Summary
Formålet med denne artikel er at give en omfattende, systematisk guide til effektiv rensning af histonerne H3 og H4 og kvantificering af acetyleret Histon restkoncentrationer.
Abstract
I alle eukaryote organismer er kromatin, den fysiologiske skabelon af alle genetiske oplysninger, afgørende for arvelighed. Kromatin er genstand for en bred vifte af forskelligartede posttranslationelle modifikationer (PTMs), som for det meste opstår i de amino termini af Histon proteiner (dvs., Histon hale) og regulere tilgængelighed og funktionelle tilstand af den underliggende DNA. Histon haler udvide fra kernen af nucleosome og tilsætning af grupper af Histon acetyltransferases (hatte) og fjernelse af grupper af Histon deacetyltransferase (HDAC'er) under cellulære vækst og differentiering. Specifikke acetylation mønstre på lysin (K) restkoncentrationer på Histon haler bestemme en dynamisk homøostase mellem transcriptionally aktive eller transcriptionally undertrykt kromatin af (1) påvirker kernen Histon forsamling og (2) rekruttering synergistisk eller antagonistiske kromatin-associerede proteiner til webstedet transskription. De grundlæggende regulerende mekanisme af den komplekse karakter af Histon hale PTMs påvirker fleste kromatin-skabelonbaserede processer og resultater i ændringer i celle modning og differentiering i både normale og patologiske udvikling. Målet med den foreliggende betænkning er at give nybegyndere en effektiv metode til at rense core Histon proteiner fra celler og hjernevæv og pålideligt kvantificere acetylation mærker på histonerne H3 og H4.
Introduction
Sigt Epigenetik refererer til arvelige ændringer i genet aktivitet, der opstår uafhængigt af ændringer i DNA sekvens1,2. Gen transskription og undertrykkelse bestemmes af (1) adgangen til de kromosomale DNA snoet omkring en octamer af core Histon proteiner (to eksemplarer hver af H2A, H2B, H3 og H4) og (2) udbuddet af transkriptionsfaktorer og stillads proteiner rekrutteret til specifikke promotor websteder3,4. Gen transskription er reguleret af enzym-medieret ændringer af bestemte DNA promotor websteder og PTMs af Histon haler5,6,7. N-termini af Histon H3 og H4 er blandt de mest velbevarede sekvenser kendt i Eukaryote organismer3, og deres posttranslationelle modifikationer er blevet udførligt dokumenteret for at spille en central rolle i fastlæggelsen af kromatin struktur og funktionen8,9. PTMs på Histon haler (dvs., acetylation, methylering, fosforylering og ubiquitination) ændre interaktion potentiale af haler, påvirke de strukturelle tilstand og foldning af kromatin fiber, og dermed regulere DNA tilgængelighed og behandling af4,10,11,12. Acetylgrupper føjes til og fjernes fra K rester på Histon haler af en række specifikke Histon-interagere epigenetiske enzymer, nemlig hatte og HDAC'er, henholdsvis13. For eksempel, har acetylation af Histon H4 på lysin 12 (H4K12ac) tidligere vist at aktivere transkription af gener relateret til hukommelse erhvervelse og konsolidering14. Derudover tyder flere linjer af beviser på, at genet transskription enzym-medieret epigenetiske kontrol er et afgørende aspekt af sunde cellulære vækst og differentiering6,15. Vekslen i den epigenetiske regulering af genekspression, enten af epigenetiske modifikationer af DNA eller af en mutation i de epigenetiske enzymer, selv, har vist sig at være dysregulated i menneskelige sygdomme hvor ændring i et bestemt genaktivitet er kendetegnende patologi (fx, kræft)6,16,17. Således, vurdering af ændringer i kernen Histon PTMs fremstår som en høj værdi mål for potentielle terapeutiske indgreb. Dog har bestemme overfloden, interagerende partnere og specifikke roller af histonerne PTMs bevist udfordrende18.
I den aktuelle betænkning, er der beskrevet en optimeret, medium-overførselshastighed strategi til at rense core histoner fra celler og hjernen væv i en enkelt fraktion, og en fuldstændig protokol til kvantificering af histonerne H3 og H4 PTMs. Af note, selv om i øjeblikket er publiceret syre-baserede rensning teknikker og antistof-baserede Histon opdagelse strategier er blevet bredt vedtaget for Histon karakterisering, de mangler beskrivende detaljer vedrørende kritiske faser af proceduren, således hindrer hurtig og replikerbar Histon udvinding og kvantificering. For eksempel, behandling af celle uddrag og væv biopsier kræver forskellige værktøjer og teknologier for vellykket ekstraktion. Desuden viser den optimerede protokol præsenteret i de aktuelle manuskript en praktisk, medium-overførselshastighed tilgang. Core histoner er udtrukket som en enkelt, rene fraktion, som muliggør pålidelig downstream antistof-medieret PTM detektion uden indblanding fra urenheder. Desuden, i det aktuelle manuskript, har udfordringer vedrørende Histon registrering på grund af deres lille molekylvægt omgået. Typisk, manglen kompatibilitet mellem rensning, kvantificering og gel elektroforese protokoller hindre forskere fra at opnå replikerbar og afgørende resultater. Her, præsenteres en optimeret arbejdsprocessen til at rense core histoner fra celler og væv og forberede dem til downstream PTM analyser via vestlige skamplet.
Den nuværende protokol giver mulighed for rensning af core Histon proteiner samtidig bevare deres indfødte posttranslationelle modifikationer (dvs., acetylation, methylering og fosforylering). Figur 1 viser tidslinjen af Histon rensning protokol.
Protocol
Alle mus har været opstaldet i en fugt - og temperatur-kontrolleret, AAALAC-akkrediteret dyr facilitet på University of Miami Miller School of Medicine. Alle eksperimenter blev godkendt af University of Miami Miller School af medicin institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og gennemføres i henhold til specifikationer af NIH.
1. forberedelse af prøveekstraktet
-
Vedhængende celler
- Plade celler i 10 cm retter i den passende dyrkningsmedier (1 x 106 til 1 x 109 celler pr. parabol for cellelinjer, såsom BV2, HEK-293, og SH-SY5Y, men ~ 1 x 1015 celler pr. parabol til primærelementer, såsom primær kortikale neuroner). Sikre at cellerne er jævnt fordelt på hele overfladen af pladen og tillade celler til at vokse i 48 timer at nå ~ 100% sammenløbet (37 ° C, 5% CO2).
- Når cellerne har nået den ønskede confluency, forsigtigt Opsug dyrkningsmedier og vaske celler 2 x med forvarmet serumfrit medier under en vævskultur hætte.
- Opsug den serumfrit medier fra fadet og tilsættes 1 mL iskold ekstraktionsbuffer (0,4 M svovlsyre, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] og 1 x protease hæmmer cocktail) til hvert fad.
- Brug en plastik celle skraber til at indsamle alle celler i ekstraktionsbuffer (ved skrabning) og overføre dem til en 1,5 mL mærket tube med 1.000 µL pipette. Med pipette overfoeres cellerne op og ned 3 x at lette homogenisering.
- Luk alle rør og straks sætte dem på is.
-
Hjernevæv
- Hvis der bruges frossen væv tø sted væv i en prechilled 1,5 mL tube og kort op på isen. Hvis der bruges frisk væv gå straks til trin 1.2.2.
Bemærk: Den nuværende protokol beskriver procedurer ved hjælp af frosne mus hjernen og mus præfrontal cortex prøver. - Homogeniseres væv ved hjælp af en håndholdt Dounce homogeniseringsapparat ved hjælp af den passende mængde ekstraktionsbuffer og det anbefalede antal strøg (tabel 1). For at undgå overdreven kromatin neddeling, ikke overstige antallet af anbefalede slagtilfælde.
- Overføre ved hjælp af en enkelt kanal 1.000 µL pipette, homogenatet til en prechilled 1,5 mL tube. Luk alle rør og straks sætte dem på is.
- Hvis der bruges frossen væv tø sted væv i en prechilled 1,5 mL tube og kort op på isen. Hvis der bruges frisk væv gå straks til trin 1.2.2.
2. forberedelse af rå Histon ekstrakt
- Placere de 1,5 mL rør indeholdende celler eller væv suspenderet i ekstraktionsbuffer på en roterende platform og rotere på 15 rpm ved 4 ° C til tillader udvinding af rå histoner.
Bemærk: Udvinding tid kan variere for forskellige celle og vævstyper og skal optimeres for hver procedure. Den nuværende protokol præsenterer resultaterne efter 15 min, 2 h og 24 h udvinding (figur 2, figur 3, figur 4og figur 5). - Prechill microcentrifuge til 4 ° C. Efter den ønskede ekstraktion er tiden gået, centrifugeres rør ved maksimal hastighed for 10 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten herunder rå histonerne til en ny, prechilled 1,5 mL tube. Kassér pelleten.
- Gemme supernatanten ved-80 ° C (udvinding kan stoppes på dette trin, se "Stop skridt" i figur 1) eller straks gå videre til næste trin.
- Neutralisere de rå histoner med et volumen på 1/4 af 5 x neutralisering buffer (f.eks.tilføje 250 µL af 5 x neutralisering buffer til 1 mL rå histoner). Bland godt af pipettering op og ned ad 6 x.
- Tjek pH i blanding med pH-strips. Justere i overensstemmelse hermed ved at tilføje flere neutralisering buffer for at opnå en pH på 7.
- Vurdere tilstedeværelsen af Histon og nonhistone protein i den rå Histon uddrag som følger (figur 2).
- Tilføje 37,5 µL af prøven til 12,5 µL af 4 x (Laemmli) prøvebuffer og denaturere i 10 min på 99 ° C.
- Læg prøven på en SDS-PAGE gel og køre gel for 1 h på 100 V.
- Pletten gel natten med Coomassie strålende blå R-250 Farvningsopløsningen og destain i tre på hinanden følgende vasker (1 h/vask) med Coomassie strålende blå R-250 affarvning løsning.
Bemærk: Rå histoner (figur 2) kan sammenlignes med elueret og renset histoner (dvs.kolonne input [figur 5A]).
3. rensning af Core histoner
-
Spin kolonne ækvilibrering
- Tilføjes hver spin kolonne anvendes 500 µL af ækvilibrering buffer. Berør ikke den kolonne membran.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 3 min på 800 x g. Kassér gennemstrømnings. Gentag 1 x.
-
Histon rensning
- Tilføje 500 µL af prøven af interesse fra trin 2,6 til kolonnen. Der centrifugeres ved 4 ° C i 3 min på 800 x g. Indsamle gennemstrømnings.
- Gentag det forrige trin så mange gange som nødvendigt at indlæse hele prøven på kolonnen. Fyld ikke for meget spin kolonne.
- Kombinere gennemstrømnings fra hver centrifugering skridt at analysere kolonne-bindende effektivitet (figur 3).
- Følg trin 2.7 at analysere flow-gennem kolonnen.
-
Kolonne vask
- Tilføje 500 µL af wash buffer til hver kolonne. Der centrifugeres ved 4 ° C i 3 min på 800 x g. Indsamle gennemstrømnings-vask (vask #1).
- Gentag trin 3.3.1 for i alt tre vasker. Indsamle gennemstrømnings-vasker #2 og #3. Pool ikke træk kolonne gennemstrømnings-vasker.
- Yderligere evaluering kolonnens Histon-bindende effektivitet, analysere de tre kolonne skylninger ved at følge trin 2.7 (figur 4).
-
Histon eluering
- Overfør kolonnen til et nyt mærket 1,5 mL tube.
- Tilsæt 50 µL af Histon eluering buffer. Der centrifugeres ved 4 ° C i 3 min på 800 x g. Gemme gennemstrømnings-indeholdende Histon proteinerne.
- For en yderligere eluering, Gentag trin 3.4.2. Kombiner ikke de første og anden gennemstrømning-eluater, som forskellige Histon mængde og renhed.
4. udfældning af Core histoner
- Tilføje perchlorsyre (PCA) til renset histonerne til en endelig koncentration på 4% PCA (f.eks.tilføje 3 µL af 70% PCA til 50 µL af renset histoner fra trin 3.4.2.
- Der centrifugeres i 3 s til at indsamle alle resterende væske fra rørvæggen. Mix af pipettering op og ned ad 6 x.
- Sted rør i et rack, og der inkuberes i 24 timer ved 4 ° C.
- Den næste dag, prechill en microcentrifuge til 4 ° C og centrifugeres prøver i 75 min. ved maksimal hastighed ved 4 ° C.
- Når centrifugeringen er fuldført, vil en lille hvid pellet indeholdende udfældet histoner ses i bunden af røret. Gør ikke vortex prøven.
- Omhyggeligt Aspirér supernatanten, og uden at forstyrre pelleten, tilføje 500 µL af iskold 4% PCA til prøven.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 min ved maksimal hastighed. Omhyggeligt Aspirér supernatanten.
- Gentag trin 4,7 2 x.
- Uden at forstyrre pelleten, tilføje 500 µL af iskold acetone. Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 min ved maksimal hastighed. Omhyggeligt Aspirér supernatanten.
- Gentag trin 4,9 2 x.
- Omhyggeligt Aspirér supernatanten, forlade rør reducerede, og tillade prøven til tørre på is i 30 min. Check, hvis alle resterende acetone er fordampet.
- Efterlad rør reducerede og tillade prøven tørres ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Resuspenderes i 30 µL sterilt vand. Gør ikke afpipetteres op og ned. Svirp rør forsigtigt med en finger.
- Cap alle rør og tillade histonerne at rekonstruere på isen for 30-50 min, afhængig af pellet størrelse. Kontrollere hvis pellet er genopslemmes.
- Cap alle rør og tillade pellet til yderligere resuspend på RT for 5 min.
Bemærk: Denne løsning (første og anden eluering fra trin 3.4.3) er oprettet af rensede og skyllede histoner og kan anvendes til yderligere kvantificering og Histon acetylation analyse.
5. kvantificering af elueret Histon proteiner
- Brug et spektrofotometer efter producentens protokol for at kvantificere samlede Histon proteinerne fremstillet efter den endelige eluering taktfast 4.15. Absorbansen måles på 230 nm. Optage A260/A280 ratio vejledende prøve kontamineringens med nukleinsyre.
- Brug følgende formel til at beregne Histon koncentration (x):
Her er OD ekstinktionen måles på A230 nm. - Histon koncentration af ~1.5 mg/mL anses et gennemsnitsudbytte for cellelinjer, mens en Histon koncentration af ~5.0 mg/mL betragtes et gennemsnitsudbytte for 30 mg af væv.
6. Western Blot analyse
- Justere den renset og elueret Histon fra trin 4.15 til ~ 10 µg af Histon protein/prøve.
- Tilføje den passende mængde af vand og 4 x Laemmli prøvebuffer at justere loading diskenheder.
- Denaturere prøver i 10 min på 99 ° C. Cool dem på is. Der centrifugeres i 3 s til at indsamle alle resterende væske og kondens fra rørvæggen.
- Indlæse prøver på en SDS-PAGE gel og køre gel for 1 h på 100 V.
- For at visualisere samlede histoneprotein, pletten gel natten med Coomassie strålende blå R-250 Farvningsopløsningen og destain i tre på hinanden følgende vasker (1 h/vask) med Coomassie strålende blå R-250 affarvning løsning.
Bemærk: Den første eluering af Histon proteiner indeholder høj kvalitet histoner (figur 5A), mens den anden eluering indeholder lavt at ingen niveauer af histonerne (figur 5B). - For at kvantificere Histon PTMs, bruge en transfersystem (Se Tabel af materialer) til at overføre histoneprotein fra SDS-PAGE gel (trin 6.4) på en PVDF membran.
- For at samle overførsel sandwich, åbne overførsel system kassette og placerer den PVDF membran stak (mærket som bund +) på bunden af kassetten med membranen opad. Roll membran forsigtigt med en skamplet roller at fjerne luft fra stakken og membranen.
- Lå gel oven på membranen, rulle gel forsigtigt med en skamplet roller at fjerne luft fra mellem membranen og gelen, og Placer den øverste stak på gelen. Rul forsigtigt igen og anbring dækslet kassette på toppen af sandwich, tryk nedad, og drej nob uret til lås.
- Sæt kassetten for at overføre systemet slot. Vælg Turbo protokolpå skærmbilledet apparater. Brug en 3 min protokol for en enkelt mini gel eller en 7 min protokol for mere end to mini geler.
- Pletten membranen med Ponceau S pletten for 5 min og visualisere samlede Histon proteinerne.
- Vaske dem i 1 x Tris-bufferet saltvand (TBS) med 0,1% Tween 20 til 2 h og blokere dem i 5% mælk til 1 h. Incubate med primær og sekundær antistof (overnatning på 4 ° C eller 1 h i RT, henholdsvis) eller efter en tidligere optimeret protokol.
Bemærk: I den nuværende protokol, antistoffer mod acetyleret histoner H4K12 (figur 6 og figur 7) og H3K27 (figur 8) blev brugt.
Representative Results
For at illustrere progression af Histon rensning protokol og sammensætning af alle analyserede fraktioner, evalueret vi forskellige Histon uddrag af menneskelige microglial BV2 celler. For at demonstrere kvantificering af histonerne H3 og H4 PTMs (dvs., acetylation), brugte vi hjernen væv lysates.
BV2 celler var belagt på 5 x 106 celler pr. parabol i 10 cm vævskultur-behandlede retter og tilladt for at vokse til confluency for 48 h. celler blev derefter indsamlet og histoner blev frigivet fra kromatin af en inkubation i ekstraktionsbuffer indeholdende 0,4 M svovlsyre, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 x protease inhibitor. Ekstraktion-tid mellem 15 min og 24 h, ikke påvirker den generelle sammensætning af rå Histon ekstrakter som fastsat af Coomassie strålende blå farvning (figur 2). Næste, rå histoner blev overført gennem de afbalancerede Histon kolonner og gennemstrømnings-blev analyseret. Kolonne-bindende højeffektiv bestemmes ved fravær af histoneprotein i gennemstrømnings-når analyseret af Coomassie strålende blå farvning. Vi bestemt kolonne-bindende effektivitet til at være 100%, da der ikke var nogen påviselig Histon proteiner til stede i de analyserede gennemstrømning (figur 3). Alle membraner med bundne histoner blev derefter vaskes tre gange med wash buffer til at fjerne enhver resterende urenheder, forlader kun Histon proteiner bundet til silica gel. Vi har besluttet, at for alle Histon udvinding gange (dvs., 15 min, 2 h og 24 h), den første membran vask var det vigtigste at fjerne nonhistone forureninger fra kolonnerne, mens de anden og tredje vasker ikke påvirke prøve renhed. Således, afhængigt af hvilken stikprøve, de sidste to skylninger kan udelades. Efter den første eluering af histoneprotein fra kolonnen (ved hjælp af eluering buffer indeholdende 1mM NaCl og EDTA), histoner blev fældet natten med 4% perchlorsyre derefter pelleted, vasket og analyseret for berigelse af renset histoner H3 og H4. Vi observerede at 24 h udvinding tid stiger mængden af H3 og H4 histoner i renset fraktion i forhold til 15 min. og 2 h udvinding tid (figur 5A). Den anden eluering fra kolonnen resulterede ikke i høj kvalitet eller high-mængde histoner (figur 5B).
Næste, vi brugte hjernen væv homogeniseret for at kvantificere Histon H3 og H4 PTMs, nemlig acetylation. Wild-type (C57BL6/J) mandlige mus blev administreret et bredt handler HDAC-hæmmer (tributyrin) i en dosis på 5 g/kg oralt for 3 d. hele-hjernen væv blev indsamlet på dag 4 og rå histoner blev udtrukket efter den beskrevne protokol. Ved hjælp af en uparret t-test, vi har besluttet, at tributyrin øger acetylation af histoner i den rå ekstrakt (t(6) = 6.184, P = 0,0004); men opdages urenheder i ekstraktet (Histon bands ikke er klart defineret). H4K12ac antistof har således ikke en høj specificitet (figur 6). For at yderligere evaluere anvendeligheden af præsenteres protokollen til mindre væv sektioner, vi indsamlet prefrontal cortex fra tredobbelt transgene Alzheimers sygdom (3 x Tg-AD) mus behandlet dagligt med 10 mg/kg M344, en klasse I og IIb HDAC-hæmmer til fire måneder. Histon rensning og nedbør blev udført efter den heri beskrevne protokol. Ved hjælp af renset Histon H3 og H4 brøkdel, vi har besluttet, at M344 øger H4K12 acetylation 2.4-fold (t(6) = 13.03, P < 0,0001), med en høj specificitet af H4K12ac antistof (figur 7). Ligeledes, vi observeret en stigning i Histon H3 acetylation i BV2 celler som reaktion på en anden HDAC-hæmmer, nemlig den selektive HDAC3 hæmmer, RGFP-966. 10 µM af RGFP-966 årsager en ca fordoblingen af acetylation på Histon H3K27 efter 24 timer behandling. Studerende er parrede t-test blev anvendt til at sammenligne kontrol versus behandlede celler.
Figur 1: tidslinje af Histon rensning protokol. Alle skridt for Histon analyser er vist nedenfor sammen med den anslåede tid til hvert trin. Tallene viser resultatet af særlige foranstaltninger og præsenteret i håndskriftet omtales i parentes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative Coomassie strålende blå-farvede gel demonstrerer rå histoner udvundet af BV2 celler. BV2 celler blev kulturperler for 48 h før Histon udvinding protokollen begyndte. Rå histoner blev udtrukket til 15 min, 2 h og 24 h, med tre gentagelser for hvert tidspunkt (dette er også tilfældet i figur 3, figur 4, og figur 5). Både nonhistone og Histon proteiner er til stede i rå Histon ekstrakten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant Coomassie strålende blå-farvede gel demonstrerer kolonne gennemstrømnings-følgende Histon rensning skridt fra BV2 celler. Efter rå Histon passerer gennem kolonnen Histon bindende, er kun nonhistone proteiner til stede i gennemstrømnings. Histon proteinerne er fraværende i denne fraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant Coomassie strålende blå-farvede gel demonstrerer en kolonne vask efter et Histon rensning skridt fra BV2 celler. Uanset Histon udvinding gange var som var (A) 15 min, (B) 2 h, eller (C) 24 h, små mængder af nonhistone proteiner kun til stede i kolonnen første-vask histonebinding. Histon proteiner var fraværende i alle vasker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative Coomassie strålende blå-farvede gel demonstrerer elutions efter en Histon rensning skridt fra BV2 celler. (A) lang-seriøs renset og afsaltes Histon H3 og H4 blev opdaget efter den første eluering fra kolonnen Histon rensning. (B) den anden eluering fra Histon rensning kolonne ikke give en høj kvalitet eller mængde af histonerne H3 eller H4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: I store træk handler HDAC-hæmmer, tributyrin, øger H4K12 acetylation i hele hjernen af wild-type mus. (A) dette panel viser en repræsentant vestlige skamplet skildrer en stigning af H4K12 acetylation i den rå Histon uddrag indsamlet fra hele hjernen i wild-type mus som svar på den bredt fungerende HDAC-hæmmer, tributyrin. (B) dette panel viser kvantificering af stigningen i H4K12 acetylation in vivo. Parrede t-test blev anvendt til at sammenligne grupper (t(6) = 6.076, P = 0.0005). Søjlerne repræsenterer den gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdi (SEM). N = 8. P < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: klasse I og IIb HDAC-hæmmer, M344, øger H4K12 acetylation i præfrontale cortex af tredobbelt transgene Alzheimers sygdom (3 x Tg-AD) mus. (A) dette panel viser en repræsentant vestlige duppes skildrer en stigning af H4K12 acetylation i de rensede og skyllede Histon ekstrakt indsamlet fra 3 x Tg-AD mus i svar til hæmning af HDAC'er prefrontal cortex af M344. (B) dette panel viser kvantificering af stigningen i H4K12 acetylation som svar på M344 administreres ved en daglig dosis på 10 mg/kg i fire måneder. Parrede t-test blev anvendt til at sammenligne grupper (t(6) = 13.30, P < 0,0001). Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM. N = 8. P < 0.00001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: den selektive HDAC3-hæmmer, RGFP-966, øger H3K27 acetylation i BV2 microglial celler. (A) dette panel viser en repræsentativ vestlige skamplet skildrer en stigning af H3K27 acetylation i den rensede og skyllede Histon ekstrakt indsamlet fra BV2 celler som reaktion på HDAC3 hæmning af RGFP-966. (B) RGFP-966 forårsager en ca fordoblingen af acetylation på Histon H3 og lysin (K) 27 efter 24 timer behandling. Parrede t-test blev anvendt til at sammenligne kontrol versus behandlede celler (t(4) = 5.981, P = 0,002). Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM. N = 6. P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Repræsentative væv (en halvkugle) * | Gennemsnitlige væv vægt (mg) | Ekstraktionsbuffer (mL) | Antallet af streger |
| Musen cerebellum | 40 | 1 | 40 |
| Mus-frontale cortex | 30 | 0,3 | 20 |
| Musen hippocampus | 27 | 0,3 | 18 |
| Musen entorhinal cortex | 19 | 0,3 | 17 |
| * Alle eksperimenter blev udført på voksne mandlige mus. | |||
| Gennemsnitlig alder: 16 måneder. Gennemsnitlig vægt: 30 gram. | |||
Tabel 1: Optimeret forudsætning for hjernen væv homogenisering.
Discussion
I den nuværende arbejde viste vi en optimeret metode til at rense core Histon proteiner og kvantificere Histon H3 og H4 PTMs (fx, acetylation). Præsenteres-protokollen er en omfattende arbejdsproces, der inkorporerer optimeret procedurerne vedrørende celler og hjernen væv forberedelse, rå Histon rensning og detaljerede Histon nedbør, eluering og kvantificering, der efterfølges af Histon elektroforese og robust Histon PTM kvantificering. Den store mængde af oplysninger her giver mulighed for en replikerbar generation af data af høj kvalitet, på trods af behovet for langvarig manipulationer af Histon prøver.
Mange i øjeblikket publicerede protokoller kræver brug af HPLC at isolere ren brøkdele af histonerne H3 og H419. Selvom HPLC er en kraftfuld teknik, afskrække dens kompleksitet og lav-overførselshastighed de fleste molekylærbiologer og nonexperts fra sin hyppig brug. Faktisk, HPLC er ikke tilgængelig for mange labs, og højt kvalificerede personale er forpligtet til at drive instrumentet. HPLC er ofte tidskrævende, dyrt og potentielt farlige. Præsenteres her er en billig, medium-overførselshastighed strategi til at opnå resultater af tilsvarende kvalitet, der omgår HPLC. Den rapporterede strategi er også mere praktiske og egnet til brug i næsten enhver lab da det bruger en simpel spin kolonne tilgang, som ikke kræver specialiseret instrument operation færdigheder. Derudover er Histon H3/H4 tetramer udtrukket som en enkelt, ren, og rigelige brøkdel, gør det muligt for en pålidelig kvantificering af bevarede PTMs på hver af proteinerne.
PTMs er ekstremt følsomme over for ændringer i oxidativ stress og ændringer i pH20,21. Således, i modsætning til tidligere offentliggjorte metoder18rapporterer vi en effektiv strategi for skylning celler i serumfrit medier til at sikre et minimum metaboliske forstyrrelser af celler og at undgå indblanding af de indfødte PTMs med serum komponenter. Den nuværende protokol ikke kun omfartsveje den traditionelle kerner isolation, men også giver optimal gange for celle lysis og den nøjagtige væv homogenisering procedure, der giver mulighed for bevarelse af den nukleare kuvert samtidig undgå nukleare sammenlægning. Selv om udvinding tid kan manipuleres baseret på antallet af celler, celletype anvendes, væv størrelse, etc., er udvidede lysis ikke ønskeligt, da det kan føre til lysering af kerner og DNA release, så prøven svært at håndtere. Flere kontrolposter i protokollen findes vigtigere, for validering af vellykket Histon rensning (fx, trin 2.7 og 3.2.3). Denne strategi også letter fejlfinding i hele den langvarige procedure.
Et andet vigtigt og enestående træk ved præsenteres protokollen er dens fuld kompatibilitet med efterfølgende western blot analyseværktøjer og andre, hvis det ønskes. Histon proteiner er fundet på ~ 15 kDa13,22,23 og, på samme måde til andre små molekylvægt proteiner, har bevist udfordrende at opdage ved hjælp af standard immunoblotting teknikker. Brug af en høj ydeevne og høj overførselshastighed transfersystemet i kombination med optimal opløsning protein geler giver mulighed for vedligeholdelsen af protein indfødte bekræftelse (i mangel af SDS) og aktivitet i mangel af SDS og høj overførselshastighed effektivitet af lavmolekylære Histon proteinerne, således sikrer en pålidelig Histon PTM kvantificering.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne udtrykke deres taknemmelighed til Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimer's Research Program (tilskud 6AZ08 og 7AZ26), NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) og American Heart Association (grant 17PRE33660831).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
| Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
| 70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
| 100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
| pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
| 4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
| Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
| 1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
| Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
| Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
| Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
| Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
| Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
| Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
| Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
| SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
| Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
| Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
| 100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
| H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |
References
- Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
- DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
- Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
- Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
- Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
- Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
- Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
- Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
- Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
- Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
- Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
- Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
- Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029 (2014).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
- Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
- Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
- Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).
