Summary
ここでは、血小板の血液で機密性の高い一酸化窒素センサーとしての潜在的な使用に対処するためのプロトコルを提案する.一酸化窒素の発電機としての初期血小板の調製及び亜硝酸と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。
Abstract
血小板は、血液成分の適切な血凝固の責任です。その機能は様々 な経路によって厳しく規制されています。最も強力な血管作動物質、一酸化窒素 (NO) の 1 つは血小板凝集の強力な阻害剤としても機能できます。直接血液の検出はミリ秒の範囲に半減期を制限細胞遊離ヘモグロビンとの高い反応性のために非常に挑戦しません。現在、介入は推定のみ後の変更に基づいて計測された変化亜硝酸、硝酸態窒素 (硝酸亜硝酸イオン NO 代謝経路のメンバー)。ただし正確には、これらの測定値が変更なし、自然に高いベースライン亜硝酸によるヴィザヴィ実際を解釈し、硝酸塩のレベルが桁違いない自身の予想の変更よりも高いはむしろ難しい。したがって、1 つは NO を直接検出する直接、簡単な方法の開発は、長期延滞です。このプロトコルは、血でないセンサー、高感度として血小板の潜在的な使用をアドレスします。発電機なしとして初期多血小板血漿 (PRP) と洗浄血小板製剤や亜硝酸塩と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。VASP の 239 (P VASPSer239) セリンのリン酸化は号の存在を検出するために使用します。血小板の VASP タンパク質を高度に発現がない場合、それは急速にリン酸化があるという事実は、この経路を使用して血のない存在を直接検出するユニークな機会に します。
Introduction
血小板は、血液凝固に不可欠な巨核球から派生した小円盤状細胞の破片です。凝固のカスケードは、血管壁の損傷後にリリース (コラーゲンまたは ADP) など様々 な生理活性物質によって開始されます。一酸化窒素 (NO) によるさまざまなエフェクターの中では、血液の凝固作用を変更できます。いいえ、自然哺乳類細胞で産生されるは、最も汎用的な生体信号の一つです。それは、強力な血管拡張、神経伝達物質、免疫の変調器は、その多くの機能のいくつかの名前として機能します。、血流のないまた血小板凝集を抑制することによって血液凝固の程度を調節するのに役立ちます。血流における NO のほとんどの源の 1 つは亜硝酸、NO の前駆体として示されている無機イオン赤い血球 (赤血球) と反応して、亜硝酸は NO に減り、deoxyHb 酸化されてメトヘモグロビン (metHb)1。赤血球からリリース NO は血管作動性と介する2が発生します。この亜硝酸還元経路一緒に行動し、低酸素状態で内皮の一酸化窒素合成酵素によって古典的な生成パスなしを補完、代替をない生成経路です。
血小板自体に亜硝酸を減らすことができないが、その存在に非常に敏感であります。そのまま血小板でない、ナノモル範囲増加する cGMP (EC50 = 10 nM) と VASP のリン酸化 (EC50 = 0.5 nM)3。したがって、血小板は赤血球と血にないリリースによる亜硝酸還元の優秀なセンサーとして役立つかもしれない。血小板活性化 - aggregometry、トロンボエラストグラフィー (TEG) などの程度を直接測定することができますいくつかの方法があります4,5。ただし、これらのメソッドは高価な専門的な計測と材料のかなり大量に必要です。それはまたイベントを監視することが可能、下流の後から解放される赤血球、血小板の表面タンパク質発現-6P-セレクチン ・ タンパクなどの変更を使用しています。いいえ血小板7で cGMP の量を増やすことも知られています。以前は、cGMP を使用して脱酸素化赤血球8で亜硝酸還元後血液中にリリースを監視にありません。これは、証明には非常に敏感な方法;ただし、cGMP は短寿命分子、その検出は、広範な労力を伴います。別の可能性、提示のプロトコルで説明されている血管拡張刺激リン (VASP) のリン酸化を使用して-血液中の NO の存在を検出するタンパク質。SGC/-cgmp 系9までなしとの相互作用によってリン酸化蛋白質キナーゼ G 活性化の基板です。非常に低いなしで発生するリン酸化 VASP 検出濃度、血小板の血液でない存在の非常に敏感な検出器を作ることができます。VASP は血小板で高発現してが、他の血液細胞のない血小板10事件に従う選択可能します。
このプロトコルの主な目的は、VASP リン酸化11,12を監視することによって血小板との相互作用を使用して全血における NO 放出を検出するための方法について詳細に説明することです。この方法により早期に低濃度 - 理論的に議定書はほとんどの研究室で達成可能な標準的な西部のしみの技術の使用のための cGMP 定量より敏感、ナノモル範囲で設定。
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Protocol
注:血液採取 NIH 血液銀行 (IRB 承認プロトコル: 99 CC 0168)。
1. 血液試料調製方法
注:血小板の活性化を避けるためには、ゆっくりの血を引く、数回チューブを反転でクエン酸と軽く混ぜます。
-
多血小板血漿 (PRP)
- 20 G またはより大きい径の針を使用して血液の 30-50 mL を描画し、管内 1:9 比率または酸クエン酸塩デキスト ロース (ACD) (111 mM グルコース、pH 4.5 66.6 mM クエン酸、クエン酸ナトリウム 85 mM) 1:6 の比率でクエン酸ナトリウム (3.8%) に追加します。
- 空 15 mL の円錐管に新たに収集した全血の分注 5 mL。室温で 10 分間 120 x gで全血を遠心分離します。
- 慎重にプラスチック転送ピペットの上部から血小板 (PRP 血小板血漿) を含む上清を収集します。
注:1.1.3 のステップから PRP は実験で使用する準備ができているか、さらに処理を準備する洗浄血小板。遠心分離 (ステップ 1.1.2) 赤血球と白血球が含まれているし、さらにすることができます後に得られる柔らかいペレット精製洗浄赤血球 (RBC) を取得する、手順 1.3.を参照してください実験は、採血後 2 時間以内に完了する必要があります。PRP (清) を収集する場合は、PRP/RBC インターフェイスで蓄積されたバフィー コートを含む白血球のコレクションを避けます。
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洗浄血小板の調製 (オプション)
- 遠心分離機は、室温で 10 分間 400 x gで PRP を収集しました。上澄みを廃棄し、血小板のペレットを維持します。
- 室温で 10 分間 400 x gで CGS バッファー (120 mM の NaCl、12.9 mM ナトリウム クエン酸と 30 mM グルコース、pH 6.5) および遠心分離機の 5 mL を追加することでペレットは水洗い。
- 3 mL の変更された Tyrode バッファー (134 mM 塩化ナトリウム、NaH2PO4、0.34 mM 2.9 mM KCl、12 mM NaHCO3、20 mM HEPES、MgCl2、1 mM 2 mM の CaCl2、10 mM グルコース pH 7.4) と血小板ペレットを再懸濁します。
- 血小板を希釈 (1: 100-リース エッカー ソリューションの 990 μ L 中の血小板の 10 μ L の例として) リース エッカー ・ ソリューションと検定でカウント。
- Tyrode バッファーを追加して 3 × 108セル/mL に血小板の密度を調整します。
- 実験を開始する前に、1 h の 37 ° C で血小板サスペンションを孵化させなさい。
注:洗浄血小板が 37 ° C で 5-8 時間安定しています。
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洗浄赤血球 (RBC) の準備
- コレクションの後、室温で 10 分間 2,500 x gで 1.1.3 手順で取得した柔らかいペレットを遠心します。
- 上澄みを廃棄し、室温で 10 分間 2,500 x gで 5 ml の PBS の遠心分離によって赤血球ペレットを洗浄します。3 回には、この手順を繰り返します。
- PBS を破棄し、さらに実験のため洗浄赤血球を使用します。
2. 脱酸素
- PRP の混合物の 1 つの mL を追加 (1.1.4 の手順で準備します。 または 1.2.4。)、ゴム栓で閉じてポリプロピレン ボトルに必要なヘマトクリット値を赤血球 (ステップ 1.3 の準備)。たとえば、20% ヘマトクリットで PRP の 800 μ L に赤血球の 200 μ L を追加します。
注:ヘマトクリットの解析が示唆された 0% から 40% まで。血小板がガラス表面に付着すると、ガラスの瓶やフラスコを使用しないでください。 - 密閉瓶にヘリウム ガスのタンクに接続されている針を挿入し、26 G 針 (図 1) を挿入することでガス抜きをします。
- 常温ボトルをゆっくりと旋回します。
注:血液準備を通じてバブルに He ガスを許可しません。遅いガスの流れはこのプロシージャのために望ましいと速すぎる彼のガスの流れが増加溶血に 。最も効率的なガスの流れは、実験のセットアップのジオメトリによって異なります、裁判によって決定される必要があります。 - 定期的に、コ ・ オキシメータを用いた酸素分圧 (pO2) を測定することによって脱酸素プロセスに従います。
注:私たちの手で脱酸素減少 pO2赤血球脱酸素を継続して亜硝酸還元に必要な 25 mmhg の 10 分はさらに pO2に減らす 10 mmHg;しかし、それは高められた溶血や細胞遊離ヘモグロビン (図 2) の増加に導いた。
3. 赤血球亜硝酸減少
- 亜硝酸の原液を 500 mM にするナノ2 0.0345 g に 1 mL の PBS (pH 7.4) を追加します。PBS (pH 7.4) のシリアル希釈 500 mM ナノ2 250 μ M ナノ2 (25 x) を希釈します。
- 変らずを使用して、サンプルの 1 mL の合計に 10 μ M の最終的な濃度を達成するために PRP と赤血球の酸素化のサンプルに隔壁を通して亜硝酸 (40 μ L) を挿入します。
注:この実験で使用された亜硝酸塩の最終濃度は 10 μ M です。 - 37 ° c で 10 分間以上サンプルをインキュベートします。
注:亜硝酸亜硝酸極大化実験の種類に必要な赤血球孵化の正確な持続期間を調整します。 - 微量遠心チューブにストッパーとピペット 1 mL のサンプルを削除します。
- 室温で 3 分間 200 × gで遠心分離機します。
- 上澄みの上部から血小板サスペンションの 300 μ L をピペットし、ACD (pH 6.5) 1:9 の比率で混ぜます。赤血球ペレットを破棄します。
- 室温で 4 分の 500 x gで血小板懸濁液を遠心します。
- 冷たい換散バッファー (150 mM NaCl、50 mM トリス、0.5% NP 40、pH 7.4) の 80 μ L を追加カクテル III (1: 500) 血小板にペレットのプロテアーゼ阻害剤を含みます。
4 VASP の西部のしみ
- 2 独立した 10 %sds ページのゲルに各サンプルから蛋白質の負荷 15 μ g。
注:B-メルカプトエタノールを含む、過酷なストリッピング バッファーは、膜から P VASPSer239と VASP 抗体を削除できません。したがって、P VASP Ser239と VASP は個別に実行する必要があります。 - 120 V 1.30 h と転送のためにニトロセルロース膜にゲルを実行します。
- 5% 脱脂乾燥したミルクの非特異的結合をブロック。
- 4 ° C で一晩インキュベート P VASPSer239 (1: 500)、VASP (1:1, 000) GAPDH (1:1, 000) と膜
- 常温で 45 分間膜と西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 二次抗体を孵化させなさい。
- 撮像素子マシンと膜を公開して ImageJ を用いたバンド密度を定量化します。
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Representative Results
静脈血液サンプル pO2値 50-80 mmHg の間であります。ヘリウムによる脱酸素は、pO2 25 mmHg 増加脱酸素の時間よりも若干減少 pO210 分以内に急速に減る。ただし、脱酸素の増加時間はまた、細胞遊離ヘモグロビン (コ ・ オキシメータ、視覚的にプラズマのますます赤い着色として図 2に見られるによって決まります) の大幅上昇につながる (図 2 aB)。増加の溶血は、攪拌脱酸素なし攪拌溶血 (図 2) を誘発しないために関連付けられていません。
P VASPSer239と VASP 西部しみが付く (図 3) によって検出された分離のサンプルの赤血球の存在を減少させることがわかった。したがって、最初に分離血小板および赤血球血小板に P VASPSer239を検出する西部のしみを実行する前にします。
VASP のリン酸化に影響を与えることがなく血小板から赤血球を分離する十分な時間があることを示す、私たち使用短いないドナー。深 NONOate (1.8 の半減期でないドナー 37 C pH 7.4 で s)、急速に P VASPSer239血小板を増加 (10 内インキュベーションの s)。P VASPSer239深 NONOate による PRP (図 4) の孵化後 10 分が検出されました。
亜硝酸 P VASPSer239における脱酸素化赤血球 (pO2 25 mmHg) の存在下で血小板が増加します。亜硝酸還元酵素活性酸素化赤血球のヘマトクリットに左右 20% ヘマトクリット値 (図 5) で最大の効果を観察しました。
図 1: 脱酸素チャンバー 。PRP と赤血球の混合物は、ゴムキャップでプラスチック製のボトルに追加されます。クローズド ボトルは、針を使用してヘリウム (He) 行に接続されます。酸素は、ガスの出口として小さな注射針 (26 G) によってフラッシュされます。
図 2: 酸素分圧 (pO2) と脱酸素後細胞遊離ヘモグロビン。(A) PRP と赤血球のサンプルが脱酸素化血液ガス分析装置で測定したサンプルの 3、5、10、15、30、50 の分 pO2 (n = 3)。誤差は、SEM. 代表 PRP + 赤血球サンプル (B) の攪拌の上清の写真または、ヘリウム (C) なし。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: さまざまなヘマトクリットで作製した PRP/赤血球のサンプルで代表 VASP 西部のしみバンド。赤血球は、1、5、10、15、20 に PRP に追加された 40% のヘマトクリット値。PRP + 赤血球の混合物は 5 分間 500 × gで遠心分離され、換散バッファーと分離します。
図 4: 深 NONOate ないドナーへの暴露後 P VASPSer239と PRP の VASP の代表西部のしみバンド。深 NONOate (10 M) は、PRP に追加され、10 および 30 s、1、2、5、10、20、40 分の 37 ° C で培養しました。
図 5: VASPSer239リン酸化は、pO2およびヘマトクリットのレベルによって異なります。(A) PRP + 赤血球 (ヘマトクリット値 20%)、2 つの異なる pO2レベルに脱酸素化された 40 と 25 mmHg。P VASPSer239と VASP は 37 c で 10 分間 (B) 10 M 亜硝酸脱酸素化サンプルのインキュベーション後測定した亜硝酸 (10 M) は 0、10、20、40% のヘマトクリットで脱酸素化の PRP + 赤血球に追加されました (pO2 = 25 mmHg)。倍増加した (P VASPSer239) は、ヘマトクリット値ごとにコントロール (亜硝酸なし PRP + 赤血球) を基準として算出しました。誤差 = SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
血小板は、簡単にアクティブ化されるので穏やかな血小板を含む処理のサンプルが必要です。高速ピペッティングおよび活発な動揺は避けるべきであります。プロスタサイクリン (PGI2) などの抗血小板薬は血小板活性化; を防ぐために使用できます。ただし、血小板内のいくつかのシグナル伝達経路に影響可能性があります。血小板ペレットの準備、我々 は血小板の懸濁液に ACD を追加し、低速遠心分離を使用します。
作りたての血小板 PRP では、スパン、2 h まで限られた寿命を持っています。高い再現性を達成するため、採血後すべての実験が行う新鮮な血小板のみ、2 時間以内必要があります。表示されているデータは、洗浄血小板よりもより生理的である PRP 中の血小板が得られました。洗浄血小板の寿命と純度が向上、彼らの自発の活性化につながることができます洗浄血小板の調製中に繰り返される遠心分離、血小板製剤の質が一定しない可能性があります。PRP は、手順はより速く、血小板を有効に処理できるので、洗浄血小板より優先されます。ただし、特定のケースでプラズマ凝固要因の干渉実験のセットアップを妨げる可能性があるときはこれらの問題を避けるためにソリューションに表します血小板を洗浄します。
脱酸素化試料中の酸素汚染は、この試金のための最も重要な重要なステップです。赤血球をプールし、PRP に追加される前に脱酸素化することができます。ただし、脱酸素の赤血球を転送すると、酸素汚染の危険性が増えます。さらに、脱酸素濃縮赤血球の脱酸素、ヘマトクリット値目的で完全な準備のより多くの時間が必要です、He ガスを長い露光時間は細胞遊離ヘモグロビンの上昇に 。細胞遊離ヘモグロビンは、脱酸素の赤血球から洗浄することができます、ただし、リン酸バッファー生理食塩水や洗濯に使用されるその他のバッファーは、遠心分離中に酸素汚染を防ぐために慎重に脱酸素化になりません。準備プロセスを短縮し、不要な酸素汚染を避けるため、各 PRP + 赤血球サンプルは目的のヘマトクリットで最初に準備され、亜硝酸添加前に脱酸素。
ウエスタンブロット P VASPSer239を定量化するには、赤血球は血小板から区切る必要があります。VASP は赤血球13で表現されますが、レベルは、ヘモグロビンと比較して有意と血小板よりはるかに低い。総蛋白濃度は西部のしみのコントロールのロードに使用は、以来ライセート サンプルの赤血球の存在は西部にしみが付くことによって P VASP、VASP 測定と干渉します。血小板14ホスファターゼ酵素による脱燐酸化反応の遅い速度のため P VASP は持続時間 10 分 (図 4)、したがって血小板セル lysates を収集する前に遠心分離して赤血球を分離することが可能です。
VASP のリン酸化のための EC50はほぼ桁違い EC50より低いピーク cGMP を増加、0.5 nM と 9 nM、それぞれ3VASP のリン酸化の存在を検出する最も敏感な方法の 1 つになります。号の少量ただし、いいえに応えて VASP リン酸化曲線は、鐘の形;3の 3-30 nM のピーク後のリン酸化の減少は観察されます。この非線形反応ない濃度の増加には、VASP 適さない厳格なない定量化。
アッセイは、PRP 中の血小板は、短い寿命のスパンを持っている、ので、採血後 2 時間以内の新鮮な血小板の行う必要があります。サンプルの脱酸素、ヘリウム ガス流量とボトルを旋回の速度に依存するので、脱酸素後 pO2レベルの矛盾を見つけることができます。したがって、脱酸素のための時間は、裁判によって決定される必要があります。西部のしみによる P 値測定、抗体の選択は重要で、1 つは特異性を確認する肯定的な制御として直接ないドナーを使用する必要があります。血小板で、P VASPSer239に加えてすることがでく phosphodiesterease 酵素の阻害と蛋白質キナーゼ経路の活性化によりリン酸化されます。
P VASPSer239の測定には、cGMP アッセイにいくつかの利点があります。血小板の cGMP は半減期が非常に短い (未満 10 s) と cGMP の測定ホスホジエステラーゼ阻害剤3の追加が必要です。また、cGMP 測定は、むしろ高価な ELISA 法を使用します。VASP 社内の西部のしみのプロトコルによって単に測定することができます、従ってより容易に利用できます。
血小板の増加 P VASPSer239に採用されましたセンサーとして生成なしの生体内6吸入亜硝酸塩。したがって、我々 を示した血小板の in vitro および in vivo 血になり他の様々 な場面で NO 生成のマーカーとして P VASPSer239を使用することが可能です。異常に低い EC50は、血中濃度の非常に低い存在を検出するための優秀な候補者をメソッドになります。したがって、このプロトコルは、膨大なストレスの増加や炎症を増加血液凝固カスケード中など様々 な生理的刺激で血液の生成を研究なしに可能性を提供します。
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Disclosures
博士アラン ・ シェクターは、心血管疾患の治療のための亜硝酸塩使用の健康の国民の協会に発行されたいくつかの特許の共同発明者として表示されます。彼は NIH が臨床開発のこれらの特許が他の無償のライセンスに基づいてライセンス料を受け取ります。
Acknowledgments
この作品は、Dr アラン N. シェクターに NIH 学内助成金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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