Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Hier presenteren we een protocol om het potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige stikstofmonoxide sensor in bloed. Het beschrijft eerste bloedplaatjes voorbereiding en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als stikstofmonoxide generatoren.

Abstract

Bloedplaatjes zijn de bloedbestanddelen die verantwoordelijk zijn voor een goede bloedstolling. Hun functie is sterk gereguleerd door verschillende trajecten. Een van de meest potente vasoactieve agenten, stikstofmonoxide (NO), kan ook fungeren als een krachtige remmer van aggregatie van de bloedplaatjes. Direct is geen detectie in bloed zeer uitdagend vanwege haar hoge reactiviteit met cel-vrij hemoglobine geen half-life naar de milliseconde bereik te beperken. Op dit moment geen wijzigingen na interventies zijn slechts geraamd op basis van gemeten wijzigingen nitriet en nitraat (leden van de nitraat-nitriet-NO metabolische weg). Echter precieze, deze metingen zijn lastig te interpreteren vis een vis werkelijke geen veranderingen, als gevolg van de natuurlijk hoge basislijn nitriet en nitraat niveaus die verschillende ordes van grootte hoger dan verwachte wijzigingen van geen zelf. Daarom is de ontwikkeling van directe en eenvoudige methoden die het mogelijk een maken te detecteren NO direct allang. Dit protocol adressen een potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige geen sensor in bloed. Het beschrijft eerste platelet rich plasma (PRP) en gewassen bloedplaatjes preparaten en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als geen generatoren. Fosforylering van VASP op serine 239 (P-VASPSer239) wordt gebruikt voor het detecteren van de aanwezigheid van nr. Het feit dat VASP eiwit sterk in bloedplaatjes uitgedrukt wordt en dat het snel is phosphorylated als er geen aanwezig leidt tot een unieke kans om dit traject kunt direct geen aanwezigheid in het bloed.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bloedplaatjes zijn kleine schijf-vormige cel fragmenten afgeleid van megakaryocytes, die cruciaal zijn voor de bloedstolling. De bloedstolling cascade wordt geïnitieerd door verschillende biologische actieve moleculen (zoals collageen of ADP), vrijgegeven na de verwonding van vasculaire muur. Het bloed bloedstolling proces kan worden gewijzigd, onder verschillende effectoren door stikstofmonoxide (NO). Nee, natuurlijk geproduceerd door cellen van zoogdieren, is een van de meest veelzijdige fysiologische signalen. Het fungeert als een krachtige vaatverwijdende, neurotransmitter en immune modulator, een paar van de vele functies te noemen. In de bloedbaan, helpt niet ook om het reguleren van de omvang van de bloedstolling door remming van de aggregatie van de bloedplaatjes. Een van de meest waarschijnlijke bronnen voor NO in de bloedbaan is nitriet, een anorganische ion dat is getoond om te dienen als een voorloper van nr. Reactie met rode bloedcellen (RBC), nitriet wordt verminderd op Nee en deoxyHb is geoxideerd tot methemoglobine (metHb)1. NO verlost van RBC is vasoactieve en veroorzaakt vasorelaxation2. Dit nitriet vermindering traject is een alternatief geen generatie traject, optreden samen met en als aanvulling op de klassieke geen generatie pad door endothelial stikstofoxide synthase bij hypoxische voorwaarden.

Bloedplaatjes zelf zijn niet kundig voor nitriet in NO verminderen maar zijn zeer gevoelig voor haar aanwezigheid. In intact Trombocyten, niet in de nanomolar bereik vergroot cGMP (EG50 = 10 nM) en fosforylering van VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Daarom, bloedplaatjes kunnen dienen als een uitstekende sensor van nitriet reductie tegen RBC en geen introductie in bloed. Er zijn verschillende methoden die direct van de omvang van de activatie van de bloedplaatjes - zoals aggregometry en thromboelastography (TEG meten kunnen)4,5. Echter, deze methoden vereisen dure gespecialiseerde instrumentatie en vrij grote hoeveelheden materiaal. Het is ook mogelijk om gebeurtenissen te controleren downstream, na Nee wordt vrijgelaten uit de RBC, met behulp van de wijzigingen in bloedplaatjes oppervlakte-proteïne expressie – zoals de P-selectine6. Nee is ook bekend om de hoeveelheid cGMP in de bloedplaatjes7te verhogen. Wij vroeger cGMP geen introductie in bloed te controleren na de nitriet verkleining door gedeoxygeneerd RBC8. Dit bleek een zeer gevoelige methode; echter cGMP is een kortstondige molecule en de detectie omvat uitgebreide arbeid. Een andere mogelijkheid, zoals beschreven in het voorgestelde protocol, maakt gebruik van fosforylering van de phospho van vaatverwijdende-gestimuleerd (VASP)-eiwit op de aanwezigheid van NO in het bloed. VASP is een substraat van proteïne kinase G activering, die op de interactie met NO t/m de sGC/cGMP traject9is phosphorylated. Detecteerbare VASP fosforylatie treedt op bij zeer lage NO concentraties, ertoe dat bloedplaatjes een zeer gevoelige detector van geen aanwezigheid in het bloed leiden kunnen. VASP is sterk uitgedrukt in bloedplaatjes, maar niet in andere cellen van het bloed, waardoor de gebeurtenissen waarbij bloedplaatjes10selectief te volgen.

Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven de methode gedetailleerd voor de detectie van geen vrijgave in volbloed zijn interactie met bloedplaatjes via toezicht VASP fosforylatie11,12. De beschreven methode maakt de vroege ontdekking van lage geen concentraties - theoretisch in het bereik van nanomolar, waardoor dit protocol gevoeliger dan cGMP bepaling, als gevolg van het gebruik van standaard westelijke vlek technieken haalbaar in meeste laboratorium Instellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Bloedmonsters werden verkregen NIH bloedbank (IRB protocol goedgekeurd: 99-CC-0168).

1. bloed monster voorbereiding

Opmerking: Om te voorkomen dat bloedplaatjes activering, tekenen bloed langzaam en meng zachtjes met citraat door het omkeren van de buis meerdere malen.

  1. Platelet-rich plasma (PRP) voorbereiding
    1. Tekenen van 30-50 mL bloed met behulp van een 20 G of grotere diameter naald en toevoegen in een buis met Natriumcitraat (3,8%) in een 1:9 verhouding of zure citraat dextrose (ACD) (66,6 mM citroenzuur, 85 mM Trinatriumcitraat citraat, 111 mM glucose, pH 4.5) in een verhouding van 1:6.
    2. Aliquot 5 mL vers verzameld volbloed in lege 15 mL conische buizen. Centrifugeer volbloed bij 120 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Zorgvuldig verzamelen het supernatant met de bloedplaatjes (platelet-rich plasma, PRP) van het bovenste gedeelte door een kunststof overdracht pipet.
      Opmerking: PRP uit stap 1.1.3 is klaar voor gebruik in proeven, of voor verdere verwerking te bereiden gewassen bloedplaatjes. De zachte pellet verkregen na centrifugeren (stap 1.1.2) rode bloedcellen en witte bloedcellen bevat en verder kan worden gezuiverd om gewassen rode bloedcellen (RBC) verkrijgen — zie stap 1.3. Het experiment moet worden afgewerkt binnen 2 uur na het trekken van bloed. Bij het verzamelen van PRP (bezinken), te voorkomen dat de collectie van buffy coat-bevattende leukocyten verzameld op de PRP/RBC-interface.
  2. Gewassen bloedplaatjes voorbereiding (optioneel)
    1. Centrifuge verzameld PRP bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en houden de bloedplaatjes pellets.
    2. Voorzichtig wassen de korrels door toevoeging van 5 mL van CGS buffer (120 mM NaCl, 12.9 mM Trinatriumcitraat citraat en 30 mM glucose, pH 6,5) en centrifuge bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Resuspendeer de bloedplaatjes pellets met 3 mL gemodificeerde Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2.9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose pH 7.4).
    4. Verdun de bloedplaatjes (1:100 — als bijvoorbeeld 10 µL van bloedplaatjes in 990 µL van Rees-Ecker oplossing) met Rees Ecker-oplossing en graaf van hemocytometer.
    5. De dichtheid van bloedplaatjes tot 3 x 108 cellen/mL aanpassen door het toevoegen van Tyrode buffer.
    6. Incubeer de bloedplaatjes schorsing bij 37 ° C gedurende 1 uur voordat het experiment.
      Opmerking: Gewassen bloedplaatjes zijn stabiel gedurende 5-8 uur bij 37 ° C.
  3. Voorbereiding van gewassen rode bloedcellen (RBC)
    1. Centrifugeer na de collectie, de zachte pellet verkregen in stap 1.1.3 bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder het supernatant en wassen van de RBC pellet met 5 mL PBS door centrifugeren bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap voor 3 keer.
    3. Negeren van de PBS en gebruik gewassen RBC voor verdere experimenten.

2. deoxygenering

  1. Voeg vervolgens 1 mL van het mengsel van PRP (bereid in stap 1.1.4. of 1.2.4.) en RBC (bereid in stap 1.3.) op de gewenste hematocriet in een polypropyleen fles met een rubberstop gesloten. Bijvoorbeeld 20% hematocriet, voeg toe 200 µL van RBC tot 800 µL van PRP.
    Opmerking: Voorgesteld hematocrits zijn van 0% tot 40%. Gebruik geen een glazen fles of kolf zoals bloedplaatjes aan glazen oppervlak houden.
  2. Plaats de naald verbonden met helium gastank in de gesloten fles en controleer de gas uitlaat door het invoegen van een naald 26 G (Figuur 1).
  3. Langzaam krul de fles bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Hij gas naar bubble via bloedpreparaten niet toegestaan. Langzame gasstroom beter voor deze procedure is, en buitensporig snelle hij gasstroom leidt tot verhoogde hemolyse. De meest efficiënte gasstroom moet worden bepaald door het proces, zoals het is sterk afhankelijk van de geometrie van de experimentele opstelling.
  4. Periodiek de deoxygenering proces te volgen door het meten van de druk met gedeeltelijke zuurstof (pO2) met behulp van een co oximeter.
    Opmerking: In onze handen, 10 min van deoxygenering dalingen pO2 tot 25 mmHg die vereist is voor de vermindering van de nitriet door RBC. voortzetting van de deoxygenering verder verminderen pO2 tot 10 mmHg; het leidde echter tot verhoogde hemolyse en stijgingen van de cel-vrije hemoglobine (Figuur 2).

3. rode bloedcellen nitriet vermindering

  1. Voeg 1 mL PBS (pH 7.4) in 0.0345 g NaNO2 om 500 mM stockoplossing van nitriet. Verdun 500 mM NaNO2 tot 250 µM NaNO2 (25 x) door seriële verdunning in PBS (pH 7.4).
  2. Met behulp van een microsyringe, injecteren nitriet (40 µL) door middel van het septum in het gedeoxygeneerd monster van PRP en RBC om de eindconcentraties van 10 µM in totaal 1 mL van het monster.
    Opmerking: In dit experiment is de eindconcentraties van nitriet gebruikt 10 µM.
  3. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 10 minuten of langer.
    Opmerking: De precieze duur van incubatie van de RBC aanpassen met nitriet die nodig zijn voor de vermindering van de maximale nitriet voor verschillende aard van de dierproeven.
  4. Verwijder de stop en de pipet 1 mL van het monster in de buis van een microcentrifuge.
  5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Pipetteer 300 µL van de bloedplaatjes schorsing van het bovenste gedeelte van het supernatant en meng met ACD (pH 6,5) in een verhouding van 1:9. Gooi de RBC-pellet.
  7. Centrifugeer de bloedplaatjes schorsing bij 500 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Voeg 80 µL van ijskoude lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) met proteaseinhibitor cocktail III (1:500) aan de bloedplaatjes pellets.

4. westelijke bevlekken van VASP

  1. Het laden van 15 µg van het eiwit van elk monster naar 2 aparte 10% SDS-pagina gelen.
    Opmerking: Harde strippen buffer, waarin b-mercaptoethanol, verwijderen P-VASPSer239 en VASP antilichamen niet uit het membraan; Daarom moet P-VASP Ser239 en VASP worden uitgevoerd afzonderlijk.
  2. De gels op 120 V voor 1,30 h en overdracht aan het membraan van het nitrocellulose uitvoeren.
  3. Blok niet-specifieke binding met 5% non-fat droge melk.
  4. Incubeer het membraan met P-VASPSer239 (1:500), VASP (1:1, 000) en GAPDH (1:1, 000) voor overnachting bij 4 ° C.
  5. Incubeer horseradish peroxidase (HRP) secundair antilichaam met het membraan gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Het membraan met een machine imager bloot en kwantificeren van de dichtheid van de band met behulp van ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Veneuze bloedmonsters hebben pO2 waarden tussen 50-80 mmHg. Deoxygenering van helium vermindert snel pO2 tot 25 mmHg binnen 10 min. verhoogde deoxygenering tijd iets verder daalt pO2. Meer tijd voor deoxygenering leidt echter ook tot aanzienlijk hogere niveaus van cel-vrije hemoglobine (bepaald door co Oximeter, visueel gezien op Figuur 2 als steeds meer rode verkleuring van plasma) (Figuur 2A-B). Verhoogde hemolyse is niet gekoppeld aan het roeren omdat roeren zonder deoxygenering niet toe hemolyse (figuur 2C brengt er).

We vonden dat de aanwezigheid van ige suspensie van RBC in lysed monsters vermindert P-VASPSer239 en VASP gedetecteerd door Westelijke Bevlekkende (Figuur 3). Daarom, wij eerst scheiden bloedplaatjes en RBC voordat u Western blots op te sporen van P-VASPSer239 in bloedplaatjes.

Om aan te tonen dat er voldoende tijd om te scheiden van RBC uit bloedplaatjes zonder VASP fosforylatie, gebruikten we een kortstondige geen donor. PROLI NONOate (geen donor met halveringstijd van 1.8 s bij 37 C pH 7.4), snel verhoogd P-VASPSer239 in bloedplaatjes (binnen 10 s van incubatie). P-VASPSer239 geïnduceerd door PROLI NONOate wordt gedetecteerd gedurende 10 minuten na de incubatie met PRP (Figuur 4).

Nitriet verhoogt P-VASPSer239 in bloedplaatjes in aanwezigheid van gedeoxygeneerd RBC (pO2 25 mmHg). Nitriet reductase activiteit van gedeoxygeneerd RBC afhankelijk van hematocriet en het maximale effect wordt waargenomen bij 20% hematocriet (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: deoxygenering kamer. Mengsel van PRP en RBC wordt toegevoegd in een plastic fles met een rubber tussenschot gesloten. De gesloten fles is verbonden met helium (He) lijn met behulp van een naald. Zuurstof is gespoeld uit door een kleine injectiespuit naald (26 G) fungeren als een gas-outlet.

Figure 2
Figuur 2: Gedeeltelijke zuurstof druk (pO2) en cel-vrije hemoglobine na deoxygenering. (A) PRP en RBC monsters werden deoxygenated voor 3, 5, 10, 15, 30 en 50 min. pO2 monsters werden gemeten door bloed gas analyzer (n = 3). Foutbalken zijn SEM. vertegenwoordiger foto's van supernatant van PRP + RBC monsters geroerd met (B) of zonder helium (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vertegenwoordiger VASP Western blot bands in monsters van PRP/RBC bereid op verschillende hematocriet. RBC werden toegevoegd in PRP aan 1, 5, 10, 15, 20, 40% hematocriet. Mengsels van PRP + RBC waren gecentrifugeerd bij 500 x g gedurende 5 min en lysed met lysis-buffermengsel.

Figure 4
Figuur 4: vertegenwoordiger Western blot bands van P-VASPSer239 en VASP in PRP na blootstelling aan geen enkele donor PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) werd toegevoegd in PRP en geïncubeerd bij 37 ° C voor 10 en 30 s en 1, 2, 5, 10, 20 en 40 min.

Figure 5
Figuur 5: VASPSer239 fosforylering hangt pO2 en hematocriet niveaus. (A) PRP + RBC (20% hematocriet) werden deoxygenated tot twee verschillende pO2 niveaus, 40 en 25 mmHg. P-VASPSer239 en VASP werden gemeten na de incubatie van gedeoxygeneerd monsters met 10 M nitriet bij 37 C voor 10 min. (B) nitriet (10 M) is toegevoegd in gedeoxygeneerd PRP + RBC op 0, 10, 20 en 40% hematocriet (pO2 = 25 mmHg). Vouw verhoogd (P-VASPSer239) werd berekend ten opzichte van controle (PRP + RBC zonder nitriet) voor elke hematocriet waarde. Foutbalken = SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aangezien de bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd, zachte behandeling van bloedplaatjes-bevattende monsters is vereist. Snelle pipetteren en krachtig schudden moet worden vermeden. Bloedplaatjes remmers zoals prostacyclin ("BGA"2) kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat bloedplaatjes activering; Nochtans, kan dit sommige signaalroutes binnen de bloedplaatjes beïnvloeden. Voor de bereiding van bloedplaatjes pellets, we ACD toevoegen aan de bloedplaatjes schorsingen en gebruiken van lage snelheid centrifugeren.

Vers bereide bloedplaatjes in PRP hebben een beperkte leven beslaan, tot 2 h. Om te bereiken hoge reproduceerbaarheid, moeten alle experimenten worden gedaan alleen met verse bloedplaatjes en binnen 2 uur na het verzamelen van bloed. De gepresenteerde gegevens zijn verkregen met bloedplaatjes in PRP, die wordt beschouwd als meer fysiologische dan gewassen bloedplaatjes. Hoewel de levensduur en zuiverheid te voor gewassen bloedplaatjes verhogen, herhaalde centrifugeren tijdens voorbereiding van gewassen bloedplaatjes kan leiden tot hun spontane activering en dit kan leiden tot inconsistente kwaliteit van bloedplaatjes preparaten. PRP verdient de voorkeur boven gewassen bloedplaatjes aangezien de procedure sneller en verdere behandeling kan bloedplaatjes geactiveerd. Echter in bijzondere gevallen vertegenwoordigt wanneer de inmenging van plasma bloedstollingsfactoren met experimentele opzet interfereren kan, oplossing om deze problemen te vermijden wassen bloedplaatjes.

Zuurstof besmetting in gedeoxygeneerd monsters is de belangrijkste kritische stap voor deze test. RBC kunnen worden gebundeld en deoxygenated voordat het wordt toegevoegd aan het Wachtwoordreplicatiebeleid. Echter verhoogt overdracht gedeoxygeneerd RBC het risico van besmetting van zuurstof. Daarnaast deoxygenering van geconcentreerde RBC vereist meer tijd dan deoxygenering van het volledige preparaat bij de gewenste hematocriet, en langere blootstelling aan hij gas leidt tot verhoogde niveaus van cel-vrije hemoglobine. Hoewel cel-vrije hemoglobine worden uit gedeoxygeneerd RBC gewassen kan, moet het fosfaat buffer zoutoplossing of andere buffers gebruikt voor het wassen zorgvuldig gedeoxygeneerd ter voorkoming van besmetting van de zuurstof tijdens het centrifugeren. Om het voorbereidingsproces verkorten en overbodige zuurstof besmetting te voorkomen, is elk monster PRP + RBC opgesteld op de gewenste hematocriet eerst en vervolgens deoxygenated vóór de toevoeging van nitriet.

Om te kwantificeren P-VASPSer239 door westelijke vlek, moeten RBC worden gescheiden uit de bloedplaatjes. VASP wordt uitgedrukt in RBC13, maar de niveaus zijn opgave in vergelijking met hemoglobine en veel lager dan in de bloedplaatjes. Omdat de eiwitconcentratie totaal wordt gebruikt voor het laden van de besturingselementen in de Western blots, verstoort de aanwezigheid van ige suspensie van RBC in lysate monsters P-VASP en VASP waardering door het westelijke bevlekken. Als gevolg van een trage van defosforylerings door fosfatase enzymen in bloedplaatjes14, P-VASP is opgelopen gedurende 10 minuten (Figuur 4) en daarom is het mogelijk om te scheiden van de RBC door centrifugeren vóór het verzamelen van bloedplaatjes cel lysates.

De EG-50 voor VASP fosforylatie is bijna een orde van grootte lager dan de EG50 voor de piek cGMP verhogen, 0,5 nM en 9 nM, respectievelijk3, waardoor VASP fosforylatie, een van de meest gevoelige methoden voor het detecteren van de aanwezigheid van lage bedragen van nr. De VASP fosforylatie curve in reactie op Nee is echter klokvormige; een daling van de fosforylatie wordt waargenomen na een piek bij 3-30 nM van3. Dit niet-lineaire antwoord op de toenemende geen concentraties maakt VASP ongeschikt voor strikte geen kwantificering.

Aangezien de bloedplaatjes in PRP hebben een korte levensduur, de bepaling moet in verse bloedplaatjes binnen 2 uur na het trekken van bloed. De inconsistentie van pO2 niveaus na de deoxygenering kan worden gevonden, aangezien de deoxygenering van monsters afhankelijk van het debiet van helium gas en tarief is van zwenken van de fles. Daarom moet de tijd voor deoxygenering door proef vast te stellen. De antilichaam-keuze is van cruciaal belang voor de meting van P-VASP door Western blots, en men moet gebruik van een directe geen donor als positieve controle om te controleren de specificiteit. Naast geen, P-VASPSer239 in bloedplaatjes kan worden phosphorylated door de remming van de phosphodiesterease enzymen en de activering van proteïne kinase een traject.

De meting van P-VASPSer239 heeft enkele voordelen ten opzichte van cGMP assay. cGMP in bloedplaatjes heeft een zeer korte halfwaardetijd (minder dan 10 s) en de meting van cGMP vereist de toevoeging van fosfodiësterase remmer3. Daarnaast gebruikt de cGMP-meting een nogal dure ELISA-techniek. VASP gewoon kan worden gemeten door een in-house westelijke vlek-protocol en is daarom meer beschikbaar.

Meer P-VASPSer239 in bloedplaatjes werd met succes gebruikt als een sensor voor geen generatie door geïnhaleerde nitriet in vivo6. Dus, we toonden dat het mogelijk is te gebruiken van P-VASPSer239 in bloedplaatjes als een marker van geen generatie in vitro en in vivo in het bloed, en eventueel in verschillende andere situaties. De uitzonderlijk lage EG50 maakt deze methode een uitstekende kandidaat is voor het detecteren van de aanwezigheid van zeer lage geen concentraties in het bloed. Daarom is dit protocol biedt een mogelijkheid om te studeren geen generatie in bloed aan verschillende fysiologische stimuli, zoals tijdens bloed coagulatie cascade, verhoogd van enorme stress of ontsteking verhoogd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter wordt vermeld als mede-uitvinder op diverse patenten afgegeven aan de National Institutes of Health voor het gebruik van nitriet zouten voor de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen. Hij ontvangt de royalty's op basis van het NIH licenties voor deze octrooien voor klinische ontwikkeling maar geen andere vergoeding.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de NIH intramurale subsidie aan Dr. Alan N. Schechter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter