Summary
Nous présentons ici un protocole pour répondre à l’utilisation potentielle des plaquettes comme un capteur très sensible l’oxyde nitrique dans le sang. Il décrit la préparation de plaquettes initial et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés comme générateurs de l’oxyde nitrique.
Abstract
Les plaquettes sont les responsables de la coagulation sanguine correcte des composants sanguins. Leur fonction est fortement réglementée par diverses voies. Un des plus puissants agents vasoactifs, oxyde nitrique (NO), peut aussi agir comme un puissant inhibiteur de l’agrégation plaquettaire. Direct, aucun détection dans le sang n’est très difficile en raison de sa forte réactivité avec hémoglobine acellulaire qui ne limite aucun Half-Life à la gamme de milliseconde. Actuellement, aucun changement après que des interventions sont estimées uniquement ne basée sur les changements mesurés de nitrite et de nitrate (membres de la voie métabolique nitrate-nitrite-pas). Précise toutefois, ces mesures sont assez difficiles à n’interpréter par rapport aux réelles aucune modification, en raison de la nitrite de base élevées naturellement et concentrations qui sont de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que des changements attendus pas elle-même de nitrates. Par conséquent, le développement de méthodes simples et directs qui permettraient de détecter directement les N° est depuis longtemps. Ce protocole vise une utilisation potentielle des plaquettes comme une très sensible sans capteur dans le sang. Elle qualifie plasma riche en plaquettes initial (PRP) et préparations des plaquettes lavées et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés de pas générateurs. La phosphorylation de la VASP à sérine 239 (P-VASPSer239) est utilisée pour détecter la présence de no Le fait que la protéine VASP est fortement exprimée dans les plaquettes et qu’il est phosphorylé rapidement lorsqu’il est présent conduit à une occasion unique d’utiliser cette voie pour ne détecter directement aucune présence dans le sang.
Introduction
Les plaquettes sont des fragments de petites cellules discoïdes dérivés de mégacaryocytes qui sont cruciaux pour la coagulation du sang. La cascade de coagulation est initiée par diverses molécules bioactives (comme le collagène ou ADP), publiés après la blessure de la paroi vasculaire. La processus de coagulation peut être modifiée, parmi divers effecteurs de l’oxyde nitrique (NO). Non, produite naturellement par les cellules de mammifères, est l’un des signaux physiologiques plus polyvalents. Il agit comme un puissant vasodilatateur, le neurotransmetteur et le modulateur immunitaire, pour n’en nommer que quelques-uns de ses nombreuses fonctions. Dans la circulation sanguine, donc aussi aide à réguler l’étendue de la coagulation sanguine en inhibant l’agrégation plaquettaire. Une des sources plus probables du NO dans la circulation sanguine est nitrite, un ion inorganique qui a été établi pour servir de précurseur de no Réagissant avec les globules rouges (hématies), nitrite est réduit à N° et deoxyHb est oxydé en méthémoglobine (metHb)1. N° libéré des globules rouges est vasomoteur et provoque la vasorelaxation2. Cette voie de réduction de nitrite n’est un autre aucune voie de génération, agissant conjointement avec et en ne complétant la classique aucun chemin de génération par endothélial d’oxyde nitrique synthase, à des conditions d’hypoxie.
Les plaquettes eux-mêmes ne sont pas en mesure de réduire le nitrite en NO mais sont très sensibles à sa présence. Dans les plaquettes intactes, non dans le nanomolaires gamme augmente cGMP (EC50 = 10 nM) et la phosphorylation de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Dès lors, les plaquettes peuvent servir comme un excellent capteur de réduction des nitrites par les globules rouges et aucun rejet dans le sang. Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer directement la mesure de l’activation plaquettaire - tels qu’aggregometry et thromboélastographie (TEG)4,5. Cependant, ces méthodes nécessitent des instruments spécialisés coûteux et assez grandes quantités de matériel. Il est également possible de surveiller les événements en aval, après on ne se détache de globules rouges, en utilisant les changements dans l’expression de la protéine de surface plaquettaire – comme la P-sélectine6. N’est également connu pour augmenter la quantité de GMPC dans les plaquettes7. Auparavant, nous avons utilisé des cGMP pour ne suivre aucun rejet dans le sang après réduction des nitrites par désoxygéné RBC8. Cela s’est avéré pour être une méthode très sensible ; Cependant, cGMP est une molécule de courte durée et sa détection implique une vaste main de œuvre. Une autre possibilité, décrite dans le protocole présenté, utilise la phosphorylation de la phospho stimulée par vasodilatateur (VASP)-protéine pour détecter la présence de NO dans le sang. VASP est un substrat de l’activation de protéine kinase G, qui est phosphorylé lors de l’interaction avec les N° à la voie CGT/GMPC9. Détectable phosphorylation VASP se produit à très faible NO concentrations, ce qui pourraient faire de plaquettes un détecteur très sensible d’aucune présence dans le sang. VASP est fortement exprimée dans les plaquettes, mais pas dans les autres cellules sanguines, qui permet de suivre sélectivement les événements impliquant les plaquettes10.
Le principal objectif du présent protocole est de décrire la méthode dans le détail pour la détection d’aucune libération dans le sang entier à l’aide de son interaction avec les plaquettes en surveillant VASP phosphorylation11,12. La méthode décrite ne permet la détection précoce de faible aucune concentration - théoriquement dans la gamme nanomolar qui rend le présent protocole plus sensible que la détermination de cGMP, en raison de l’utilisation de techniques de transfert Western standard réalisables dans la plupart de laboratoire Paramètres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque : Des échantillons de sang ont été prélevés à la banque de sang de NIH (CISR a approuvé le protocole : 99-CC-0168).
1. préparation des échantillons de sang
Remarque : Pour éviter l’activation plaquettaire, prélever du sang lentement et mélanger doucement avec du citrate en renversant le tube plusieurs fois.
-
Préparation de plasma riche en plaquettes (PRP)
- Dessiner des 30 à 50 mL de sang à l’aide d’un 20 G ou plus gros diamètre aiguille et ajouter dans un tube contenant du citrate de sodium (3,8 %) dans un ratio de 1:9 ou dextrose citrate acide (ACD) (citrate trisodique 85 mM, 66,6 mM acidecitrique, 111 mM de glucose, pH 4,5) dans un rapport de 1:6.
- Aliquote 5 mL de sang fraîchement prélevé dans des vides tubes coniques 15 mL. Centrifuger le sang total à 120 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Soigneusement, recueillir le surnageant contenant les plaquettes (plasma riche en plaquettes, PRP) de la partie supérieure par une pipette en plastique.
Remarque : PRP de l’étape 1.1.3 est prêt à être utilisé dans des expériences ou pour un traitement ultérieur pour préparer les laver plaquettes. Le pellet mou obtenu après centrifugation (étape 1.1.2) contient des globules rouges et les globules blancs et peut être encore purifié pour obtenir lavé des globules rouges (RBC) — voir étape 1.3. L’expérience doit être fini à moins de 2 h après avoir dessiné le sang. Lors de la collecte des PRP (surnageant), éviter la collection de buffy coat contenant leucocytes accumulés sur l’interface PRP/RBC.
-
Préparation de plaquettes lavées (facultatif)
- Centrifugeuse recueillies PRP à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et garder les granules plaquettaires.
- Laver délicatement les boulettes en ajoutant 5 mL de tampon CGS (120 mM NaCl, 12,9 mM trisodium citrate et 30 mM de glucose, pH 6,5) et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les granules plaquettaires avec 3 mL de tampon de Tyrode modifiée (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 millimètres glucose pH 7,4).
- Diluer les plaquettes (1/100 — comme exemple, 10 µL de plaquettes en 990 µL de solution de Rees-Ecker) avec la solution de Rees Ecker et comte de hémocytomètre.
- Ajuster la densité des plaquettes à 3 x 108 cellules/mL en ajoutant Tyrode tampon.
- Incuber la suspension de plaquettes à 37 ° C pendant 1 h avant de commencer l’expérience.
Remarque : Plaquettes lavées sont stables pendant 5 – 8 h à 37 ° C.
-
Préparation des globules rouges lavés (RBC)
- Après le prélèvement, centrifuger le culot doux, obtenu à l’étape 1.1.3 à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et laver le culot de RBC avec 5 mL de PBS par centrifugation à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape pour 3 fois.
- Jeter les PBS et globules rouges lavés pour d’autres expériences.
2. désoxygénation
- Ajouter 1 mL du mélange de PRP (préparé à l’étape 1.1.4. ou 1.2.4.) et de globules rouges (préparés à l’étape 1.3.) à l’hématocrite désiré dans un biberon en polypropylène fermé avec un bouchon en caoutchouc. Par exemple, à hématocrite de 20 %, ajouter 200 µL d’hématies à 800 µL de PRP.
Remarque : Suggérées : hématocrite de 0 % jusqu'à 40 %. Ne pas utiliser un ballon ou une bouteille en verre comme les plaquettes adhèrent à la surface du verre. - Insérer l’aiguille reliée au réservoir de gaz d’hélium dans la bouteille fermée et prendre la sortie de gaz en insérant une aiguille 26 G (Figure 1).
- Lentement, agiter le flacon à température ambiante.
Remarque : Ne laissez pas les gaz He à bouillonner à travers la préparation. Débit de gaz lente est préférable pour cette procédure, et trop rapide débit de gaz qu’il mène à l’hémolyse accrue. Le débit de gaz plus efficace doit être déterminée par essai, car elle dépend fortement de la géométrie de l’installation expérimentale. - Périodiquement, suivez le processus de désoxygénation en mesurant la pression partielle d’oxygène (pO2) à l’aide d’un oxymètre.
Remarque : Dans nos mains, 10 min de désoxygénation diminue pO2 à 25 mm de Hg qui est requise pour la réduction des nitrites par RBCs. continuant de désoxygénation réduisit encore pO2 à 10 mm Hg ; Cependant, il a conduit à l’hémolyse accrue et augmentation de l’hémoglobine acellulaire (Figure 2).
3. globules rouges Nitrite réduction
- Ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4) en 0,0345 g de NaNO2 pour faire la solution mère de 500 mM de nitrite. Diluer 500 mM NaNO2 à 250 µM NaNO2 (x 25) par dilutions dans du PBS (pH 7,4).
- À l’aide d’une microseringue, injecter des nitrites (40 µL) à travers le septum dans l’échantillon désoxygéné de PRP et globules rouges pour obtenir la concentration finale de 10 µM total 1 ml d’échantillon.
Remarque : Dans cette expérience, les concentrations finales des nitrites utilisés est 10 µM. - Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 10 min ou plus.
Remarque : Ajuster la durée exacte d’incubation RBC avec nitrite nécessaire à la réduction des nitrites maximale pour différents types d’expériences. - Retirez le bouchon et la pipette 1 mL de l’échantillon dans un tube de microcentrifuge.
- Centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Distribuer 300 µL de la suspension de plaquettes de la partie supérieure du liquide surnageant et mélanger avec l’ACD (pH 6,5) dans un rapport de 1:9. Jeter le culot de RBC.
- Centrifuger la suspension de plaquettes à 500 x g pendant 4 min à température ambiante.
- Ajouter 80 µL de tampon de lyse glacee (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5 % NP-40, pH 7,4) pastilles de cocktail III (1/500) pour les plaquettes contenant des inhibiteurs de la protéase.
4. Immunobuvardage de VASP
- 15 µg de la protéine de la charge de chaque échantillon à 2 gels de SDS-PAGE 10 % distincts.
Remarque : Tampon de décapage sévère, qui contient le b-mercaptoéthanol, impossible de supprimer P-VASPSer239 et VASP anticorps de la membrane ; par conséquent, la P-VASP Ser239 et VASP doivent être analysés séparément. - Exécuter les gels à 120 V pour 1 h 30 et le transfert de la membrane de nitrocellulose.
- Bloc non-spécifiques avec 5 % de lait écrémé.
- Incuber la membrane avec P-VASPSer239 (1/500), VASP (1:1, 000) et GAPDH (1:1, 000) pour la nuit à 4 ° C.
- Incuber les anticorps secondaire de raifort peroxydase de raifort (HRP) avec la membrane pendant 45 min à température ambiante.
- Exposer la membrane avec un appareil imageur et quantifier la densité de la bande à l’aide de ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Échantillons de sang veineux ont des valeurs de2 pO entre 50-80 mmHg. Désoxygénation de hélium diminue rapidement pO2 à 25 mmHg dans 10 min. accrue désoxygénation temps un peu plus loin des diminutions pO2. Cependant, augmentation du temps de désoxygénation conduit également à des niveaux sensiblement accrus d’hémoglobine acellulaire (déterminé par co-oxymétrie, vu visuellement sur la Figure 2 que la coloration rouge de plus en plus du plasma) (Figure 2 aet B). Hémolyse accrue n’est pas associée à remuer car agitation sans désoxygénation n’induit pas d’hémolyse (Figure 2).
Nous avons trouvé que la présence de globules rouges dans les échantillons lysés diminue P-VASPSer239 et VASP détectés par Western Blot (Figure 3). Par conséquent, nous séparons tout d’abord les plaquettes et les globules rouges avant d’exécuter des transferts Western pour détecter P-VASPSer239 dans les plaquettes.
Pour montrer qu’il y a assez de temps pour séparer les globules rouges de plaquettes sans affecter la phosphorylation VASP, nous avons n’utilisé un éphémère aucun donneur. PROLI NONOate (aucun donneur avec demi-vie de 1,8 s à 37 C pH 7,4), rapidement augmenté P-VASPSer239 dans les plaquettes (moins de 10 s d’incubation). P-VASPSer239 induite par PROLI NONOate est détecté pendant 10 min après l’incubation avec PRP (Figure 4).
Nitrite augmente P-VASPSer239 dans les plaquettes en présence de globules rouges désoxygénés (pO2 25 mmHg). L’activité de la nitrite réductase de globules rouges désoxygénés repose sur l’hématocrite et l’effet maximal est observé à hématocrite de 20 % (Figure 5).
Figure 1 : chambre de désoxygénation. Mélange des PRP et des globules rouges est ajouté dans une bouteille en plastique fermée avec un septum en caoutchouc. La fiole fermée est relié à la ligne de l’hélium (He) à l’aide d’une aiguille. L’oxygène est évacué par une aiguille de seringue petit (26 G) agissant comme une sortie de gaz.
Figure 2 : La pression partielle d’oxygène (pO2) et hémoglobine acellulaire après désoxygénation. Échantillons PRP (A) et les globules rouges ont été désoxygénés pour 3, 5, 10, 15, 30 et 50 min. pO2 des échantillons ont été mesurés par l’analyseur de gaz de sang (n = 3). Barres d’erreur sont a photos représentant SEM. du liquide surnageant d’échantillons PRP + RBCs remué avec (B) ou sans hélium (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : bandes de tache représentant VASP occidental dans les échantillons de PRP/globules rouges préparées à différents hématocrite. Globules rouges ont été ajoutés en PRP à 1, 5, 10, 15, 20, 40 % hématocrite. Mélanges de PRP + globules rouges ont été centrifugés à 500 g pendant 5 min et lysées avec tampon de lyse.
Figure 4 : représentant Western blot bandes P-VASPSer239 et VASP en PRP après exposition à aucun donneur PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) a été ajouté en PRP et incubé à 37 ° C pendant 10 à 30 s et 1, 2, 5, 10, 20 et 40 min.
Figure 5 : Phosphorylation VASPSer239 dépend des niveaux2 et de l’hématocrite pO. (A) PRP + de globules rouges (hématocrite de 20 %) étaient désoxygéné à deux niveaux de2 pO différents, 40 et 25 mmHg. P-VASPSer239 et VASP ont été mesurées après l’incubation des échantillons désoxygénés avec nitrite de 10 M à 37 ° C pendant environ 10 minutes (B) Nitrite (10 M) a été ajouté dans désoxygéné PRP + globules rouges à 0, 10, 20 et 40 % hématocrite (pO2 = 25 mmHg). Pli a augmenté (P-VASPSer239) a été calculé par rapport au témoin (PRP + globules rouges sans nitrite) pour chaque valeur de l’hématocrite. Barres d’erreur = SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Étant donné que les plaquettes sont facilement activées, douce manipulation plaquettes contenant des échantillons est nécessaire. Rapide de pipetage et secouant vigoureux doivent être évités. Plaquettaires tels que de la prostacycline (PGI2) peuvent être utilisés pour prévenir l’activation des plaquettes ; Toutefois, cela pourrait affecter certaines voies de signalisation à l’intérieur des plaquettes. Pour la préparation de boulettes de plaquettes, nous ajouter ACD pour les suspensions de plaquettes et centrifugation à faible vitesse.
Plaquettes fraîchement préparées en PRP ont une durée limitée s’étendent, jusqu'à 2 h. Pour atteindre la grande reproductibilité, toutes les expériences devraient être effectués uniquement avec plaquettes fraîches et moins de 2 h après prélèvement sanguin. Les données présentées ont été obtenues avec les plaquettes en PRP, qui est considéré comme plus physiologique que des plaquettes lavées. Bien que la durée de vie et de la pureté augmentent pour plaquettes lavées, centrifugation répétée pendant la préparation des plaquettes lavées peut conduire à leur activation spontanée et cela peut entraîner une qualité inégale des préparations de plaquettes. PRP est préféré à plaquettes lavées car la procédure est plus rapide et la manipulation de la friteuse peut activer des plaquettes. Toutefois, dans certains cas, lorsque l’intervention de facteurs de coagulation plasmatique pourrait interférer avec le montage expérimental, plaquettes de lavage représente solution pour éviter ces problèmes.
Contamination d’oxygène dans les échantillons désoxygénés est l’étape la plus importante critique avec ce test. Globules rouges peuvent être mis en commun et désoxygénés avant d’être ajouté à la PRP. Cependant, transférer les globules rouges désoxygénés augmente le risque de contamination de l’oxygène. En outre, désoxygénation des globules rouges concentrés nécessite plus de temps que la désoxygénation de la préparation complète à l’hématocrite désirée, et une exposition plus longue à gaz qu’il conduit à des niveaux accrus d’hémoglobine acellulaire. Bien que l’hémoglobine acellulaire peut être lavé de globules rouges désoxygénés, la saline de tampon phosphate ou autres tampons utilisés pour le lavage doivent être soigneusement désoxygénés pour prévenir la contamination d’oxygène pendant la centrifugation. Pour raccourcir le processus de préparation et éviter toute contamination d’oxygène inutiles, chaque échantillon PRP + globules rouges a été préparé à l’hématocrite souhaité tout d’abord et puis désoxygéné avant l’ajout de nitrites.
Afin de quantifier P-VASPSer239 par Western blot, globules rouges doivent être séparés par les plaquettes. VASP est exprimée en globules rouges13, mais les niveaux sont non significatives par rapport à l’hémoglobine et beaucoup plus faible que dans les plaquettes. Étant donné que la concentration en protéines est utilisée pour le chargement des contrôles dans le transfert de Western, la présence de globules rouges dans les échantillons de lysats interfère avec P-VASP et mesure VASP Western Blot. En raison d’un rythme lent de déphosphorylation par enzymes phosphatase en plaquettes14, P-VASP est maintenue pendant 10 min (Figure 4) et par conséquent, il est possible de séparer les globules rouges par centrifugation avant de recueillir des lysats de cellules de plaquettes.
L’EC50 pour la phosphorylation VASP est presque un ordre de grandeur plus faible que l’EC50 pour augmenter le cGMP pic, 0,5 nM et 9 nM, respectivement3, qui en fait une des méthodes plus sensibles pour détecter la présence de la phosphorylation de VASP de faibles quantités de no Cependant, la courbe de la phosphorylation de VASP en réponse à NO est en forme de cloche ; Après avoir culminé à 3-30 nM de3, on observe une diminution de la phosphorylation. Cette réponse non linéaire à aucun concentrations croissantes rend VASP impropres à être rigoureux aucune quantification.
Plaquettes en PRP ayant une courte durée de vie, l’essai doit être fait dans les plaquettes fraîches dans les 2 h après prélever le sang. On trouvera l’incohérence des niveaux2 pO après la désoxygénation puisque la désoxygénation des échantillons dépend du débit de gaz d’hélium et les taux d’agitant le flacon. Le temps de désoxygénation doit donc être déterminée par essai. Pour la mesure des P-VASP par transfert Western, le choix de l’anticorps est critique, et on a besoin de n’utiliser un direct aucun donneur comme témoin positif pour vérifier la spécificité. En plus de n, P-VASPSer239 dans les plaquettes peut être phosphorylée par l’inhibition des enzymes phosphodiesterease et l’activation de la protéine kinase une voie.
La mesure de la P-VASPSer239 a certains avantages par rapport aux cGMP dosage. GMPC dans les plaquettes a une demi-vie très courte (moins de 10 s) et la mesure de cGMP nécessite l’ajout de l' inhibiteur de phosphodiestérase3. En outre, la mesure de cGMP utilise une technique de ELISA assez cher. VASP peut être mesurée simplement par un protocole interne Western blot et est donc plus accessible.
Augmentation P-VASPSer239 dans les plaquettes a été utilisé avec succès comme un capteur pour aucune génération de nitrite inhalé en vivo6. Par conséquent, nous avons montré qu’il est possible d’utiliser P-VASPSer239 dans les plaquettes comme marqueur d’aucune production in vitro et in vivo dans le sang et, éventuellement, dans des situations différentes. L’inhabituellement faible EC50 rend cette méthode un excellent candidat pour ne détecter la présence de très faibles aucune concentration dans le sang. Par conséquent, ce protocole prévoit une possibilité de n’étudier aucune génération dans le sang à divers stimuli physiologiques, comme au cours de la cascade de coagulation de sang, augmentation du stress pure ou augmente l’inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Le Dr Alan Schechter est répertorié comme un co-inventeur sur plusieurs brevets délivrés à la National Institutes of Health, pour l’utilisation de sels de nitrite pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Il reçoit des redevances basées sur l’autorisation de NIH de ces brevets pour le développement clinique, mais aucune autre forme de rémunération.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par bourse intra-muros NIH au Dr Alan N. Schechter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
