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Medicine

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

여기, 우리 혈액에 산화 질소 매우 민감한 센서로 혈소판의 잠재적인 사용을 해결 하기 위해 프로토콜을 제시. 그것은 산화 질소 생성기로 초기 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다.

Abstract

혈소판은 혈액 구성 요소를 적절 한 혈액 응고에 대 한 책임. 그들의 기능은 매우 다양 한 경로 의해 통제 된다. 하나는 가장 강력한 vasoactive 에이전트, 산화 질소 (NO), 또한 혈소판의 강력한 억제제로 작동할 수 있다. 직접 혈액에서 감지 되지 않습니다 아무 반감기 밀리초 범위를 제한 하는 셀 무료 헤모글로빈으로 그것의 높은 반응성 때문에 매우 도전 이다. 현재, 변경 개입 추정만 후 아 질산염과 질산염 (질 산-아 질산염-아니 신진 대사 통로의 구성원)의 측정된 변화 기반. 그러나 정확한이 측정은 해석 실제 변경, 때문에 자연스럽 게 높은 기준선 아 질산염 및 질 산 몇 배나 더 자체의 변화를 예상된 보다 높은 수준에 오히려 어렵다. 따라서, 아니오를 직접 검출 할 수 것이 직접적이 고 간단한 방법의 개발은 오래전. 이 프로토콜 주소 혈액에 아무 센서로 매우 민감한 혈소판의 잠재적인 사용 합니다. 그것은 아무 생성기로 초기 혈소판 풍부 혈장 (PRP)와 씻어 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다. VASP의 인 산화는 떠들고 239 (P-VASPSer239)에서 번호의 존재를 감지 하는 사실 VASP 단백질 높은 혈소판 표현 된 존재 하는 때 아니 그것 빠르게 phosphorylated이 통로 사용 하 여 직접 혈액에 아무 존재를 감지 하는 독특한 기회에 지도 한다.

Introduction

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혈소판은 혈액 응고에 대 한 중요 한 없으며에서 파생 된 작은 디스크 모양의 세포 조각. 응고 폭포는 혈관 벽의 부상 이후에 출시 된 (콜라겐 또는 ADP) 등 다양 한 생리 활성 분자에 의해 시작 됩니다. 혈액 응고 과정 중 산화 질소 (NO)에 의해 다양 한 이펙터, 수정할 수 있습니다. 아니, 자연스럽 게 포유류 세포에 의해 생산, 가장 다재 다능 한 생리 신호 중 하나입니다. 그것은 강력한 vasodilator, 신경 전달 물질 및 많은 기능 몇 가지 이름을 면역 변조기 역할. 혈 류에서 더 또한 혈소판을 억제 함으로써 혈액 응고의 정도 조절 하기 위해 도움이 됩니다. 혈 류에서의 가장 가능성이 소스 중 하나입니다 아 질산염, 무기 이온의 선구자 역할을 표시 되었습니다. 적혈구 (Rbc)와 반응, 아 질산염 NO로 감소 되 고 deoxyHb 산화 methemoglobin (metHb)1. Rbc에서 발표 없음 vasoactive 이며 원인 vasorelaxation2. 이 아 질산염 감소 통로 이며 대체 아무 세대 통로와 함께 행동 내 피 산화 질소 synthase hypoxic 조건에 의해 생성 경로가 고아 한 보완.

스스로 혈소판 없음에 아 질산염을 줄일 수 있지만 그것의 존재에 매우 민감합니다. 그대로 혈소판에서 더는 nanomolar 범위 증가 cGMP (EC50 = 10 nM)와 VASP의 인 산화 (EC50 = 0.5 nM)3. 따라서, 혈소판 Rbc와 혈액으로 없음 릴리스 아 질산염 감소의 우수한 센서 역할을 수 있습니다. 직접 혈소판 활성화-aggregometry 및 thromboelastography (TEG) 등의 정도 측정할 수 있는 여러 방법이 있다4,5. 그러나, 이러한 방법은 고가의 전문된 계측 및 오히려 많은 양의 자료 필요합니다. 그것은 또한 이벤트를 모니터링할 수 다운스트림, 아니 후 출시 Rbc, 혈소판 표면 단백질 표정-P selectin6등의 변화를 사용 하 여에서. 아니 혈소판7에서 cGMP의 양을 증가 알려져 있다. 이전에 우리는 deoxygenated RBC8아 질산염 감소 후 혈액으로 없음 릴리스를 모니터링 하려면 cGMP를 사용. 이 매우 민감한 방법; 판명 그러나, cGMP 짧은 분자 이며 그 탐지 포함 광범위 한 노동. 제시 프로토콜에서 설명 하는 또 다른 가능성, vasodilator 자극 인 (VASP)의 인 산화를 사용 하 여-단백질 혈액에의 존재를 감지. VASP은 sGC/cGMP 통로9없이 상호 작용에 phosphorylated 단백질 키 니 아 제 G 활성화의 기판입니다. 매우 낮은 전혀 감지 VASP 인 산화 발생 농도, 혈액에서 혈소판 없음 존재의 매우 민감한 검출기 만들 수 있는. VASP는 높은 혈소판, 표현 하지만 하지 다른 혈액 세포에서는 선택적으로 혈소판10를 포함 하는 이벤트에 따라 있습니다.

이 프로토콜의 주요 목표는 VASP 인 산화11,12를 모니터링 하 여 혈소판와의 상호 작용을 사용 하 여 전체 혈액에 없는 자료의 검색에 대 한 세부 사항에 있는 메서드를 설명 하는. 설명된 메서드를 수 있습니다 낮은의 조기 발견 아무 농도를-이론적으로 현재 프로토콜 기술의 표준 서쪽 오 점 달성 대부분 실험실에서 사용 cGMP 결정 보다 더 민감한 nanomolar 범위에 설정.

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Protocol

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참고: NIH 혈액 은행에서 혈액 샘플을 가져온 (IRB 승인 프로토콜: 99-CC-0168).

1. 혈액 샘플 준비

참고: 혈소판 활성화를 방지 하려면 혈액 천천히 그리고 부드럽게 시트르산 반전 튜브 여러 번에 의해 혼합.

  1. 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) 준비
    1. 20 G 또는 더 큰 직경 바늘을 사용 하 여 혈액의 30-50 mL 그리고 나트륨 구 연산 염 (3.8%)는 1:9 비율 또는 산 성 구 연산 염 포도 당 (ACD) (85mm trisodium 시트르산, 66.6 m m 구 연산, 111 mM 포도 당, pH 4.5) 1: 6의 비율에 포함 된 튜브에 추가.
    2. 빈 15 mL 원뿔 튜브로 갓 수집 된 전체 혈액 5 mL aliquot. 실 온에서 10 분 동안 120 x g 에서 전체 혈액 원심
    3. 조심 스럽게 플라스틱 전송 피 펫으로 상단 부분에서 혈소판 (혈소판이 풍부한 혈장, PRP)를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
      참고: 1.1.3 단계에서 PRP는 실험에 사용 하기 위해 준비 또는 준비에 추가 처리를 위해 혈소판을 세척. 세척된 적혈구 (RBC)를 정화 하 고 원심 (1.1.2 단계) 적혈구와 백혈구를 포함 하 고 더 일 수 있다 후 얻은 부드러운 펠 릿-1.3 단계. 를 참조 하십시오 실험은 혈액을 그리기 후 2 시간 이내 완료 될 필요가 있다. PRP (표면에 뜨는) 수집, PRP/RBC 인터페이스에 축적 된 버 피 코트 포함 된 백혈구의 컬렉션을 하지 않도록 합니다.
  2. 씻어 혈소판 준비 (옵션)
    1. 원심 분리기는 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 PRP를 수집. 삭제는 상쾌한 고 혈소판 펠 릿을 유지.
    2. 부드럽게 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 CGS 버퍼 (120 mM NaCl, 12.9 m m trisodium 시트르산과 30 mM 포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 5 mL을 추가 하 여 펠 릿을 세척.
    3. 수정 된 Tyrode 버퍼 (134 m m NaCl, 0.34 m m NaH24, 2.9 m m KCl, 12 m m NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2, 10 m m 포도 당 pH 7.4) 3 mL와 혈소판 펠 릿 resuspend
    4. 혈소판을 희석 (1: 100-예를 들어, 리스 Ecker 솔루션의 990 µ L에서 혈소판의 10 µ L) 리스 Ecker 솔루션 및 hemocytometer 여 수.
    5. Tyrode 버퍼를 추가 하 여 3 x 108 셀/mL에 혈소판의 밀도 조정 합니다.
    6. 실험을 시작 하기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 혈소판 정지를 품 어.
      참고: 씻어 혈소판은 5-8 h 37 ° c.에 대 한 안정적인
  3. 세척된 적혈구 (RBC)의 준비
    1. 컬렉션, 후 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에 1.1.3 단계에서 얻은 부드러운 펠 릿 원심.
    2. 상쾌한 무시 하 고 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에서 원심 분리 하 여 PBS의 5 mL와 RBC 펠 릿을 세척. 3 번이 단계를 반복 합니다.
    3. PBS를 삭제 하 고 씻어 RBCs를 사용 하 여 추가 실험을 위해.

2입니다. deoxygenation

  1. PRP의 혼합물의 1 mL을 추가 (준비 단계 1.1.4에서에서. 또는 1.2.4.) 및 폴 리 프로필 렌 병 고무 마 개와 함께 폐쇄에 원하는 (1.3 단계에서에서 준비.) Rbc. 예를 들어 20%가에서 Rbc의 200 µ L PRP의 800 µ L를 추가 합니다.
    참고: 제안 hematocrits는 0%에서 최대 40%까지. 혈소판 유리 표면에 고착으로 유리병 이나 플라스 크를 사용 하지 마십시오.
  2. 닫힌된 병으로 헬륨 가스 탱크에 연결 하는 바늘을 삽입 하 고 26 G 바늘 (그림 1)를 삽입 하 여 가스 콘센트를 확인.
  3. 천천히 병을 실 온에서 소용돌이 친다.
    참고: 혈액 준비를 통해 거품을 그 가스를 허용 하지 않습니다. 느린 가스 흐름은이 절차를 그리고 증가 혈 지나치게 빠른 그 가스 흐름 리드. 그것은 매우 실험적인 체제의 형상에 따라 가장 효율적인 가스 흐름은 재판에 의해 결정 될 필요가 있다.
  4. 정기적으로 공동 산소 농도계를 사용 하 여 부분적인 산소 압력 (포2)를 측정 하 여 deoxygenation 프로세스를 따릅니다.
    참고: 우리의 손에서 deoxygenation 감소 포2 아 질산염 감소 Rbc. deoxygenation 계속 필요한 25 mmHg의 10 분 않았다 더 줄일 포2 10 mmHg; 그러나, 그것은 증가 혈을 증가 셀 무료 헤모글로빈 (그림 2)에 이르렀다.

3. 적혈구 아 질산염 감소

  1. 나노2 아 질산염의 500 m m 재고 솔루션의 0.0345 g으로 1 mL의 PBS (pH 7.4)을 추가 합니다. PBS (pH 7.4)에 직렬 희석 하 여 500 m m 나노2 250 µ M 나노2 (25 x)을 희석.
  2. microsyringe을 사용 하 여, 샘플의 총 1 mL에 10 µ M의 최종 농도 달성 하기 위해 PRP와 Rbc deoxygenated 샘플으로 심장 통해 질산염 (40 µ L) 주사.
    참고: 이 실험에서 사용 하는 아 질산염의 최종 농도 10 µ M입니다.
  3. 37 ° C 10 분 이상에서 샘플을 품 어.
    참고: 아 질산염 최대 아 질산염 감소 실험의 다른 유형에 대 한 필요와 RBC 외피의 정확한 기간을 조정 합니다.
  4. Microcentrifuge 튜브에 스 토퍼와 피 펫 샘플의 1 mL를 제거 합니다.
  5. 실 온에서 3 분 200 x g 에서 원심.
  6. 플라스틱은 상쾌한의 상단 부분에서 혈소판의 서 스 펜 션의 300 µ L 고 ACD (pH 6.5) 1:9 비율로 혼합. RBC 펠 릿을 삭제 합니다.
  7. 실 온에서 4 분 동안 500 x g 에서 혈소판 정지 원심
  8. 얼음 처럼 차가운 세포의 용 해 버퍼 (150 m m NaCl, 50 mM Tris, 0.5 %NP-40, pH 7.4)의 80 µ L 추가 펠 릿 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 혈소판에 칵테일 III (1: 500).

4. 서 부 럽 VASP의

  1. 각 샘플의 단백질의 15 µ g 2 별도 10 %SDS-PAGE 젤에 로드 합니다.
    참고: B-mercaptoethanol을 포함, 가혹한 스트립 버퍼 막;에서 P-VASPSer239 와 VASP 항 체를 제거할 수 없습니다. 따라서, P-VASP Ser239 와 VASP 실행 되어야 합니다 별도로.
  2. 니트로 막에 120 V 1.30 h와 전송에는 젤을 실행 합니다.
  3. 블록 비 특정 바인딩 5% 비 지방 건조 우유와 함께.
  4. 4 ° c.에 하룻밤을 위해 P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000)와 GAPDH (1:1, 000) 멤브레인을 품 어
  5. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 실 온에서 45 분 막으로 이차 항 체를 품 어.
  6. 영상 기계 막 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 밴드 밀도.

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Representative Results

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정 맥 혈액 샘플 50-80 mmHg 사이 포2 값을 가질. 헬륨에 의해 deoxygenation는 급속 하 게 포2 10 분 증가 deoxygenation 시간 약간 더 감소 포2이내 25 mmHg 감소합니다. 그러나, deoxygenation의 시간을 증가 또한 셀 무료 헤모글로빈 (시각적으로 플라즈마의 점점 붉은 채색으로 그림 2 에서 본 공동 속도도 결정)의 크게 증가 수준에 연결 (그림 2A-B). 증가 된 혈은 감동 감동 deoxygenation 없이 혈 (그림 2C)을 유도 하지 않습니다 때문에 연관 된다.

우리는 lysed 샘플에서 RBCs의 존재 P VASPSer239 와 서쪽 더 럽 히 (그림 3)에 의해 감지 하는 VASP 감소를 발견. 따라서, 우리가 먼저 별도 혈소판 및 Rbc 혈소판에 P-VASPSer239 감지 하 서쪽 오 점을 실행 하기 전에.

VASP 인 산화를 영향을 주지 않고 혈소판에서 Rbc를 구분 하는 충분 한 시간 표시, 우리 사용는 단기 아무 기증자. PROLI NONOate (1.8의 반감기를 가진 아무 기증자 37 C pH 7.4에 s), 급속 하 게 P-VASPSer239 혈소판 증가 (10 내 외피의 s). P-VASPSer239 PROLI NONOate에 의해 유도 된 PRP (그림 4)와 함께 부 화 후 10 분 동안 검색 됩니다.

아 질산염 P VASPSer239 deoxygenated Rbc (포2 25 mmHg)의 혈소판 증가합니다. 그리고 deoxygenated RBCs의 아 질산염 환 원 효소 활동이 따라 최대 효과 20%가 (그림 5)에서 관찰 된다.

Figure 1
그림 1: Deoxygenation 챔버. PRP와 Rbc의 혼합 고무 심장와 플라스틱 병에 추가 됩니다. 닫힌된 병 바늘을 사용 하 여 헬륨 (그) 라인에 연결 된다. 산소 가스 출구도 작은 주사기 바늘 (26 G) 밖으로 플러시됩니다.

Figure 2
그림 2: 부분적인 산소 압력 (포2) 및 deoxygenation 후 헤모글로빈 셀 무료. (A) PRP와 Rbc 샘플 했다 deoxygenated 혈액 가스 분석기로 3, 5, 10, 15, 30, 50 분 포2 샘플의 측정을 위해 (n = 3). 오차 막대는 PRP + Rbc 샘플 (B) 자극의 상쾌한의 SEM. 대표 사진 또는 헬륨 (C) 없이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: PRP/Rbc에서 다양 한 보통의 샘플에서 대표 VASP 서양 오 점 밴드. Rbc 추가 되었습니다 PRP에 1, 5, 10, 15, 20, 40%가. PRP + RBCs의 혼합물 500 x g 5 분 동안에 centrifuged 그리고 lysed 세포의 용 해 버퍼.

Figure 4
그림 4: 아무 기증자 PROLI NONOate에 노출 된 후 P VASPSer239 와 PRP에 VASP의 대표 서쪽 오 점 밴드. PROLI NONOate (10 M) PRP에 추가 되었고 10, 30 s 및 1, 2, 5, 10, 20, 40 분 동안 37 ° C에서 알을 품을.

Figure 5
그림 5: VASPSer239 인 산화 포2 와 보통 수준에 따라 달라 집니다. (A) PRP + Rbc (보통 20%) 두 개의 다른 포2 수준, deoxygenated 했다 40 그리고 25 mmHg. P-VASPSer239 와 VASP deoxygenated 샘플 10 M 37 C 10 분 (B)에서 아 질산염의 부 화 후 측정 된 질산염 (10 M)에서 0, 10, 20, 40%가 deoxygenated PRP + RBCs에 추가 되었습니다 (포2 = 25 mmHg). 배 증가 (P-VASPSer239) 컨트롤 (아 질산염 없이 PRP + Rbc) 각가 값을 기준으로 계산 됩니다. 오차 막대 SEM. = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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혈소판은 쉽게 활성화 하 고, 이후 부드러운 처리 포함 하는 혈소판의 샘플은 필요. 빠른 pipetting 및 활기찬 동요는 피해 야 한다. Prostacyclin (PGI2) 같은 혈소판 억제제는 혈소판 활성화;을 방지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 혈소판 내의 일부 신호 경로 영향을 수 있습니다. 혈소판 펠 릿의 준비에 대 한 우리 혈소판 정지에 ACD를 추가 하 고 낮은 속도 원심 분리를 사용 하 여.

PRP에 갓된 혈소판, 최대 2 시간에 걸쳐 제한 된 생활을 했습니다. 높은 재현성을 달성 하기 위해 모든 실험 할 수만 신선한 혈소판 및 2 시간 이내 혈 후. 표시 데이터는 씻어 혈소판 보다 더 생리 적인 것으로 간주 됩니다 PRP의 혈소판으로 획득 했다. 수명 및 순도 씻어 혈소판 증가, 비록 씻어 혈소판의 준비 하는 동안 반복된 원심 그들의 자발적인 활성화를 이어질 수 있습니다 그리고이 혈소판 준비의 일관성 없는 품질에서 발생할 수 있습니다. PRP는 이후 절차는 더 빠르게 하 고 혈소판 활성화 수 추가 처리 세척된 혈소판 이상 선호. 그러나, 특정 경우에 혈장 혈액 응고 요인의 간섭 실험 설치를 방해할 수 때 혈소판 세척 나타냅니다 이러한 문제를 방지 하려면 솔루션을.

산소 오염 deoxygenated 샘플에서이 분석 결과 대 한 가장 중요 한 중요 한 단계입니다. Rbc 풀링되 고 deoxygenated PRP에 추가 하기 전에. 그러나, 산소 오염 위험을 증가 deoxygenated RBCs를 전송 합니다. 또한, 집중된 RBCs의 deoxygenation 원하는 전체 준비의 deoxygenation 보다 더 많은 시간이 필요 하 고 그 가스에 오래 노출 셀 무료 헤모글로빈의 증가 수준에 이르게. 비록 셀 무료 헤모글로빈 deoxygenated RBCs에 밖으로 세척 될 수 있다, 인산 염 버퍼 식 염 수 또는 다른 버퍼에 사용 되는 원심 분리 동안 산소 오염을 방지 하기 위해 신중 하 게 deoxygenated 되어야 합니다. 준비 과정을 단축 하 고 불필요 한 산소 오염을 방지, 각 PRP + Rbc 샘플 먼저 원하는 준비 되었고 아 질산염의 추가 하기 전에 다음 deoxygenated.

서쪽 오 점 하 여 P-VASPSer239 계량, Rbc는 혈소판으로 구분 되어야 합니다. VASP은 Rbc13, 표현 되지만 레벨은 헤모글로빈에 비해 의미와 혈소판에 비해 훨씬 낮은. 총 단백질 농도 서쪽 오 점에 컨트롤 로드 사용, lysate 샘플에서 RBCs의 존재 서쪽 blotting에 의해 P-VASP와 VASP 측정 방해 합니다. 혈소판14인산 가수분해 효소 효소에 의해 dephosphorylation의 느린 비율 때문 P VASP은 10 분 (그림 4)과 따라서 Rbc 혈소판 세포 lysates 수집 하기 전에 원심 분리 가능 하다.

VASP 인 산화에 대 한 EC50 은 거의 크기 순서 EC50 보다 낮은 피크 cGMP 증가, 0.5 nM 및 9 nM, 각각3, VASP 인 산화의 존재를 감지 하는 가장 중요 한 방법 중 하나를 만드는 낮은 금액의 그러나, 아무 응답에서 VASP 인 산화 커브는 종 모양; 인 산화의 감소는3의 3-30 nM에 뾰 족 해지 후 관찰 됩니다. 이 비선형 응답 없는 농도 증가 하는 VASP 적합 엄격한 아무 정량화.

PRP의 혈소판 짧은 수명 때문에, 분석 결과 혈액을 그리기 후 신선한 혈소판 2 시간 이내에 수행 되어야 합니다. 샘플의 deoxygenation 헬륨 가스의 유량 및 병 소용돌이의 속도에 따라 달라 집니다 이후는 deoxygenation 후 포2 레벨의 불일치를 찾을 수 있습니다. 따라서, deoxygenation에 대 한 시간 재판에 의해 결정 될 필요가 있다. 서쪽 오 점 하 여 P-VASP의 측정에 대 한 항 체 선택은 중요 한, 그리고 하나를 사용 하 여 직접 아무 기증자 긍정적인 컨트롤로 특이성을 확인 필요. 아니, P-VASPSer239 혈소판 뿐만 아니라 phosphodiesterease 효소의 억제와 단백질 키 니 아 제 통로의 활성화에 의해 phosphorylated 될 수 있습니다.

P-VASPSer239 의 측정에는 cGMP 분석 결과 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 혈소판에 cGMP는 매우 짧은 (10 s) cGMP의 측정 포스 제3의 추가 필요 합니다. 또한, cGMP 측정 오히려 비싼 ELISA 기술을 사용합니다. VASP 사내 서쪽 오 점 프로토콜에 의해 간단 하 게 측정 될 수 있으며 따라서 더 쉽게 수 있습니다.

혈소판에 증가 P VASPSer239 성공적으로 사용 되었다 센서로 없는 세대에 대 한 vivo6흡입된 아 질산염에 의해. 따라서, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 혈액에서 및 다른 다양 한 상황에 아무 세대의 표식으로 혈소판에 P-VASPSer239 를 사용 하는 것을 보였다. 비정상적으로 낮은 EC50 은이 메서드는 우수한 후보 혈액에 없는 농도 매우 낮은의 존재를 감지 합니다. 따라서,이 프로토콜에는 혈액 응고 캐스케이드, 중 등 다양 한 생리 적 자극에 혈액에 아무 세대 연구 가능성 순전히 스트레스 증가 또는 염증 증가 제공 합니다.

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Disclosures

박사 앨런 Schechter는 심혈 관 질환의 치료에 대 한 아 질산염 소금의 사용에 대 한 건강의 국가 학회에 여러 특허에 대 한 공동 발명가로 나열 됩니다. 그는 NIH 임상 개발에 대 한 이러한 특허 하지만 다른 보상의 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 교내 그랜트 박사 앨런 북 아 Schechter에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지
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Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

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