Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para abordar o potencial uso de plaquetas como um sensor altamente sensível de óxido nítrico no sangue. Ele descreve a preparação inicial de plaquetas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio como geradores de óxido nítrico.
Abstract
As plaquetas são os componentes do sangue responsáveis pela coagulação do sangue. Sua função é altamente regulada por vários caminhos. Um dos mais potentes agentes vasoativas, óxido nítrico (NO), também pode atuar como um potente inibidor da agregação plaquetária. Direto não detecção no sangue é muito desafiador devido à sua alta reatividade com hemoglobina livre celular que não limita nenhum Half-Life para o intervalo em milissegundos. Atualmente, nenhuma alteração após intervenções são apenas estimadas baseado no medido mudanças de nitritos e nitratos (membros da via metabólica de nitrato-nitrito-não). No entanto preciso, as medidas são um pouco difícil de interpretar vis a vis um real sem alterações, devido a nitrito de base naturalmente elevada e nitrato de níveis que são várias ordens de magnitude maior do que esperado mudanças sem si. Portanto, o desenvolvimento de métodos simples e diretos que permita um para detectar não diretamente está muito atrasado. Este protocolo aborda um potencial uso de plaquetas como um altamente sensível sem sensor no sangue. Como não geradores descreve plasma rico de inicial de plaquetas (PRP) e preparações de plaquetas lavadas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio. Fosforilação da VASP em serina 239 (P-VASPSer239) é usada para detectar a presença de n º. O fato de que a proteína da VASP é altamente expresso em plaquetas e que é rapidamente fosforilada quando não está presente leva a uma oportunidade única de usar esta via para detectar diretamente sem a presença de sangue.
Introduction
As plaquetas são fragmentos de células pequenas em forma de disco, derivados de megacariócitos que são cruciais para a coagulação do sangue. A cascata de coagulação é iniciada por várias moléculas bioativas (como colágeno ou ADP), lançadas após a lesão da parede vascular. O processo de coagulação do sangue pode ser modificado, entre vários efetores pelo óxido nítrico (NO). Não, naturalmente produzido por células de mamíferos, é um dos mais versáteis sinais fisiológicos. Ele age como um potente vasodilatador e neurotransmissor modulador imune, para citar algumas das suas múltiplas funções. Na corrente sanguínea, também não ajuda a regular o grau de coagulação do sangue inibindo a agregação plaquetária. Dentre as fontes mais prováveis de não na corrente sanguínea é o nitrito, um íon inorgânico que tem sido mostrado para servir como um precursor do n. º Reagindo com glóbulos vermelhos (hemácias), o nitrito é reduzido a n e deoxyHb é oxidado a metahemoglobina1. Não lançado de hemácias é vasoativas e faz com que vasorrelaxamento2. Esta via de redução de nitrito não é uma alternativa pathway nenhuma geração, atuando junto com e não complementando a clássica nenhum caminho de geração pela endotelial de óxido nítrico sintase em condições de hipóxicos.
As plaquetas se não são capazes de reduzir o nitrito em não, mas são muito sensíveis à sua presença. Em plaquetas intactas, não no nanomolar gama aumenta GMPc (CE50 = 10 nM) e fosforilação da VASP (CE50 = 0,5 nM)3. Portanto, as plaquetas podem servir como um excelente sensor de redução de nitrito por hemácias e liberação no sangue. Existem vários métodos que podem diretamente a medir o grau de Ativação plaquetária - como aggregometry e tromboelastografia (TEG)4,5. No entanto, estes métodos requerem instrumentação especializada cara e prefere grandes quantidades de material. Também é possível monitorar eventos a jusante, depois não é liberada de hemácias, usando as mudanças na expressão de proteínas de superfície de plaquetas – como P-selectina6. Não é também conhecida por aumentar a quantidade de cGMP em plaquetas7. Anteriormente, nós costumávamos cGMP monitorar sem libertação no sangue após a redução de nitrito por venoso RBC8. Isto provou para ser um método muito sensível; no entanto, cGMP é uma molécula de curta duração, e a sua detecção envolve extensa do trabalho. Outra possibilidade, descrita o protocolo apresentado, usa fosforilação do phospho vasodilatador-estimulada (VASP)-proteína para detectar a presença de n no sangue. VASP é um substrato de ativação de proteína quinase G, que é fosforilada mediante a interação com n através do sGC/cGMP via9. Detectável fosforilação VASP ocorre sem nenhum muito baixa concentrações, que poderiam fazer um detector muito sensível de nenhuma presença a plaquetas no sangue. VASP é altamente expresso em plaquetas, mas não em outras células do sangue, que permite seguir seletivamente os eventos envolvendo plaquetas10.
O objetivo principal do presente protocolo é descrever o método em detalhes para a detecção de liberação no sangue inteiro usando sua interação com as plaquetas, monitorando a VASP fosforilação11,12. O método descrito permite detecção precoce de baixa sem concentrações - teoricamente na faixa nanomolar que torna o presente protocolo mais sensível do que a determinação de cGMP, devido ao uso de técnicas de padrão ocidental do borrão realizáveis em laboratório a maioria dos Configurações.
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Protocol
Nota: Amostras de sangue foram obtidas do banco de sangue do NIH (IRB aprovado protocolo: 99-CC-0168).
1. preparação da amostra sangue
Nota: Para evitar a ativação plaquetária, tirar sangue lentamente e misture suavemente com citrato o tubo várias vezes por inversão.
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Preparação do plasma rico em plaquetas (PRP)
- Desenhar a 30-50 mL de sangue usando um 20g ou agulha de diâmetro maior e adicionar a um tubo contendo citrato de sódio (3.8%) em uma proporção de 1:9 ou citrato ácido dextrose (ACD) (citrato trissódico 85mm, ácido cítrico de 66,6 mM, glicose 111 mM, pH 4.5) na proporção de 1:6.
- Alíquota 5 mL de sangue recém coletado em vazios tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar o sangue total em 120 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Cuidadosamente, recolha o sobrenadante contendo as plaquetas (plasma rico em plaquetas, PRP) de parte superior de uma pipeta de transferência plástico.
Nota: PRP da etapa 1.1.3 está pronto para uso em experimentos ou para processamento adicional preparar lavou as plaquetas. A pelota macia obtida após centrifugação (etapa 1.1.2) contém glóbulos vermelhos e glóbulos brancos e pode ainda ser purificada para obter lavadas células vermelhas do sangue (RBC) — ver etapa 1.3. O experimento precisa ser terminado até 2 horas depois de tirar sangue. Ao coletar a PRP (sobrenadante), evite a coleção de buffy casaco contendo leucócitos acumulado na interface do PRP/RBC.
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Preparação de plaquetas lavadas (opcional)
- Centrífuga coletadas PRP em 400 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e manter as pelotas de plaquetas.
- Lave delicadamente as pelotas pela adição de 5 mL de tampão CGS (120 mM de NaCl, glicose de citrato e 30mm trissódico 12,9 mM, pH 6,5) e centrifugar a 400 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Resuspenda as pelotas de plaquetas com 3 mL de tampão de Tyrode modificado (134 mM de NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12mm NaHCO3, 20mm HEPES, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2, pH de glicose 10 mM 7.4).
- Diluir as plaquetas (1: 100 — como exemplo, 10 µ l de plaquetas em 990 µ l da solução de Rees-Ecker) com solução de Rees Ecker e contagem por hemocytometer.
- Ajuste a densidade de plaquetas de 3 x 108 células/mL pela adição de buffer de Tyrode.
- Incube a 37 ° C, durante 1 h a suspensão de plaquetas antes de iniciar o experimento.
Nota: As plaquetas lavadas são estáveis durante 5 – 8 h a 37 ° C.
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Preparação de glóbulos vermelhos lavados (RBC)
- Após a coleta, centrifugar a pelota macia obtida na fase 1.1.3 a 2.500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento de RBC com 5 mL de PBS por centrifugação a 2.500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita esta etapa para 3 vezes.
- Descartar a PBS e usar hemácias lavadas para novas experiências.
2. Desoxigenação
- Adicione 1 mL da mistura de PRP (preparado na etapa 1.1.4. ou 1.2.4.) e hemácias (preparadas na etapa 1.3.) no hematócrito desejado em um frasco de polipropileno fechado com uma rolha de borracha. Por exemplo, em 20% do hematócrito, adicione 200 µ l de hemácias a 800 µ l de PRP.
Nota: Sugeriu hematócritos estão entre 0% e até 40%. Não utilize um frasco de vidro ou balão como plaquetas aderem à superfície de vidro. - Insira a agulha conectada ao tanque de gás hélio para a garrafa fechada e fazer a saída de gás através da inserção de uma agulha 26G (Figura 1).
- Lentamente, agite a garrafa à temperatura ambiente.
Nota: Não permitir que o gás a borbulhar através de preparação de sangue. Fluxo de gás lento é preferível para este procedimento, e excessivamente rápido fluxo de gás leva à hemólise aumentada. O mais eficiente fluxo de gás deve ser determinado pelo julgamento, como altamente depende da geometria da instalação experimental. - Periodicamente, acompanhar o processo de Desoxigenação medindo a pressão parcial de oxigênio (pO2) usando um CO-oxímetro.
Nota: Em nossas mãos, 10 min de Desoxigenação diminui pO2 a 25 mmHg, que é necessário para a redução de nitrito por hemácias. continuando Desoxigenação reduzir ainda mais pO2 a 10 mmHg; no entanto, levou a hemólise aumentada e aumento da hemoglobina livre de células (Figura 2).
3. células vermelhas do sangue redução de nitrito
- Adicione 1 mL de PBS (pH 7,4) num 0,0345 g de NaNO2 para fazer 500 mM solução estoque de nitrito. Dilua 500 mM NaNO2 a 250 µM NaNO2 (x 25) de diluição serial em PBS (pH 7,4).
- Usando uma microsseringa, injete nitrito (40 µ l) através do septo a amostra venoso de PRP e hemácias para alcançar concentrações finais de 10 µM em total 1 mL da amostra.
Nota: Neste experimento, as concentrações finais de nitrito usado é de 10 µM. - Incube a amostra a 37 ° C durante 10 min ou mais.
Nota: Ajuste a duração exata de incubação RBC com nitrito necessário para redução de nitrito máxima para diferentes tipos de experimentos. - Remova o bujão e Pipetar 1 mL da amostra para um tubo de microcentrifugadora.
- Centrifugar a 200 x g durante 3 min à temperatura ambiente.
- Pipetar 300 µ l da suspensão de plaquetas da porção superior do líquido sobrenadante e misturar com ACD (pH 6,5) na proporção de 1:9. Descarte a pelota de RBC.
- Centrifugar a suspensão de plaquetas em 500 x g durante 4 min à temperatura ambiente.
- Adicione 80 µ l de tampão de Lise gelada (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) contendo inibidor da protease cocktail III (1: 500) para a plaqueta de Pelotas.
4. mancha ocidental da VASP
- Carga de 15 µ g da proteína de cada amostra para 2 separado 10% geles de SDS-PAGE.
Nota: Buffer de descascamento dura, que contém b-Mercaptoetanol, não é possível remover anticorpos P-VASPSer239 e VASP da membrana; Portanto, P-VASP Ser239 e VASP devem ser executado separadamente. - Execute os géis em 120 V para h 1,30 e transferência para a membrana de nitrocelulose.
- Bloco inespecificas com leite desnatado 5%.
- Incubar a membrana com P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) e GAPDH (1:1, 000) durante a noite a 4 ° C.
- Incube o anticorpo secundário de horseradish peroxidase (HRP) com a membrana de 45 min à temperatura ambiente.
- Expor a membrana com uma máquina de tonalizador e quantificar a densidade de banda usando o ImageJ.
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Representative Results
Amostras de sangue venoso tem valores de2 pO entre 50 e 80 mmHg. Desoxigenação por Hélio diminui rapidamente pO2 a 25 mmHg dentro de 10 min.2pO um pouco mais tempo de Desoxigenação aumento diminui. No entanto, o aumento do tempo de Desoxigenação também leva a um significativamente aumento dos níveis de hemoglobina sem célula (determinado pelo CO-oxímetro, visualmente, visto na Figura 2 como cada vez mais vermelha coloração do plasma) (Fig. 2A-B). Aumento da hemólise não está associada com mexendo porque mexendo sem Desoxigenação não induz a hemólise (Figura 2).
Nós encontramos que a presença de hemácias nas amostras lisadas diminui P-VASPSer239 e VASP detectado pela mancha ocidental (Figura 3). Portanto, primeiro separamos as plaquetas e hemácias antes da execução de borrões ocidentais para detectar P-VASPSer239 das plaquetas.
Para mostrar que há tempo suficiente para separar as hemácias fora de plaquetas sem afetar a fosforilação da VASP, não usamos uma curta duração nenhum doador. PROLI NONOate (nenhum doador com meia-vida de 1,8 s a 37 C pH 7,4), rapidamente aumentou P-VASPSer239 em plaquetas (dentro de 10 s de incubação). P-VASPSer239 induzida por PROLI NONOate é detectado por 10 min após a incubação com PRP (Figura 4).
Nitrito aumenta P-VASPSer239 em plaquetas na presença de hemácias pobre em oxigênio (pO2 25 mmHg). Atividade de redutase do nitrito de hemácias venoso depende do hematócrito e o efeito máximo é observado no hematócrito de 20% (Figura 5).
Figura 1: câmara de Desoxigenação. Mistura de PRP e hemácias é adicionada em um frasco plástico fechado com um septo de borracha. A garrafa fechada é conectada à linha de hélio (He) usando uma agulha. Oxigênio é liberado para fora por uma agulha de seringa pequena (26 G), servindo como uma saída de gás.
Figura 2: Pressão parcial de oxigênio (pO2) e hemoglobina livre celular após Desoxigenação. (A) PRP e hemácias amostras foram venoso para 3, 5, 10, 15, 30 e 50 min. pO2 das amostras foram medidos pelo analisador de gás de sangue (n = 3). Barras de erro são fotos SEM. representante do sobrenadante de amostras PRP + hemácias mexido com (B) ou sem hélio (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: representante VASP Western blot bandas amostras da PRP/hemácias preparadas em vários hematócrito. Hemácias foram adicionadas em PRP para 1, 5, 10, 15, 20, 40% de hematócrito. Misturas de PRP + hemácias foram centrifugadas a 500 x g durante 5 min e lysed com Lise.
Figura 4: bandas de borrão ocidental representante da VASP-PSer239 e VASP em PRP após exposição a nenhum doador PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) foi adicionado ao PRP e incubada a 37 ° C, durante 10 a 30 s e 1, 2, 5, 10, 20 e 40 min.
Figura 5: VASPSer239 fosforilação depende de níveis2 e hematócrito de pO. (A) PRP + hemácias (hematócrito de 20%) foram venoso para dois níveis de diferentes pO2 , 40 e 25 mmHg. P-VASPSer239 e VASP foram medidos após a incubação das amostras venoso com nitrito de 10m a 37 ° C por 10 min. (B) nitrito (10 M) foi adicionado no venoso PRP + hemácias em 0, 10, 20 e 40% de hematócrito (pO2 = 25 mmHg). Dobra aumentada (P-VASPSer239) foi calculada em relação ao controle (PRP + hemácias sem nitrito) para cada valor de hematócrito. Barras de erro = SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desde que as plaquetas são facilmente ativadas, suave manipulação de plaquetas contendo amostras é necessária. Pipetagem rápido e agitação vigorosa devem ser evitadas. Inibidores de plaquetas como a prostaciclina (PGI2) podem ser usados para prevenir a ativação plaquetária; no entanto, isso pode afetar algumas vias de sinalização no interior das plaquetas. Para a preparação de pelotas de plaquetas, podemos adicionar ACD para as suspensões de plaquetas e usar centrifugação de baixa velocidade.
Acabadas de plaquetas no PRP têm vida limitada extensão, até 2 h. Para alcançar alta reprodutibilidade, todas as experiências devem ser feitas apenas com plaquetas frescas e até 2 horas após a coleta de sangue. Os dados apresentados foram obtidos com plaquetas no PRP, que é considerado mais fisiológica do que plaquetas lavadas. Embora a esperança de vida e pureza aumentam de plaquetas lavadas, centrifugação repetida durante a preparação de plaquetas lavadas pode levar a sua activação espontânea e isso pode resultar em qualidade inconsistente de preparações de plaquetas. PRP é preferido sobre plaquetas lavadas, desde que o procedimento é mais rápido e mais manipulação pode ativar as plaquetas. No entanto, em casos específicos, quando a interferência de fatores de coagulação do sangue do plasma pode interferir com configuração experimental, lavar as plaquetas representa solução para evitar estes problemas.
Contaminação de oxigênio nas amostras venoso é o passo mais importante e crítico para este ensaio. Hemácias podem ser agrupadas e pobre em oxigênio antes de ser adicionado para o PRP. No entanto, transferência de hemácias venoso aumenta o risco de contaminação. Além disso, Desoxigenação das hemácias concentradas requer mais tempo do que Desoxigenação da preparação completa para o hematócrito desejado e maior exposição ao gás conduz ao aumento dos níveis de hemoglobina livre de célula. Embora hemoglobina sem célula pode ser lavada fora de hemácias pobre em oxigênio, a solução salina tampão de fosfato ou outros buffers usados para lavar roupa devem ser cuidadosamente venoso para evitar a contaminação de oxigênio durante a centrifugação. Para encurtar o processo de preparação e evitar contaminação desnecessária, cada amostra PRP + hemácias foi preparada para o hematócrito desejado primeiro e então venoso antes da adição de nitrito.
Para quantificação de P-VASPSer239 por Western blot, hemácias devem ser separadas fora as plaquetas. VASP é expresso em hemácias13, mas os níveis são muito inferiores em plaquetas e nonsignificant quando comparado com a hemoglobina. Desde que a concentração de proteína total é usada para carregar os controles nos borrões ocidentais, a presença de hemácias nas amostras lisadas interfere com P-VASP e VASP medição pela mancha ocidental. Devido a uma taxa lenta de desfosforilação por enzimas fosfatase em plaquetas14, P-VASP é sustentado por 10 min (Figura 4) e, portanto, é possível separar as hemácias por centrifugação antes de coletar lisados celulares de plaquetas.
O CE50 por fosforilação da VASP é quase uma ordem de magnitude inferior a CE50 para aumentar o pico cGMP, 0,5 nM e 9 nM, respectivamente3, que faz a fosforilação de VASP, um dos métodos mais sensíveis para detectar a presença de quantidades baixas de n º. No entanto, a curva de fosforilação da VASP em resposta a n é em forma de sino; uma diminuição da fosforilação é observada após um pico em 3-30 nM de3. Esta resposta não linear para sem concentrações crescentes faz VASP impróprios para rigoroso não há quantificação.
Desde que as plaquetas no PRP têm uma vida curta, o ensaio deve ser feito em plaquetas frescas até 2 horas depois de tirar sangue. A inconsistência dos níveis de pO2 após a Desoxigenação pode ser encontrada desde a Desoxigenação das amostras é dependente da taxa de fluxo de gás hélio e taxa de agitação da garrafa. Portanto, o tempo para Desoxigenação precisa ser determinado pelo julgamento. Para a medição da P-VASP por borrões ocidentais, a escolha de anticorpo é fundamental, e é preciso não usar nenhum doador directa como um controle positivo para verificar a especificidade. Além de n, P-VASPSer239 em plaquetas pode ser fosforilada pela inibição de enzimas phosphodiesterease e a ativação da proteína quinase um caminho.
A medição da P-VASPSer239 tem algumas vantagens sobre o ensaio de cGMP. cGMP em plaquetas tem uma meia-vida muito curta (menos de 10 s) e a medição de cGMP requer a adição de inibidor de fosfodiesterase3. Também, a medição de cGMP usa uma técnica de ELISA bastante cara. VASP pode simplesmente ser medido por um protocolo in-house borrão ocidental e, portanto, é mais prontamente disponível.
Aumento de P-VASPSer239 em plaquetas foi utilizado com sucesso como um sensor para nenhuma geração por nitritos inalados em vivo6. Portanto, mostramos que é possível usar P-VASPSer239 em plaquetas como um marcador de nenhuma geração in vitro e in vivo, no sangue e, possivelmente, em diversas outras situações. O CE anormalmente baixa50 torna este método um excelente candidato para detectar a presença de muito baixa sem concentrações no sangue. Portanto, este protocolo fornece uma possibilidade de estudar sem geração de sangue em vários estímulos fisiológicos, tais como durante a cascata de coagulação do sangue, aumento puro estresse ou aumento da inflamação.
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Disclosures
Dr. Alan Schechter é listado como um co-inventor em várias patentes emitidas para os institutos nacionais de saúde para a utilização de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no NIH licenciamento destas patentes para o desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela concessão intramural do NIH para Dr Alan N. Schechter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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