Summary
Syftet med denna artikel är att ge en omfattande, systematisk guide till effektiv rening av histoner H3 och H4 och kvantifiering av acetylerade Histon rester.
Abstract
I alla eukaryota organismer är kromatin, fysiologiska mallen av all genetisk information, som väsentliga för ärftlighet. Kromatin är föremål för en rad olika posttranslationell ändringar (PTMs) som främst förekommer i amino termini Histon proteiner (dvs, Histon svans) och reglerar tillgänglighet och funktionellt tillstånd i de underliggande DNA. Histon svansar sträcker sig från kärnan i nukleosomens och är föremål för tillägg av acetyl grupper av Histon acetyltransferaser (hattar) och avlägsnande av acetyl grupper av Histon deacetylases (HDAC) under celltillväxt och differentiering. Specifika acetylering mönster på lysin (K) rester på Histon klave avgöra en dynamisk homeostas mellan transcriptionally aktiv eller transcriptionally bortträngda kromatin genom att (1) påverka core Histon församlingen och (2) rekrytera synergistisk eller antagonistiska kromatin-associerade proteiner till webbplatsen transkription. Grundläggande regelverk mekanismen av den komplicerade karaktären av Histon svans PTMs påverkar majoriteten av kromatin-mallade processer och resultat i förändringar i cell mognad och differentiering i både normal och patologisk utveckling. Målet med den aktuella rapporten är att ge nybörjare en effektiv metod att rena core Histon proteiner från celler och hjärnvävnad och tillförlitligt kvantifiera acetylering märken på histoner H3 och H4.
Introduction
Den termen epigenetiken refererar till ärftliga förändringar i genen aktivitet som uppstår självständigt från förändringar i DNA sekvens1,2. Transkription av gener och förtryck bestäms av (1) tillgängligheten av kromosomala DNA lindad runt en octamer av core Histon proteiner (två kopior varje H2A H2B, H3 och H4) och (2) tillgänglighet för transkriptionsfaktorer och schavotten proteiner rekryteras till specifika promotorn platser3,4. Transkription av gener regleras av enzymet-medierad ändringar av specifika DNA arrangören platser och PTMs av Histon svansar5,6,7. N-termini Histon H3 och H4 är bland de mest mycket sekvenser känd i eukaryota organismer3, och deras posttranslationell ändringar har dokumenterats i stor utsträckning för att spela en central roll vid fastställandet av kromatinstruktur och funktion8,9. PTMs på Histon svansar (dvs, acetylering, metylering, fosforylering och ubikvitinering) ändra för svansar, påverka strukturella staten och vikning av kromatin fiber, och därmed reglera DNA tillgänglighet och bearbetning4,10,11,12. Acetyl grupper läggs till och tas bort från K rester på Histon svansar av en uppsättning särskilda Histon-interagera epigenetiska enzymer, nämligen hattar och HDAC, respektive13. Till exempel har acetylering av Histon H4 på lysin 12 (H4K12ac) visat tidigare att aktivera transkriptionen av gener besläktade med minne förvärv och konsolidering14. Dessutom tyder flera rader av bevis på att enzym-medierad epigenetiska kontrollen av gentranskription är en avgörande aspekt av friska cellulära tillväxt och differentiering6,15. Växlingen i epigenetisk reglering av genuttryck, antingen av epigenetiska förändringar av DNA eller av en mutation av de epigenetiska enzymerna själva, har visat sig vara dysreglerad i mänskliga sjukdomar där förändring i en särskild gen aktivitet är ett signum i patologi (t.ex., cancer)6,16,17. Således, utvärdering av förändringar i core Histon PTMs framstår som ett högt värde mål för potentiella terapeutiska interventioner. Dock har att fastställa överflödet, samverkande partners och specifika roller av histoner PTMs bevisats utmanande18.
I det aktuella betänkandet beskrivs en optimerad, medium-genomströmning strategi att rena core histoner från celler och hjärna vävnader i en enda del och ett komplett protokoll för kvantifiering av histoner H3 och H4 PTMs. Notera, även om för närvarande publicerade syra-baserade rening tekniker och antikroppsbaserade Histon upptäckt strategier har allmänt antagits för Histon karakterisering, de saknar beskrivande detaljer angående kritiska steg av förfarandet således hindra snabb och replikerbar Histon utvinning och kvantifiering. Till exempel bearbetning av cell extrahera och vävnadsbiopsier kräver olika verktyg och tekniker för framgångsrik extraktion. Optimerad protokollet presenteras i det nuvarande manuskriptet visar dessutom en praktisk, medium-genomströmning strategi. Core histoner utvinns som en enda, ren fraktion, som möjliggör tillförlitlig nedströms antikroppsmedierad PTM upptäckt utan inblandning från orenheter. Dessutom i det nuvarande manuskriptet, har utmaningarna angående Histon upptäckt på grund av deras små molekylvikt kringgåtts. Typiskt, bristen på kompatibilitet mellan rening, kvantifiering och gelelektrofores protokoll hindra forskare från Replikerbar och avgörande resultat. Här presenteras ett optimerat arbetsflöde att rena core histoner från celler och vävnad och förbereda dem för nedströms PTM analyser via western blot.
Det nuvarande protokollet möjliggör rening av core Histon proteiner samtidigt som deras infödda posttranslationell ändringar (dvs., acetylering, metylering och fosforylering). Figur 1 illustrerar tidslinjen av protokollet Histon rening.
Protocol
Alla möss var inrymt i en fukt - och temperatur-kontrollerad, AAALAC-ackrediterade djuranläggningen vid University of Miami Miller School of Medicine. Alla experiment godkändes av University of Miami Miller School av medicin institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och genomfördes enligt specifikationerna för NIH.
1. beredning av provlösningen
-
Vidhäftande celler
- Platta celler i 10 cm rätter i den lämpliga odlingsmedier (1 x 106 till 1 x 109 celler per maträtt för cellinjer, såsom BV2, HEK-293, och SH-SY5Y, men ~ 1 x 1015 celler per maträtt för primära celler, såsom primära kortikala nervceller). Försäkra att cellerna fördelas lika på hela ytan av plattan och låta cellerna att växa för 48 h att nå ~ 100% sammanflödet (37 ° C, 5% CO2).
- När cellerna har nått den önskade konfluens, försiktigt aspirera kultur media och tvätta cellerna 2 x med förvärmd serum-fria medier under en vävnadskultur huv.
- Aspirera serumfritt media från skålen och tillsätt 1 mL iskallt utvinning buffert (0,4 M svavelsyra, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] och 1 x proteashämmare cocktail) till varje maträtt.
- Använd en plast cell skrapa för att samla alla celler i utvinning bufferten (genom skrapning) och överföra dem till en 1,5 mL märkt röret med 1000 µL pipett. Pipettera cellerna upp och ner 3 x att underlätta homogenisering.
- Stäng alla rör och omedelbart sätta dem på isen.
-
Hjärnvävnad
- Om fryst vävnad används, placera vävnaden i en prechilled 1,5 mL tub och kort Tina den på is. Om färsk vävnad används, omedelbart gå vidare till steg 1.2.2.
Obs: Det nuvarande protokollet beskriver procedurer använder frysta mus hjärnan och mus prefrontala cortex prover. - Homogenisera vävnaderna med hjälp av en handhållen Dounce Homogenisatorer med lämplig mängd utvinning buffert och rekommenderade antal slag (tabell 1). För att undvika överdriven kromatin fragmentering, Överskrid inte antalet rekommenderade simtag.
- Använda en enda kanal 1000 µL pipett, överföra Homogenatet till en prechilled 1,5 mL tub. Stäng alla rör och omedelbart sätta dem på isen.
- Om fryst vävnad används, placera vävnaden i en prechilled 1,5 mL tub och kort Tina den på is. Om färsk vävnad används, omedelbart gå vidare till steg 1.2.2.
2. upprättande av rå Histon extraktet
- Placera de 1,5 mL rör som innehåller celler eller vävnad upphängd i utvinning buffert på en roterande plattform och rotera vid 15 rpm vid 4 ° C för att utvinning av råolja histoner.
Obs: Utvinning tiden kan variera för olika cell- och vävnadstyper och måste optimeras för varje procedur. Det nuvarande protokollet presenterar resultaten efter 15 min, 2 h och 24 h extraktion (figur 2, figur 3, figur 4och figur 5). - Prechill i mikrocentrifug till 4 ° C. Efter önskad utvinning tid har gått, Centrifugera rören med maximal hastighet i 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten inklusive råolja Histonerna till en ny, prechilled 1,5 mL tub. Kassera pelleten.
- Lagra supernatanten vid-80 ° C (utvinning kan stoppas vid detta steg, se ”stopp steg” i figur 1) eller genast fortsätta till nästa steg.
- Neutralisera rå Histonerna med 1/4 volym 5 x neutralisering buffert (t.ex., tillsätt 250 µL 5 x neutralisering buffert i 1 mL av rå histoner). Blanda väl genom pipettering upp och ner 6 x.
- Kontrollera pH-värdet i blandningen med pH-remsor. Justera detta genom att lägga till fler neutralisering buffert för att nå ett pH på 7.
- Utvärdera förekomst av Histon och nonhistone protein i den råa Histon extrahera följande (figur 2).
- Lägg till 37,5 µL av provet till 12,5 µL av 4 x (Laemmli) prov buffert och denaturera för 10 min vid 99 ° C.
- Ladda provet på en SDS-PAGE gel och kör gelen för 1 h vid 100 V.
- Fläcken gelen över natten med Coomassie Brilliant Blue R-250 färglösningen och avfärga under tre på varandra följande tvättar (1 h/tvätt) med Coomassie Brilliant Blue R-250 avfärgning lösning.
Obs: Rå histoner (figur 2) kan jämföras med eluerade och renat histoner (dvskolumn ingång [figur 5A]).
3. rening av Core histoner
-
Spin kolumn Jämviktstiden
- Tillsätt 500 µL Jämviktstiden buffert i varje spin kolumn används. Vid inte kolumnen membranet.
- Centrifugera vid 4 ° C under 3 minuter vid 800 x g. Kassera genomflöde. Upprepa 1 x.
-
Histon rening
- Tillsätt 500 µL av provet av intresse från steg 2,6 till kolumnen. Centrifugera vid 4 ° C under 3 minuter vid 800 x g. Samla genomflöde.
- Upprepa föregående steg så många gånger som nödvändigt att ladda hela provet på kolumnen. Överfyll inte kolumnen spin.
- Kombinera genomströmmande från varje centrifugeringssteget att analysera kolumn-bindande effektivitet (figur 3).
- Följ steg 2,7 att analysera den kolumn genomströmning.
-
Kolumnen wash
- Tillsätt 500 µL tvättlösning till varje kolumn. Centrifugera vid 4 ° C under 3 minuter vid 800 x g. Samla den genomströmmande tvätten (tvätta #1).
- Upprepa steg 3.3.1 för sammanlagt tre tvättar. Samla de genomströmmande tvättarna #2 och #3. Inte poolen de på varandra följande kolumn genomflöde tvättarna.
- För att ytterligare utvärdera kolumnens Histon-bindande effektivitet, analysera de tre kolumn tvättarna enligt steg 2,7 (figur 4).
-
Histon eluering
- Över kolumnen till en ny märkta 1,5 mL tub.
- Tillsätt 50 µL av Histon eluering bufferten. Centrifugera vid 4 ° C under 3 minuter vid 800 x g. Spara de genomströmmande innehållande Histon proteinerna.
- För en ytterligare eluering, upprepa steg 3.4.2. Blanda inte de första och andra genomflöde vineluat som skiljer de sig i Histon kvantitet och renhet.
4. utfällning av Core histoner
- Lägga till perklorsyra (PCA) i renat Histonerna till en slutlig koncentration på 4% PCA (t.ex., tillsätt 3 µL av 70% PCA till 50 µL av renat histoner från steg 3.4.2.
- Centrifugera i 3 s samla alla kvarvarande vätskan från rörväggen. Blanda genom pipettering upp och ner 6 x.
- Placera rören i ett rack och Inkubera under 24 timmar vid 4 ° C.
- Nästa dag, prechill en mikrocentrifug till 4 ° C och centrifugera proverna för 75 min med maximal hastighet vid 4 ° C.
- Efter centrifugeringen är klar, syns en liten vit pellet som innehåller utfällda histoner på botten av röret. Gör inte vortex provet.
- Noggrant Aspirera supernatanten och, utan att störa pelleten, tillsätt 500 µL av iskall 4% PCA till provet.
- Centrifugera vid 4 ° C i 10 min på högsta hastighet. Noggrant Aspirera supernatanten.
- Upprepa steg 4,7 2 x.
- Utan att störa pelleten, tillsätt 500 µL av iskall aceton. Centrifugera vid 4 ° C i 10 min på högsta hastighet. Noggrant Aspirera supernatanten.
- Upprepa steg 4,9 2 x.
- Noggrant Aspirera supernatanten, lämna rören icke-utjämnade och låt den torka på is för 30 min. Kontrollera om alla kvarvarande aceton har avdunstat.
- Lämna rören icke-utjämnade och låt den torka vid rumstemperatur (RT) för 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 30 µL sterilt vatten. Gör inte Pipettera upp och ner. Snärta röret försiktigt med ett finger.
- Förslut alla rör och tillåta Histonerna att rekonstruera på is för 30-50 min, beroende på pelleten storleken. Kontrollera om pelleten är resuspended.
- Cap alla rör och låt pelleten att ytterligare resuspendera på RT för 5 min.
Obs: Denna lösning (första och andra eluering från steg 3.4.3) utgörs av renat och desalted histoner och kan användas för ytterligare kvantifiering och Histon acetylering analys.
5. kvantifiering av eluerade Histon proteiner
- Använd en spektrofotometer enligt tillverkarens protokollet för att kvantifiera de totala Histon proteiner erhålls efter den slutliga elueringen i steg 4.15. Mät absorbansen vid 230 nm. Spela in A260/A280 kvoten vägledande av provet föroreningen med nukleinsyra.
- Använd följande formel för att beräkna Histon koncentrationen (x):
Här är OD den optiska densiteten mäts vid A230 nm. - Histon koncentrationen ~1.5 mg/mL anses en genomsnittsavkastning för cellinjer, medan en Histon koncentration av ~5.0 mg/mL anses vara en genomsnittsavkastning för 30 mg vävnad.
6. Western Blot analys
- Justera den renade och eluerat Histon från steg 4.15 till ~ 10 µg av Histon protein/provet.
- Tillsätt lämplig mängd vatten och 4 x Laemmli prov buffert att justera lastning volymerna.
- Denaturera proverna för 10 min vid 99 ° C. Kyl dem på isen. Centrifugera i 3 s att samla alla kvarvarande vätskan och kondens från rörväggen.
- Ladda proverna på en SDS-PAGE gel och kör gelen för 1 h vid 100 V.
- För att visualisera totala Histon protein, fläcken gelen över natten med Coomassie Brilliant Blue R-250 färglösningen och avfärga under tre på varandra följande tvättar (1 h/tvätt) med Coomassie Brilliant Blue R-250 avfärgning lösning.
Obs: Den första elueringen av Histon proteiner innehåller högkvalitativa histoner (figur 5A) medan den andra elueringen innehåller låg till ingen nivåer av histoner (figur 5B). - För att kvantifiera Histon PTMs, använda ett system (se Tabell för material) för att överföra Histon proteinet från SDS-PAGE gelen (steg 6,4) på ett PVDF membran.
- För att montera överföring smörgås, öppna överföring system kassetten och placera PVDF membran stacken (märkt som botten +) på botten av kassetten med membranet uppåt. Rulla membranet försiktigt med en blot roller att ta bort eventuell luft mellan stacken och membranet.
- Lekmanna-gelen ovanpå membranet, rulla gelen försiktigt med en blot roller att ta bort eventuell luft mellan membranet och gelen och placera den övre stacken på gelen. Rulla försiktigt igen och placera kassettluckan ovanpå smörgås, tryck ner och vrid nob medurs för att låsa.
- Sätt i kassett till överföring system slot. På skärmen med apparat Välj Turbo protokoll. Använd en 3 min protokoll för en enda mini gel eller ett 7 min protokoll för mer än två mini geler.
- Fläcken membranet med Ponceau S fläcken för 5 min och visualisera de totala Histon proteinerna.
- Tvätta dem i 1 x Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) med 0,1% Tween-20 för 2 h och blockera dem i 5% mjölk för 1 h. Inkubera med primär och sekundär antikropp (övernattning på 4 ° C eller 1 h på RT, respektive) eller enligt ett tidigare optimerade protokoll.
Obs: I nuvarande protokoll, antikroppar mot acetylerade histoner H4K12 (figur 6 och figur 7) och H3K27 (figur 8) användes.
Representative Results
För att illustrera utvecklingen av protokollet Histon rening och sammansättning av alla analyserade fraktioner, utvärderat vi olika Histon extrakt från mänskliga mikrogliaceller BV2. För att demonstrera kvantifiering av histoner H3 och H4 PTMs (dvs, acetylering), använde vi hjärnan vävnad lysates.
BV2 celler var klädd på 5 x 106 celler per maträtt i 10 cm vävnadsodling-behandlade rätter och tillät för att växa till konfluens för 48 h. samlades sedan cellerna och histoner släpptes från kromatin genom en inkubation i utvinning buffert innehållande 0,4 M svavelsyra, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 1 x proteashämmare. Utvinning tiden, mellan 15 min och 24 h, påverkade inte den totala sammansättningen av rå Histon extrakt som bestäms av Coomassie Brilliant Blue färgning (figur 2). Nästa, rå histoner var passerade skakad Histon kolumner och genomströmmande analyserades. Kolumn-bindande högeffektiv bestäms av avsaknad av Histon protein i genomströmmande när analyseras av Coomassie Brilliant Blue färgning. Vi har fastställt kolumn-bindande effektiviteten för att vara 100% som det fanns inga detekterbara Histon proteiner närvarande i de analyserade genomflöde (figur 3). Alla membran med bundna histoner spolades sedan tre gånger med tvättbuffert att avlägsna eventuella återstående föroreningar, lämnar bara Histon proteiner bunden till kiselgel. Vi fast beslutna att för alla Histon utvinning gånger (dvs, 15 min, 2 h och 24 h), den första membran tvätten var det viktigaste att ta bort nonhistone föroreningar från kolumner, medan de andra och tredje tvättarna inte påverkade provet renhet. Således, beroende på Provtyp av, de två sista tvättarna kan utelämnas. Efter den första elueringen av Histon protein från kolumnen (med eluering buffert innehållande 1mM NaCl och EDTA), histoner var fällt över natten med 4% perklorsyra och sedan pelleterat, tvättas och analyseras för anrikningen av renat histoner H3 och H4. Vi observerade att 24 h utvinning tid ökar mängden H3 och H4 histoner i renat fraktionen jämfört med 15 min och 2 h utvinning tid (figur 5A). Den andra elueringen från kolumnen resulterade inte i hög kvalitet eller high-mängd histoner (figur 5B).
Nästa, vi använde hjärnan vävnad homogenates för att kvantifiera Histon H3 och H4 PTMs, nämligen acetylering. Vildtyp (C57BL6/J) manliga möss var administreras ett brett verkande HDAC-hämmare (tributyrin) i en dos på 5 g/kg oralt för 3 d. hela-brain vävnad samlades på dag 4 och rå histoner utvanns enligt protokollet beskrivs. Med hjälp av ett oparat t-test, vi fast beslutna att tributyrin ökar acetylering av histoner i den råa extraktet (t(6) = 6.184, P = 0,0004); dock upptäcks orenheter i extraktet (banden Histon inte definieras klart). H4K12ac antikropp har således inte en hög specificitet (figur 6). För att ytterligare utvärdera tillämpligheten av presenterade protokollet till mindre vävnadssnitt, vi samlat prefrontala cortex från triple transgena Alzheimers sjukdom (3 x Tg-AD) möss behandlades dagligen med 10 mg/kg M344, en klass jag och IIb HDAC-hämmare, för fyra månader. Histon rening och nederbörd utfördes enligt häri beskrivna protokollet. Med hjälp av renat Histon H3 och H4 bråkdel, vi fast beslutna att M344 ökar H4K12 acetylering 2,4-faldigt (t(6) = 13.03, P < 0,0001), med en hög specificitet av H4K12ac antikroppar (figur 7). Likaså observerat vi en ökning av Histon H3 acetylering i BV2 celler som svar på en annan HDAC-hämmare, nämligen den selektiva HDAC3 hämmaren, RGFP-966. 10 µM RGFP-966 orsaker en cirka tvåfaldig ökning av acetylering på Histon H3K27 efter 24 h behandling. Studenten är oparade t-test användes för att jämföra kontroll kontra behandlade celler.
Figur 1: tidslinje av protokollet Histon rening. Alla åtgärder för Histon analyser visas nedan tillsammans med den uppskatta tid som behövs för varje steg. Siffror som skildrar resultatet av särskilda stegen och presenteras inom manuskriptet anges i parentes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa Coomassie Brilliant blå-färgade gel visar rå histoner utvinns ur BV2 celler. BV2 celler odlades för 48 h innan protokollet Histon utvinning började. Råolja histoner utvanns för 15 min, 2 h och 24 h, med tre replikat för varje tidpunkt (detta är också fallet i figur 3, figur 4och figur 5). Både nonhistone och Histon proteiner finns i rå Histon extraktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa Coomassie Brilliant blå-färgade gel visar kolumnen genomflöde följande Histon rening steg från BV2 celler. Efter rå Histon passerar genom kolumnen Histon bindande, är endast nonhistone proteiner närvarande i genomflöde. Histon proteiner är frånvarande i denna fraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representant Coomassie Brilliant blå-färgade gel visar en kolumn tvätt efter en Histon reningssteg från BV2 celler. Oavsett de Histon utvinning gånger fanns vilket var (A) 15 min, (B), 2 h, eller (C) 24 h, små mängder av nonhistone proteiner endast i kolumnen första-tvätta histonebinding. Histon proteiner var frånvarande i alla tvättar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa Coomassie Brilliant blå-färgade gel visar elutions efter en Histon reningssteg från BV2 celler. (A) högkvalitativ renad och avsaltat Histon H3 och H4 upptäcktes efter den första elueringen från kolumnen Histon rening. (B) den andra elueringen från Histon rening kolumn ger inte en hög kvalitet eller kvantitet av histoner H3 eller H4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: den i stort sett agerar HDAC-hämmare, tributyrin, ökar H4K12 acetylering i hela hjärnan av vildtyp möss. (A) i denna panel visas en representant western blot föreställande en ökning av H4K12 acetylering i den råa Histon extrahera samlas från hela hjärnan av vildtyp möss som svar på den i stort sett tillförordnade HDAC-hämmare, tributyrin. (B) denna panel visar kvantifiering av ökningen i H4K12 acetylering i vivo. Oparade t-test användes för att jämföra grupper (t(6) = 6.076, P = 0,0005). Staplarna representerar den genomsnittliga ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). N = 8. P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: klassen jag och IIb HDAC-hämmare, M344, ökar H4K12 acetylering i prefrontala cortex av triple transgena Alzheimers sjukdom (3 x Tg-AD) möss. (A) i denna panel visas en representant western blot föreställande en ökning av H4K12 acetylering i renat och desalted Histon extrakt som samlas in från den prefrontala cortexen av 3 x Tg-AD möss som svar på hämning av HDAC av M344. (B) i denna panel visas kvantifiering av förhöjningen av H4K12 acetylering som svar på M344 administreras dosen 10 mg/kg dagligen i fyra månader. Oparade t-test användes för att jämföra grupper (t(6) = 13.30, P < 0,0001). Staplarna representerar den medelvärde ± SEM N = 8. P < 0,00001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: de selektiva HDAC3-hämmaren, RGFP-966, ökar H3K27 acetylering i BV2 mikrogliaceller. (A) denna panel visar en representativ western blot föreställande en ökning av H3K27 acetylering renat och desalted Histon extraktet som samlas in från BV2 celler som svar på den HDAC3 hämningen av RGFP-966. (B) RGFP-966 orsakar en cirka tvåfaldig ökning av acetylering Histon H3 och lysin (K) 27 24 timmar efter behandling. Oparade t-test användes för att jämföra kontroll kontra behandlade celler (t(4) = 5.981, P = 0,002). Staplarna representerar den medelvärde ± SEM N = 6. P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Representativa vävnad (ena hjärnhalvan) * | Genomsnittliga vävnad vikt (mg) | Utvinning buffert (mL) | Antal slag |
| Mus lillhjärnan | 40 | 1 | 40 |
| Mus frontala cortex | 30 | 0,3 | 20 |
| Mus hippocampus | 27 | 0,3 | 18 |
| Mus entorhinal cortex | 19 | 0,3 | 17 |
| * Alla experiment utfördes på vuxna manliga möss. | |||
| Snittålder: 16 månader. Genomsnittlig vikt: 30 gram. | |||
Tabell 1: Optimerad förutsättning för hjärnans vävnad homogenisering.
Discussion
I det nuvarande arbetet visat vi en optimerad metod för att rena core Histon proteiner och kvantifiera Histon H3 och H4 PTMs (e.g., acetylering). Presenterade protokollet är ett heltäckande arbetsflöde som innehåller optimerad förfaranden angående celler och hjärna vävnad förberedelse, rå Histon rening och detaljerad Histon nederbörd, elueringen och kvantifiering, som följs av Histon elektrofores och robust Histon PTM kvantifiering. Den stora mängden detaljer som ges här möjliggör en replikerbar generation av högkvalitativa data, trots behovet av långa manipulationer av Histon proverna.
Många aktuella publicerade protokoll kräver användning av HPLC att isolera rena fraktioner av histoner H3 och H419. Även om HPLC är en kraftfull teknik, avskräcka dess komplexitet och låg genomströmning de flesta molekylärbiologer och nonexperts från dess frekventa användning. Faktiskt, HPLC är inte tillgänglig för många laboratorier och högutbildad personal krävs för att använda instrumentet. HPLC är ofta tidskrävande, dyra och potentiellt farliga. Presenteras här är en billig, medium-genomströmning strategi att uppnå resultat av liknande kvalitet som kringgår HPLC. Rapporterade strategin är också mer praktisk och passar i nästan alla lab eftersom den använder en enkel spin kolumn metod som inte kräver specialiserade instrument drift färdigheter. Dessutom utvinns Histon H3/H4 tetramer som singel, ren, och riklig bråkdel, möjliggör en tillförlitlig kvantifiering av bevarade PTMs på varje av proteiner.
PTMs är extremt känsliga för förändringar i oxidativ stress och förändringar i pH20,21. Således, i motsats till tidigare publicerade metoder18, Vi rapporterar en effektiv strategi för sköljning cellerna i serumfritt media att säkerställa en lägsta metabolic störning av cellerna och för att undvika inblandning av de infödda PTMs med serum komponenter. Det nuvarande protokollet inte bara kringgår traditionella atomkärnor isolering men också ger optimal gånger cell lysis och exakta vävnad homogenisering förfarandet som möjliggör bevarandet av kärn kuvertet samtidigt undvika nukleära aggregering. Även om utvinning tiden kan manipuleras baserat på antalet celler, den celltyp som används, den vävnad storlek, etc., är utökade lysis inte önskvärt eftersom det kan leda till lys av atomkärnor och DNA release, gör provet svårt att hantera. Ännu viktigare, finns flera kontrollpunkter i protokollet för validering av framgångsrika Histon rening (t.ex., steg 2,7 och 3.2.3). Denna strategi underlättar också felsökning under hela det långa förfarandet.
En annan viktig och unik funktion av protokollet presenteras är dess full kompatibilitet med nedströms western blot analysverktyg och andra om så önskas. Histon proteiner upptäcks på ~ 15 kDa13,22,23 och, likaså till andra små molekylvikt proteiner, har bevisat utmanande att upptäcka genom standard immunoblotting tekniker. Användning av en hög prestanda och hög genomströmning överföringssystem i kombination med optimal upplösning protein gels möjliggör upprätthållandet av protein infödda bekräftelse (i frånvaro av SDS) och aktivitet i avsaknad av SDS och hög överföring effektivitet av låg molekylvikt Histon proteiner, vilket garanterar en tillförlitlig Histon PTM kvantifiering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna uttrycker sin tacksamhet till de Florida Department of Health Ed och Ethel Moore Alzheimers forskningsprogram (bidrag 6AZ08 och 7AZ26), den NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) och American Heart Association (grant 17PRE33660831).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
| Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
| 70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
| 100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
| pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
| 4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
| Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
| 1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
| Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
| Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
| Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
| Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
| Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
| Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
| Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
| SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
| Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
| Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
| 100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
| H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |
References
- Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
- DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
- Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
- Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
- Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
- Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
- Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
- Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
- Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
- Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
- Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
- Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
- Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029 (2014).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
- Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
- Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
- Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).
