Summary
Aquí, presentamos un protocolo para abordar el uso potencial de las plaquetas como un sensor altamente sensible de óxido nítrico en la sangre. Describe la preparación de plaquetas inicial y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos como generadores de óxido nítrico.
Abstract
Las plaquetas son los componentes de la sangre responsables de coagulación de la sangre adecuada. Su función es altamente regulada por diversas vías. Uno de los más potentes agentes vasoactivos óxido nítrico (NO), también puede actuar como un potente inhibidor de la agregación plaquetaria. Directo detección en sangre no es muy difícil debido a su alta reactividad con la hemoglobina libre que no limita Half-Life a la gama del milisegundo. Actualmente, ningún cambio después de las intervenciones sólo se calculan basado en los cambios medidos de nitrito y nitrato (miembros de la vía metabólica de nitrato-nitrito-NO). Sin embargo precisa, estas mediciones son más bien difíciles de no interpretar frente a real cambios, debido al nitrito inicial alto y niveles que son varios órdenes de magnitud mayores que los cambios esperados NO sí mismo del nitrato. Por lo tanto, el desarrollo de métodos simples y directos que le permiten detectar directamente NO es mucho. Este protocolo dirige a un potencial uso de plaquetas como altamente sensibles sin sensor en sangre. Califica de plasma rico en plaquetas inicial (PRP) y preparados de plaquetas lavadas y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos NO generadores. Fosforilación de la VASP en serina 239 (P-VASPSer239) se utiliza para detectar la presencia de NO. El hecho de que proteínas VASP se expresaron altamente en las plaquetas y que se fosforila rápidamente cuando NO está presente conduce a una oportunidad única para utilizar esta vía para detectar directamente la presencia en sangre.
Introduction
Las plaquetas son fragmentos de células pequeñas en forma de disco, derivados de megacariocitos que son cruciales para la coagulación de la sangre. La cascada de coagulación se inicia por diversas moléculas bioactivas (como colágeno o ADP), publicadas después de la lesión de pared vascular. El proceso de coagulación de la sangre puede ser modificada, entre varios generadores de óxido nítrico (NO). NO, producida naturalmente por las células de mamífero, es una de las señales fisiológicas más versátiles. Actúa como un potente vasodilatador, neurotransmisor y modulador inmune, por nombrar algunos de sus múltiples funciones. En el torrente sanguíneo, NO también ayuda a regular el grado de coagulación de la sangre al inhibir la agregación plaquetaria. Una de las fuentes más probables de NO en el torrente sanguíneo es el nitrito, un ion inorgánico que se ha demostrado para servir como un precursor del NO. Reaccionan con los glóbulos rojos (gr), nitrito se reduce a NO y deoxyHb se oxida a metahemoglobina (metHb)1. NO liberado de los glóbulos rojos es vasoactivo y causa vasorelaxation2. Esta vía de la reducción del nitrito es suplente NO generación, actuando junto con y no complementa el clásico ningún camino de generación de óxido nítrico sintasa endotelial en condiciones hipóxicas.
Las plaquetas no se son capaces de reducir el nitrito a NO, pero son muy sensibles a su presencia. En plaquetas intactas, NO en el nanomolar gama aumenta el GMPC (EC50 = 10 nM) y fosforilación de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Por lo tanto, las plaquetas pueden servir como un excelente sensor de reducción de nitritos por los glóbulos rojos y no hay liberación en sangre. Hay varios métodos que pueden medir directamente el grado de activación de las plaquetas - Tromboelastografía (TEG) como aggregometry de4,5. Sin embargo, estos métodos requieren costosos instrumentos especializados y grandes cantidades de material. También es posible monitorizar eventos río abajo, después NO es liberado de los glóbulos rojos, con los cambios en la expresión de proteína de la superficie plaquetaria – tales como P-selectina6. NO también se conoce para aumentar la cantidad de GMPC en las plaquetas7. Anteriormente, solíamos cGMP no supervisar ninguna liberación en sangre después de la reducción de nitrito por desoxigenada RBC8. Esto resultó para ser un método muy sensible; sin embargo, cGMP es una molécula de breve duración y su detección implica mano de obra extensa. Otra posibilidad, descrito en el protocolo presentado, utiliza la fosforilación de la fosfo estimulada por vasodilatador (VASP)-proteína para detectar la presencia de NO en sangre. VASP es un sustrato de la activación de proteína quinasa G, que es fosforilado a la interacción con NO a la sGC/cGMP pathway9. Fosforilación de VASP detectarse ocurre en NO muy baja concentraciones, que podrían hacer que las plaquetas un detector muy sensible de NO presencia en la sangre. VASP se expresa altamente en las plaquetas, pero no en otras células de la sangre, que permite para seguir selectivamente los acontecimientos que involucran a las plaquetas10.
El objetivo principal de este protocolo es describir el método detalladamente para la detección de ninguna liberación en sangre entera mediante su interacción con las plaquetas mediante el control de VASP fosforilación11,12. El método descrito no permite la detección temprana de baja las concentraciones - teóricamente en el rango nanomolar que hace más sensible que la determinación de la cGMP, debido al uso de técnicas de Western blot estándar alcanzables en laboratorio la mayoría del presente Protocolo Configuración.
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Protocol
Nota: Se obtuvieron muestras de sangre de banco de sangre del NIH (IRB aprobó protocolo: CC-99-0168).
1. preparación de muestras de sangre de
Nota: Para evitar la activación plaquetaria, extraer la sangre lentamente y mezclar suavemente con el citrato invirtiendo el tubo varias veces.
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Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
- Dibujar 30 – 50 mL de sangre con una 20 G o aguja de diámetro más grande y añadir en un tubo que contiene citrato de sodio (3.8%) en una proporción 1:9 o dextrosa citrato ácido (ACD) (citrato trisódico 85 mM, 66,6 mM cítrico ácido, glucosa 111 mM, pH 4.5) en una proporción de 1:6.
- Alícuota 5 mL de sangre recién recolectado en tubos cónicos de 15 mL vacíos. Centrifugar sangre 120 x g por 10 min a temperatura ambiente.
- Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene las plaquetas (plasma rico en plaquetas, PRP) de la parte superior por una pipeta de transferencia plástica.
Nota: PRP del paso 1.1.3 está listo para su uso en experimentos o para su posterior procesamiento preparar lava las plaquetas. El sedimento suave obtenido después de centrifugación (paso 1.1.2) contiene células de sangre rojas y células blancas y puede ser más purificado para obtener lavados glóbulos rojos (RBC): véase el paso 1.3. El experimento debe ser terminada dentro de 2 h después de extraer sangre. Al recoger el PRP (sobrenadante), evitar la colección de leucocitos que contiene la capa buffy acumulado en la interfaz PRP, gr.
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Preparación de plaquetas lavadas (opcional)
- Centrífuga recogido PRP a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y conservar los gránulos de la plaqueta.
- Lave suavemente las pelotillas añadiendo 5 mL de tampón CGS (glucosa trisodio de citrato y 30 mM de 12,9 mM, 120 mM NaCl, pH 6,5) y centrifugar a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender los pellets de plaquetas con 3 mL de buffer Tyrode modificado (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucosa pH 7.4).
- Diluir las plaquetas (1: 100, como ejemplo, 10 μl de las plaquetas en 990 μl de solución de Rees Ecker) con solución de Rees Ecker y cuenta por hemocitómetro.
- Ajustar la densidad de las plaquetas a 3 x 108 células/mL mediante la adición de buffer Tyrode.
- Incubar la suspensión de plaquetas a 37 ° C durante 1 hora antes de comenzar el experimento.
Nota: Plaquetas lavadas son estables durante 5 – 8 h a 37 ° C.
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Preparación de lavado de glóbulos rojos (RBC)
- Después de la colección, centrifugar el sedimento suave obtenido en el paso 1.1.3 a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y lavar el pellet de RBC con 5 mL de PBS por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Repetir esta operación 3 veces.
- Descartar el PBS y los glóbulos rojos lavados para experimentos adicionales.
2. detracción de oxígeno
- Añadir 1 mL de la mezcla de PRP (preparado en el paso 1.1.4. o 1.2.4.) y los glóbulos rojos (preparados en el paso 1.3.) en el hematocrito deseado en una botella de polipropileno cerrado con un tapón de caucho. Por ejemplo, en el 20% de hematocrito, añadir 200 μL de glóbulos rojos a 800 μl de PRP.
Nota: Sugerido los hematocritos son de 0% hasta un 40%. No utilice una botella de cristal o frasco que las plaquetas se adhieren a la superficie de vidrio. - Inserte la aguja conectada al tanque de gas de helio dentro de la botella cerrada y hacer la salida de gas inserción de una aguja de 26 G (figura 1).
- Agite lentamente la botella a temperatura ambiente.
Nota: No permita que el gas de la burbuja a través de la preparación de la sangre. Flujo de gas lento es preferible para este procedimiento, y flujo de gas de excesivamente rápida conduce a hemólisis creciente. El flujo de gas más eficiente debe determinarse por ensayo, ya que depende altamente de la geometría de la instalación experimental. - Seguir periódicamente el proceso de desoxigenación mediante la medición de la presión parcial de oxígeno (pO2) con un cooxímetro.
Nota: En nuestras manos, a 10 min de detracción de oxígeno disminuye pO2 a 25 mmHg que se requiere para la reducción de nitrito por gr. continuar desoxigenación adicional reducir pO2 a 10 mmHg; sin embargo, condujo al aumento de la hemólisis y aumento de hemoglobina libre (figura 2).
3. glóbulos rojos nitrito reducción
- Añadir 1 mL de PBS (pH 7.4) en 0,0345 g de NaNO2 500 mM solución stock de nitrito. Diluir 500 mM NaNO2 a 250 μm NaNO2 (25 x) por dilución seriada en PBS (pH 7.4).
- Usar una microjeringa, inyectar nitrito (40 μL) a través del tabique la desoxigenada muestra de PRP y los glóbulos rojos para obtener concentraciones finales de 10 μm en total 1 mL de muestra.
Nota: En este experimento las concentraciones finales de nitrito usado es 10 μm. - Incubar la muestra a 37 ° C durante 10 minutos o más.
Nota: Ajuste la duración exacta de la incubación de RBC con nitrito necesaria para la reducción de nitrito máximo para diferentes tipos de experimentos. - Retire el tapón y la pipeta 1 mL de la muestra en un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugue a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Con una pipeta 300 μL de la suspensión de plaquetas de la porción superior del sobrenadante y mezclar con ACD (pH 6.5) con una relación 1:9. Deseche los pellets de RBC.
- Centrifugue la suspensión de plaquetas a 500 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
- Agregar 80 μl de tampón de lisis helada (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) con inhibidor de la proteasa bolitas de Cóctel III (1: 500) de las plaquetas.
4. Western Blotting de VASP
- Carga 15 μg de la proteína de cada muestra para 2 geles de SDS-PAGE 10% separados.
Nota: Buffer extracción áspero, que contiene el b-mercaptoetanol, no puede quitar los anticuerpos P-VASPSer239 y VASP de la membrana; por lo tanto, P-VASP Ser239 y VASP deben realizarse por separado. - Funcionan los geles 120 V para la 1,30 h y transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
- Fijación no específica de bloque con 5% leche en polvo descremada.
- Incubar la membrana con P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) y GAPDH (1:1, 000) para pasar la noche a 4 ° C.
- Incubar anticuerpo secundario de peroxidasa (HRP) de rábano con la membrana por 45 min a temperatura ambiente.
- Exponer la membrana con una máquina de imager y cuantificar la densidad de la banda con ImageJ.
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Representative Results
Muestras de sangre venosa tienen valores de pO2 entre 50-80 mmHg. Desoxigenación por helio disminuye rápidamente la pO2 a 25 mmHg dentro de 10 minutos mayor detracción de oxígeno tiempo un poco más disminuciones pO2. Sin embargo, aumento del tiempo de detracción de oxígeno conduce también a significativamente mayores niveles de hemoglobina libre (determinada por co-oximetría, visualmente vista en la figura 2 como coloración cada vez más roja de plasma) (Figura 2A-B). Aumento de hemólisis no está asociada con agitación porque revolver sin detracción de oxígeno no induce hemólisis (figura 2).
Encontramos que la presencia de glóbulos rojos en muestras sometidas a lisis disminuye P-VASPSer239 y VASP detectados por Western Blot (figura 3). Por lo tanto, en primer lugar separamos las plaquetas y los glóbulos rojos antes de ejecutar el Western blot para detectar P-VASPSer239 en plaquetas.
Para demostrar que hay suficiente tiempo para separar los glóbulos rojos de las plaquetas sin afectar la fosforilación de la VASP, no se utilizan un de breve duración donantes. PROLI NONOate (ninguÌ n donante con vida media de 1.8 s a 37 C pH 7.4), rápidamente aumentó P-VASPSer239 en plaquetas (dentro de los 10 s de incubación). P-VASPSer239 inducida por PROLI NONOate se detecta durante 10 min después de la incubación con PRP (figura 4).
Nitrito aumenta P-VASPSer239 en plaquetas en presencia de glóbulos rojos sin oxígeno (pO2 25 mmHg). Actividad de reductase del nitrito de glóbulos rojos sin oxígeno depende del hematocrito y el efecto máximo se observa en el 20% de hematocrito (figura 5).
Figura 1: cámara de desoxigenación. Mezcla de PRP y los glóbulos rojos se añade en una botella de plástico cerrada con una membrana de goma. La botella cerrada está conectada a la línea del helio (él) utilizando una aguja. Oxígeno es arrastrado por una aguja de jeringa pequeña (26 G) que sirve como una salida de gas.
Figura 2: Presión parcial de oxígeno (pO2) y hemoglobina libre después de desoxigenación. Las muestras de PRP (A) y los glóbulos rojos eran desoxigenadas para 3, 5, 10, 15, 30 y 50 minutos pO2 de muestras fueron medidos por el analizador del gas de sangre (n = 3). Barras de error se muestran imágenes de SEM. representante del sobrenadante de las muestras PRP + gr revuelto con (B) o sin helio (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante VASP Western blot bandas las muestras de PRP/glóbulos rojos preparados en diferentes hematocrito. Los glóbulos rojos fueron agregados en PRP a 1, 5, 10, 15, 20, 40% de hematocrito. Mezclas de PRP + glóbulos rojos fueron centrifugados a 500 x g durante 5 min y lisis con tampón de lisis.
Figura 4: Representante Western blot bandas P-VASPSer239 y VASP en PRP después de la exposición a ningún donante PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 M) fue agregado en PRP y se incubó a 37 ° C durante 10 a 30 s y 1, 2, 5, 10, 20 y 40 minutos.
Figura 5: VASPSer239 fosforilación depende de los niveles2 y hematocrito pO. (A) PRP + glóbulos rojos (hematocrito del 20%) fueron desoxigenada a dos niveles de diferente pO2 , 40 y 25 mmHg. P-VASPSer239 y VASP fueron medidos después de la incubación de muestras oxigenadas con nitrito de 10 M a 37 ° C durante 10 minutos (B) nitritos (10 M) se añadió desoxigenada PRP + gr a 0, 10, 20 y 40% de hematocrito (pO2 = 25 mmHg). Veces mayor (P-VASPSer239) se calculan con respecto control (PRP + gr sin nitrito) para cada valor de hematocrito. Barras de error = SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Puesto que las plaquetas se activan fácilmente, suave manejo de plaquetas que contienen las muestras se requiere. Debe evitarse uso rápido y vigoroso. Plaquetarios tales como prostaciclina (PGI2) pueden utilizarse para prevenir la activación plaquetaria; sin embargo, esto puede afectar algunas vías de señalización dentro de las plaquetas. Para la preparación de gránulos de la plaqueta, añadir ACD a las suspensiones de plaquetas y utilizar centrifugación a baja velocidad.
Recién preparadas plaquetas en el PRP tienen una vida limitada abarcan, hasta 2 h. Para lograr alta reproducibilidad, todos los experimentos deben hacerse sólo con plaquetas frescas y dentro de 2 h después de la recolección de sangre. Los datos presentados se obtuvieron con las plaquetas en el PRP, que se considera más fisiológica que las plaquetas lavadas. Aunque la vida y pureza aumentan para las plaquetas lavadas, centrifugación repetida durante la preparación de plaquetas lavadas puede conducir a la activación espontánea y esto puede resultar en calidad inconsistente de los preparados de plaquetas. PRP es preferible sobre plaquetas lavadas ya que el procedimiento es más rápido y más manipulación podría activar las plaquetas. Sin embargo, en casos específicos, cuando la interferencia de factores de coagulación de plasma podría interferir con la instalación experimental, lavado de plaquetas representa la solución para evitar estos problemas.
Contaminación por oxígeno en muestras desoxigenadas es el paso más importante de la crítico de este ensayo. Los glóbulos rojos pueden ser agrupados y sin oxígeno antes de ser añadido al PRP. Sin embargo, transferencia de glóbulos rojos sin oxígeno aumenta el riesgo de contaminación de oxígeno. Además, desoxidación de glóbulos rojos concentrados requiere más tiempo que la desoxigenación de la preparación completa en el hematocrito deseado, y una exposición más larga a gas conduce al aumento de los niveles de hemoglobina libre. Aunque la hemoglobina libre se puede lavar de glóbulos rojos sin oxígeno, la solución salina buffer de fosfato u otros búferes utilizados para el lavado deben ser cuidadosamente sin oxígeno para evitar la contaminación del oxígeno durante la centrifugación. Para acortar el proceso de preparación y evitar la contaminación innecesaria del oxígeno, cada muestra PRP + RBCs se preparó en el hematocrito deseado primero y luego sin oxígeno antes de la adición de nitrito.
Para cuantificar P-VASPSer239 por Western blot, los glóbulos rojos deben estar separados de las plaquetas. VASP se expresa en los glóbulos rojos13, pero los niveles son mucho más bajo que en las plaquetas y no significativo cuando se compara a la hemoglobina. Desde la concentración de proteína total se utiliza para cargar los controles en el Western Blot, la presencia de glóbulos rojos en muestras de lisado interfiere con P-VASP y medición de VASP por borrar occidental. Debido a un ritmo lento de la desfosforilación de las enzimas fosfatasa en plaquetas14, P-VASP se mantiene durante 10 minutos (figura 4) y por lo tanto es posible separar los glóbulos rojos por centrifugación antes de recoger los lysates de la célula de la plaqueta.
CE50 para fosforilación de VASP es casi un orden de magnitud menor que el de CE50 para el cGMP de pico aumenta, 0,5 nM y 9 nM, respectivamente3, que hace la fosforilación de VASP, uno de los métodos más sensibles para detectar la presencia de bajas cantidades de NO. Sin embargo, la curva de fosforilación de la VASP en respuesta a NO es en forma de campana; una disminución de la fosforilación se observa después de un pico a 3-30 nM de3. Esta respuesta no lineal al no aumentar las concentraciones de hace VASP no riguroso sin cuantificación.
Puesto que las plaquetas en el PRP tienen una vida corta, el ensayo debe realizarse en plaquetas frescas dentro de 2 h después de extraer sangre. La inconsistencia de los niveles de2 pO después de detracción de oxígeno se puede encontrar desde la desoxigenación de las muestras depende de la tasa de flujo de gas helio y tasa de la botella se arremolinan. Por lo tanto, el tiempo de detracción de oxígeno debe ser determinado por ensayo. Para la medición de P-VASP por Western Blot, la elección del anticuerpo es crítico y hay que no usar un directo donantes como control positivo para determinar la especificidad. Además de n, P-VASPSer239 en plaquetas puede ser fosforilado por la inhibición de las enzimas phosphodiesterease y la activación de la proteína quinasa un camino.
La medición de la P-VASPSer239 tiene algunas ventajas sobre el análisis de cGMP. GMPC en las plaquetas tiene una vida media muy corta (menos de 10 s) y la medida de cGMP requiere la adición de inhibidor de la fosfodiesterasa3. También, la medición de cGMP utiliza una técnica de ELISA más bien cara. VASP puede medirse simplemente por un protocolo interno de Western blot y por lo tanto es más fácilmente disponible.
Mayor P-VASPSer239 en plaquetas fue utilizado con éxito como un sensor para la NO generación de nitrito inhalado en vivo6. Por lo tanto, nos demostró que es posible utilizar P-VASPSer239 en plaquetas como marcador de ninguna generación in vitro e in vivo en la sangre y posiblemente en otras situaciones diversas. El inusualmente bajo EC50 hace que este método un candidato excelente para detectar la presencia de muy baja no hay concentraciones en la sangre. Por lo tanto, este protocolo proporciona una posibilidad para no estudiar ninguna generación en la sangre en varios estímulos fisiológicos, tales como durante la cascada de coagulación sanguínea, aumentado tensión pura o aumenta la inflamación.
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Disclosures
Dr. Alan Schechter está catalogado como un coinventor en varias patentes publicadas a los institutos nacionales de salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Recibe a regalías basados en NIH licencias de las patentes para el desarrollo clínico, pero ninguna otra compensación.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por beca intramural NIH a Dr. Alan N. Schechter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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