验来确定, 因为它在很大程度上取决于实验装置的几何形状。 - 通过使用 co-oxyneter 测量部分氧气压力 (po2),定期遵循脱氧过程。
请注意:在我们手中, 10分钟的脱氧可将 rbc 还原亚硝酸盐所需的 po 2 至25毫米汞柱降低, 持续的脱氧确实进一步降低了 po2至10毫米汞柱;然而, 它导致了溶血的增加和无细胞血红蛋白的增加 (图 2)。
3. 减少红血球亚硝酸盐
- 在0.0345 克的 nno 2 中加入1毫升的 pbs (ph 7.4 ), 制成 500 mm 的亚硝酸盐库存溶液。在 pbs 中连续稀释 500 mm nno 2 至 250μm nno 2 (25x)( ph 7.4)。
- 使用微注射器, 通过隔膜将亚硝酸盐 (40μl) 注入 prp 和 rbc 的脱氧样品中, 以在样本的总1毫升中达到10μm 的最终浓度。
请注意:在本实验中, 使用的亚硝酸盐的最终浓度为10μm。 - 在37°c 下将样品孵化10分钟或更长时间。
请注意:在不同类型的实验中, 用亚硝酸盐最大还原亚硝酸盐所需的亚硝酸盐调整红细胞培养的确切持续时间。 - 将样品的塞子和移液器1毫升取出到微离心管中。
- 在室温下以 200 x g 离心3分钟。
- 从上清液的上半部分移液器300μl 的血小板悬浮液, 并与 acd (ph 6.5) 混合, 比例为1:9。丢弃 rbc 颗粒。
- 在室温下以 500 x g 离心血小板悬浮液4分钟。
- 加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒 iii (1:500) 的冰冷裂解缓冲液 (150 mm ncl, 50 mm tris, 0.5% np-40, ph 7.4) 80μl。
4. 西部空白的 vasp
- 从每个样品中装入15μg 的蛋白质, 使其达到2个分离的 10% sds-page 凝胶。
请注意:含有 b-硫醇的苛刻剥离缓冲液不能从膜中去除 p-vaspser239和 vasp 抗体;因此, p-vasp ser239和 vasp 应单独运行。 - 在 120 v 的速度运行凝胶1.30 小时, 并转移到硝化纤维素膜。
- 块非特异性与5% 无脂干奶结合。
- 用 p-vasp血清239 (1:500)、vasp (1:1000) 和 gapdh (1:1000) 在4°c 下隔夜培育膜。
- 在室温下将辣根过氧化物酶 (hrp) 二级抗体与膜培养45分钟。
- 用成像仪机公开膜, 并使用 imagej 量化带密度。
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Representative Results
静脉血液样本的 no-2值在50-80 毫米汞柱之间。氦的脱氧在10分钟内迅速降低到 2 , 2到25毫米汞柱. 脱氧时间的增加会进一步进一步降低到 o2。然而, 脱氧时间的增加也会导致无细胞血红蛋白水平的显著增加 (由 co-oxometer 确定, 在图 2中可以看到血浆的颜色越来越变红) (图 2a-b)。增加溶血与搅拌无关, 因为没有脱氧的搅拌不会引起溶血 (图 2c)。
我们发现, 在裂解样本中存在 rbc 减少了西方印迹检测到的 p-vaspser239和 vasp (图 3)。因此, 我们首先分离血小板和红细胞, 然后运行西方印迹检测 p-vaspser239在血小板中。
为了证明有足够的时间在不影响 vasp 磷酸化的情况下将红细胞分离出血小板, 我们使用了一个短命的 no 供体。proli nooate (在 37 c ph 7.4 时, 无半衰期为1.8 秒的无供体), 在血小板中迅速增加 p-vaspser239 (在孵育10秒内)。在 prp 孵育后, 由 proli nooate 诱导的 p-vasp血清239 检测 10分钟 (图 4)。
亚硝酸盐在脱氧红细胞 (po2 25 毫米汞柱) 存在的情况下, 在血小板中增加 p-vasp血清239.脱氧 rbc 的亚硝酸盐还原酶活性取决于红细胞压积, 最大影响在20% 的红细胞压积下观察到 (图 5)。
图 1: 脱氧室.将 prp 和 rbc 的混合物添加到用橡胶隔膜封闭的塑料瓶中。密闭的瓶子用针头连接到氦 (he) 线。氧气被一个小注射器针 (26g) 冲洗出来, 作为一个气体出口。
图 2: 脱氧后的部分氧压 (po2) 和无细胞血红蛋白.(a) 用血气分析仪 (n = 3) 对3、5、10、15、30和50分钟的样品进行了 prp和 rbc 样品脱氧。误差条为 sem. 用 (b) 或不含氦 (c) 搅拌 prp + rbc 样品上清液的代表性图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在不同红细胞压积下制备的 prp/rbc 样本中的代表性 vasp 西方印迹带.rbc 被添加到 prp 中 1, 5, 10, 15, 20, 40% 的红细胞压积。在 500 x g的情况下离心了5分钟的 prp + rbc 混合物, 并用裂解缓冲液进行了裂解。
图 4: 在没有供体 proli nooate后, prp 中 p-vasp ser239 和 vasp 的代表性西方印迹带。proli nooate (10m) 被添加到 prp 中, 并在37°c 下孵育10和30秒以及1、2、5、10、20和40分钟。
图 5:vaspser239磷酸化取决于 po 2 和红细胞压积水平。(a) prp + 红细胞 (20% 的红细胞压积) 脱氧到两个不同的 po2级, 40 和25毫米汞柱。在将 10 m 亚硝酸盐在 37 c 处的脱氧样品孵育10分钟后, 在0、10、20和40% 的红细胞压积 (po2 = 25 mmhg) 中加入脱氧 prp + rbc 后, 测定了 p-vasp ser239 和 vasp.对于每个红细胞压积值,相对于对照计算折叠增加 (p-vasp ser239)。错误栏 = sem. 请点击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
由于血小板很容易被激活, 因此需要温和地处理含有血小板的样品。应避免快速移液和剧烈晃动。血小板抑制剂如前列腺素 (pgi2) 可用于防止血小板活化;然而, 这可能会影响血小板内的一些信号通路。在血小板悬浮液中加入 acd, 采用低速离心法制备血小板颗粒。
prp 中新鲜配制的血小板的寿命有限, 最长可达2小时。为了实现高重现性, 所有实验应只在新鲜血小板和血液采集后2小时内进行。所提供的数据是用 prp 中的血小板获得的, 它被认为比洗涤血小板具有更多的生理特性。虽然清洗血小板的寿命和纯度增加, 但在制备洗涤血小板过程中反复离心会导致血小板的自发活化, 这可能导致血小板制剂质量不一致。prp 比洗过的血小板更受欢迎, 因为手术速度更快, 进一步处理可以激活血小板。然而, 在特定情况下, 当血浆血液凝集因子的干扰可能会干扰实验设置时, 清洗血小板代表的解决方案, 以避免这些问题。
脱氧样品中的氧气污染是该检测的最重要的关键步骤。在添加到 prp 之前, 可以将 rbc 汇集并脱氧。然而, 转移脱氧的红细胞增加了氧气污染的风险。此外, 浓缩红细胞的脱氧需要比在所需的红细胞压积下完全准备的脱氧需要更多的时间, 而更长时间接触 he 气体会导致无细胞血红蛋白水平的增加。虽然无细胞血红蛋白可以从脱氧的 rbc 中排出, 但用于洗涤的磷酸盐缓冲液盐水或其他缓冲液必须小心脱氧, 以防止离心过程中的氧气污染。为了缩短制备工艺, 避免不必要的氧污染, 首先在所需的红细胞压积下制备每个 prp + rbc 样品, 然后在添加亚硝酸盐之前进行脱氧。
要量化 p-vaspser239的西方印迹, rbc 必须从血小板中分离出来。vasp 在 rbc13中表示, 但与血红蛋白相比, 水平并不显著, 比血小板低得多。由于总蛋白质浓度用于西方印迹中的负载控制, 溶酶样品中 rbc 的存在会干扰西方印迹的 p-vasp 和 vasp 测量。由于血小板14中磷酸酶脱磷酸的速度较慢, p-vasp 持续 10分钟 (图 4), 因此在收集血小板细胞裂解物之前, 可以通过离心分离红细胞。
vasp 磷酸化的 ec50几乎比峰值 cgmp 增加的 ec50低一个数量级, 分别为 0.5 nm 和 9 nm 3, 这使得 vasp 磷酸化是检测存在的最敏感的方法之一。低数量的 no。然而, vasp 磷酸化曲线对 no 的响应是钟形的;在 no-3的 3-30 nm 峰值后, 磷酸化下降。这种对 no 浓度增加的非线性响应使得 vasp 不适合严格的 no 定量。
由于 prp 中的血小板寿命较短, 因此必须在抽血后2小时内在新鲜血小板中进行检测。脱氧后的 o 2 水平不一致, 因为样品的脱氧取决于氦气体的流速和瓶子的旋转率。因此, 脱氧的时间需要通过试验来确定。对于西方印迹对 p-vasp 的测量, 抗体的选择至关重要, 需要使用直接 no 供体作为阳性对照来检查特异性。除 no 外, 血小板中的 p-vasp血清239 还可通过抑制磷酸酯酶和激活蛋白激酶 a 途径进行磷酸化处理。
p-vasp血清 239的测定比 cgmp 法具有一定的优势。血小板中的 cgmp 半衰期很短 (小于 10秒), cgmp 的测量需要添加磷酸二酯酶抑制剂3。此外, cgmp 测量使用相当昂贵的 elisa 技术。vasp 可以简单地通过内部西方印迹协议来测量, 因此更容易获得。
通过体内吸入亚硝酸盐, 成功地将血小板中的 p-vsp血清 239作为 no 生成的传感器 6.因此, 我们证明, 有可能使用 p-vasp血清239 在血小板中作为在体外和体内产生 no 的标志, 并可能在各种其他情况下。异常低的 ec50使这种方法成为检测血液中存在非常低的 no 浓度的绝佳选择。因此, 该方案提供了一种可能性, 研究 no 在血液中的各种生理刺激, 如在凝血级联, 增加纯粹的压力或增加炎症。
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Disclosures
alan schechter 博士被列为向国家卫生研究院颁发的几项使用亚硝酸盐治疗心血管疾病的专利的共同发明者。他根据国家卫生研究院为临床开发发放的这些专利获得版税, 但没有其他补偿。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生研究院向艾伦·施切特博士提供的校内赠款资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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