Summary
Detta protokoll syftar till att ge detaljerade experimentella steg i en kall atmosfärsplasma behandling på neurala stamceller och immunofluorescens upptäckt för differentiering förbättring.
Abstract
Utvecklingen av fysiska plasma-teknik, kall atmosfäriska plasmor (CAPs) har undersökts allmänt i sanering, cancerbehandling, sårläkning, behandling rotfyllning, etc., bildar ett nytt forskningsfält kallas plasma medicin. Att vara en blandning av elektriska, kemiska och biologiska reaktiva arter, CAPs har visat sin förmåga att förbättra nerv stamceller differentiering både in vitro- och in-vivo och är att bli en lovande väg för neurologisk sjukdomsbehandling i framtiden. Den mycket mer spännande nyheten är att använda CAPs kan förverkliga ett steg, och säkert regisserad, differentiering av neurala stamceller (Karolina) för vävnad transport. Här visar vi detaljerade experimentella protokoll använder en self-made CAP jet-enhet för att förbättra NSC differentiering i C17.2-Karolina och primära råtta neurala stamceller, och att observera cell ödet av inverterad samt fluorescensmikroskopi. Med hjälp av immunofluorescens färgning teknik, Vi hittade både de Karolina visade en accelererad differential än den obehandlade gruppen och ~ 75% av Karolina differentieras selektivt efter nervceller, som är främst mogen, kolinerga och motor neuroner.
Introduction
Dirigerad differentiering av Karolina in en viss utvecklingslinje för vävnad transport anses vara en av de mest lovande behandlingar för neurodegenerativa och neurotraumatic sjukdomar1. Exempelvis önskas catecholaminergic dopaminerga neuron särskilt i Parkinsons sjukdom (PD) behandling. Traditionella metoder för att förbereda önskad cellerna för transport har dock många nackdelar, såsom kemisk toxicitet, ärrbildning, eller andra, som i hög grad hämmar tillämpningar av Karolina i regenerativ medicin2. Därför är det mycket nödvändigt att hitta en ny och säkert sätt för NSC differentiering.
Plasma är den fjärde delstaten frågor, följande fasta, flytande och gas, och det utgör mer än 95% av frågor i hela universum. Plasma är elektriskt friläget med obundna positiva/negativa och neutrala partiklar och genereras vanligtvis av en hög spänning urladdning i labbet. Under de senaste två decennierna, har tillämpningen av plasma i biomedicin uppmärksammats enormt världen över som utvecklingen av kall atmosfärstryck plasma-teknik. Tack vare detta technic, stabilt låg temperatur plasma kan genereras i den omgivande luften på atmosfär utan arc bildande och består av olika reaktiva arter, såsom reaktiva kväve arter (RNS), reaktiva syreradikaler (ROS), ultraviolett (UV) strålning, elektroner, joner och elektriska fält3. CAPs har unika fördelar för mikroorganismen inaktivering, cancerbehandling, sårläkning, behandling av hudsjukdomar, cellproliferation och cell differentiering4,5,6,7. I tidigare arbete visade vi att kalla atmosfärsplasma jet kan förbättra differentieringen av Karolina i både murina neurala stamceller C17.2 (C17.2-Karolina) och primära råtta neurala stamceller, uppvisar en stor potential att bli ett kraftfullt verktyg för den riktade differentiering av Karolina8. Även om mekanismen av CAP förbättring av NSC differentiering inte är helt klarlagt ännu, nr genereras av CAPs har visat sig vara en viktig faktor i processen. I detta arbete, vi strävar efter att tillhandahålla en detaljerad experimentellt protokoll för att använda ett atmosfäriskt tryck helium och oxygen plasma jet för behandling av Karolina i vitro, cell förberedelse och förbehandling, morfologi observation av inverterade mikroskopet, och Fluorescence mikroskopi observation av immunofluorescens färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kulturer och Predifferentiation
-
Neurala stamceller kultur och predifferentiation
- Förbereda poly-D-lysin-coated coverslips. Sätta ett sterilt täckglas (20 mm i diameter) i en 12-bra platta. Coat täckglaset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vatten (Tabell för material) för bättre celladhesion på coverslips genom att följa nästa steg.
Obs: Optimala förhållanden måste bestämmas för varje cell fodrar och program.- Aseptiskt belägga ytan av täckglaset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vatten. Rock försiktigt för att säkerställa en jämn beläggning av täckglas ytan.
- Efter odling (~ 12 h) över natten vid 37 ° C, avlägsna poly-D-lysin lösningen och skölj surface 3 x med 1 mL sterilt vatten.
- Torka de celler minst 30 min innan sådd dem.
- Förbereda poly-D-lysin-coated coverslips. Sätta ett sterilt täckglas (20 mm i diameter) i en 12-bra platta. Coat täckglaset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vatten (Tabell för material) för bättre celladhesion på coverslips genom att följa nästa steg.
-
Murina neurala stamceller C17.2 (C17.2-NSC) kultur och predifferentiation
- Inkubera C17.2-Karolina i en 25 cm2 kolv i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 5% häst serum (HS) och 1% penicillin/streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2 för ~ 2-3 d.
- När cellerna nå 85% sammanflödet, ta bort mediet, tvätta cellerna med 1 mL PBS och tillsätt 1 mL färsk trypsin (0,25%) i kolven. Lämna den för 1 min; sedan lägger du till 1 mL odlingsmedium kolven och pipett upp och ner flera gånger för att säkerställa en enda cellsuspension.
- Räkna densiteten av cellerna i avstängning med hjälp av en hemocytometer. Beräkna volymen som krävs av cellsuspensionen att ge en sista cell koncentration av 2 x 104 celler/mL.
- De C17.2-Karolina utsäde på den bestrukna coverslips i 12-väl plattan med tätheten av ~ 2 x 104 celler per brunn. Markera cell densiteten under ett mikroskop.
Obs: För ett bättre resultat, optimal cell densiteten måste bestämmas innan immunofluorescens experimentet. - Inkubera cellerna vid 37 ° C i en cell inkubator för 12 h för fastsättning.
- Efter fastsättning, tvätta cellerna 2 x med 1 mL PBS och odla cellerna med differentiering medium bestående av DMEM/F12 med 1% N2 tillägg för 48 h före plasmabehandling.
-
Primära råtta neurala stamceller kultur och predifferentiation
- Kultur den primära råtta NSC suspensionen i råtta NSC odlingsmedium i obestruket T25 kolvar med en täthet av 5 x 105 celler.
Obs: Primära råtta Karolina var isolerade efter protokollet av Xie o.a. 9. - Kontrollera bildandet av neurospheres under en inverterade Mikroskop. Kontrollera av neurospheres morfologi uppvisar sfäriska och transparent flercelliga komplex.
- När neurospheres nå en diameter av 3 mm eller större, överför neurosphere till en 15 mL sterilt centrifugrör och låt kvitta neurospheres av gravitation.
- Ta bort supernatanten noggrant för att lämna neurospheres i en minimal volym av medium.
- Skölj neurospheres 1 x 5 ml PBS och låt neurospheres reglera självtryck. Ta bort supernatanten för att lämna en minimal volym av PBS.
- Tillsätt en lämplig mängd differentiering medium att justera cell densiteten till ~ 12-15 neurospheres per milliliter. Det differentiering mediet för primära råtta Karolina består av DMEM/F12, 2% B27 och 1% FBS.
- Frö 1 mL neurosphere suspension på varje belagd täckglas i 12-väl plattan.
Obs: Skaka plattan försiktigt för att säkerställa att neurospheres fördelas jämnt. Detta steg är avgörande för ett bättre resultat för immunofluorescens. - Placera plattan i inkubatorn och gör det möjligt att predifferentiate för 24 h före plasmabehandling.
- Kultur den primära råtta NSC suspensionen i råtta NSC odlingsmedium i obestruket T25 kolvar med en täthet av 5 x 105 celler.
2. beredning av Plasma Jets
- Välj en halv-öppna kvarts röret med en innerdiameter på 2 mm och en yttre diameter på 4 mm. Infoga en hög spänning tråd med en diameter av 2 mm i röret.
- Infoga kvarts röret med hög spänning tråd i en 5 mL spruta och Använd en hållare för att montera den släpper i mitten av sprutan. Ange avståndet mellan den slutna änden av kvarts röret och sprutspetsen på 1 cm.
- Ansluta en 1 m silikon gummi pipe (med en inre diameter på 12 mm) till den öppna änden av sprutan och Anslut det sedan till flödesmätare och gas ventilen i sekvens.
3. anskaffning av Jets
- Anslut kretsen som visas i figur 1. Anslut utgång tråd av strömförsörjningen till plasma jet enheten och Anslut sedan spetsen av högspännings-sonden med utgång tråd att upptäcka spänningen. Anslut den andra änden av högspännings-sonden till oscilloskopet att registrera information om utspänningen. Kontrollera hela kretsen och kontrollera strömförsörjningen, oscilloskopet och högspännings-sonden är alla jordade.
- Kontrollera gasledningen. Kontrollera att gasledningen har varit ansluten till plasma jet enheten; sedan öppna gasventilen helium (volymfraktion, 99,999%) och syre (volymfraktion, 99,999%) och ställa in gasflödet till 1 L:0.01 L/min (han: O2).
Obs: Låt gasflödet i flera minuter innan du slår på strömförsörjningen för första gången. - Ange pulsamplitud, frekvens och pulsbredd som 8 kV, 8 kHz och 1600 ns, respektive. Kontrollera kretsen igen och vrid sedan på utdata för att skapa en plasma jet.
Varning: Vid inte hög spänning tråden när som helst.
4. plasma behandling av neurala stamceller
- Ange avståndet mellan munstycket på sprutan och cell väl hålet till 15 mm.
Obs: Mäts avståndet från botten av plattformen där 12-väl skylten är placerad. - Ta 12-väl plattan ur inkubatorn och ändra medlet av predifferentiated celler till 800 µL av färska differentiering medium.
- Dela celler i tre grupper: en obehandlad kontrollgrupp, en 60 s han-och-O2 (1%) gas flöde och gruppen som, en 60 s plasma behandling.
Obs: Det finns inga uppenbara flytande förlust på behandling villkor. - Placera 12-väl plattan under plasma jets, Kontrollera sprutan munstycket är fast i mitten av varje hål och ge den relevanta behandlingen till de olika grupperna som nämns i steg 4,3.
Obs: De obehandlade kontrollerna hölls i differentiering medium vid rumstemperatur under experimentella förfarandet för att säkerställa enhetlig behandling villkor. Gruppen för behandling av han-och-O2 (1%), gasförsörjningen flöde behandlades med endast en han och O2 (1%) gasflöde, utan plasma generation. Alla behandlingar ska utföras i tre exemplar.
5. neurala stamcellers differentiering
- Efter behandling, ta bort den ursprungliga kulturen och tillsätt 1 mL ny differentiering medium till varje brunn.
- Inkubera cellerna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för 6 d. ändra medium varannan dag.
- Kontrollera statusen differentiering av de olika grupperna dagligen under en inverterad ljus faskontrastmikroskop. Slumpmässigt välja minst 12 fält och ta foton att registrera de morfologiska förändringarna.
6. immunofluorescens färgning
-
Sköljning
- Ta proverna ur cellen inkubatorn och ta bort mediet av aspiration. Skölj cellerna 1 x med 1 mL PBS.
Obs: Efter differentieringen, cellerna är enkelt fristående. Det är nödvändigt att lägga till PBS från sidan av kultur brunnarna att undvika tvätta bort cellerna.
- Ta proverna ur cellen inkubatorn och ta bort mediet av aspiration. Skölj cellerna 1 x med 1 mL PBS.
-
Fixering
- Fixa cellerna med 500 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min i rumstemperatur. Efter fixeringen, försiktigt skölja cellerna 3 x med 1 mL PBS, 5 min varje, ta bort de resterande 4% PARAFORMALDEHYD.
Obs: Den optimala tidpunkten för cell fixering skall bestämmas enligt celltyper. Efter fixeringen, tillsätt 1 mL PBS från sidan av kultur brunnarna och lämna provet på bordet för 5 min. Använd inte en lab shaker, för att säkerställa en minimal förlust av celler.
- Fixa cellerna med 500 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min i rumstemperatur. Efter fixeringen, försiktigt skölja cellerna 3 x med 1 mL PBS, 5 min varje, ta bort de resterande 4% PARAFORMALDEHYD.
-
Permeabilisering
- Permeabilize av prov med 0,2% TritonX-100 i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur. Efter permeabilisering, skölj cellerna försiktigt med 1 mL PBS för tre gånger, 5 min varje.
Obs: Den optimala tidpunkten för cellen vilket skall bestämmas enligt celltyper. Efter permeabilisering, Lägg till 1 mL PBS från sidan av kultur brunnar, lämna provet på bordet för 5 min. Använd inte en lab shaker för att säkerställa minimal förlust av celler.
- Permeabilize av prov med 0,2% TritonX-100 i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur. Efter permeabilisering, skölj cellerna försiktigt med 1 mL PBS för tre gånger, 5 min varje.
-
Blockering
- Tillsätt 1 mL 10% get serum i PBS till varje prov och lämna provet på bordet för 1 h att blockera eventuella ospecifik interaktioner.
Obs: Använd inte en lab shaker, för att förhindra celler från lossa från bilden. En sköljning behövs inte i det här steget.
- Tillsätt 1 mL 10% get serum i PBS till varje prov och lämna provet på bordet för 1 h att blockera eventuella ospecifik interaktioner.
-
Inkubation med primär antikropp
- Späd den primär antikropp med primär antikropp förtunningsbuffert.
Obs: För optimalt resultat, slutliga utspädningsfaktorn av primär antikropp måste bestämmas genom pretest. Utspädningsfaktorer av anti-Nestin (för odifferentierade stamceller), anti-β-Tubulin III (för neuron), anti-O4 (för oligodendrocyte), anti-NF200 (för mogna nervceller), anti chatt (för kolinerga nervceller), anti-LHX3 (för motoriska nervceller), anti-GABA (för GABAergic nervceller), anti serotonin (för serotonerga neuroner) och anti-TH (för dopaminerga nervceller) är 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 och 1: 100, respektive. - Gälla olika prover 300 µL utspädda primära antikroppar.
- Inkubera i cellprover över natten vid 4 ° C.
Obs: Det rekommenderas att Inkubera primära antikroppar vid 4 ° C att minska bakgrunden och ospecifik färgning. - Ta bort de primära antikropparna och skölj försiktigt cellerna 3 x med 1 mL PBS.
- Späd den primär antikropp med primär antikropp förtunningsbuffert.
-
Inkubation med sekundär antikropp
- Späd de Cy3-konjugerad eller Alexa Fluor 488-konjugerad sekundära antikroppar med hjälp av 3% get serum i PBS.
Obs: För optimalt resultat, slutliga utspädningsfaktorn av sekundär antikropp måste bestämmas genom pretest. - Tillsätt 300 µL av relevanta sekundära antikroppar att upptäcka varje primär antikropp.
Obs: Alla efterföljande steg måste utföras i mörkret att förhindra fluorescens snabbkylning. - Inkubera cell provet i mörkret för 2 h i rumstemperatur.
- Ta bort sekundära antikropparna och skölj cellerna försiktigt med 1 mL PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Späd de Cy3-konjugerad eller Alexa Fluor 488-konjugerad sekundära antikroppar med hjälp av 3% get serum i PBS.
-
Nukleär färgning
- Tillsätt 500 µL av Hoechst 33258 fungerande lösning att fördjupa cell provet.
- Inkubera cell provet i mörkret i 8 min i rumstemperatur att märka atomkärnor.
- Skölj försiktigt cellerna 3 x med 1 mL PBS, 10 min varje, skyddas från ljus.
Obs: För en minimal förlust av celler, optimal tvätt villkoret måste bestämmas empiriskt.
-
Montering
- Placera en droppe monteringsmedium i mitten av microslide.
- Ta ur den coverslips (med samplingar) med pincett och noggrant placera provet ovanpå monteringsmedium. Undvika luftbubblor.
- Ta bort eventuella Överflödigt monteringsmedium med absorberande papper.
-
Fluorescence mikroskopi observation
- Iaktta proverna under den fluorescensmikroskopi utrustade med filter för Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 och Cy3. För varje prov, slumpmässigt Välj minst 8-12 fält och spela in bilder med en kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellmorfologi observerades under inverterade mikroskopet varje dag efter CAP behandling. Figur 2 visar vanliga inverterad fas-kontrast ljusmikroskop bilder av celldifferentiering i både cellinjer. Den plasma-behandlade gruppen uppvisar en accelererad differentiering och -grad en hög differentiering jämfört med gruppen kontroll och gas flöde.
Immunofluorescerande resultaten av C17.2-Karolina och primära råtta Karolina odlade för 6 d efter behandlingen visas i figur 3 och figur 4, respektive. Nestin (+, grön) minskade, β-Tubulin III (+, röd) ökat avsevärt, och O4 (+, grön) ökade något i både cellinjer jämfört med kontrollgruppen. CAP behandlingar av 60 s effektivt förbättras de C17.2-Karolina i neuronala härstamning jämfört med kontrollgruppen och behandlingsgruppen gas flöde. Ren gasflödet hade ingen synlig effekt på NSC differentiering.
Figur 5 visar den neuronala öde specifikationen i gruppen 60 s plasma behandling. Starkt uttryck av NF200 (för mogna neuron), chatt (för kolinerga neuron) och LHX3 (för motorneuronen) observerades. GABAergic och serotonerga neuroner sågs sällan, medan ingen dopaminerga neuron upptäcktes.
Figur 1 : Schematisk av experimentella set-up. Plasma jet enheten är ansluten till utgång tråd av den högspänning strömförsörjningen. Högspännings-sonden med oscilloskop används för att upptäcka utspänningen. När de arbetande gaserna flödar genom sprutan och den höga spänningen är på, plasma jet kommer att genereras och propagerar i fria luften. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ordinarie inverterad faskontrast ljusmikroskop bilder för C17.2-Karolina och primära råtta Karolina. Denna siffra är anpassade från Xiong o.a. 8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunofluorescens detektion av obehandlade C17.2-Karolina (vänster), 60 s gas flöde-behandlade C17.2-Karolina (mitten), och 60 s plasma-behandlade C17.2-NCSs (höger) för 6 d kultur. Nestin (+, grön) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, röd) / Hoechst; O4 (+, grön) / Hoechst. Den nukleära är målat med Hoechst 33258. Denna siffra är anpassade från Xiong o.a. 8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Immunofluorescens detektion av obehandlad primär råtta Karolina (vänster), 60 s gas flöde-behandlade primära råtta för Karolina (mitten) och 60 s plasma-behandlade primära råtta Karolina (höger) för 6 d kultur. Nestin (+, grön) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, röd) / Hoechst; O4 (+, grön) / Hoechst. Den nukleära är målat med Hoechst 33258. Denna siffra är anpassade från Xiong o.a. 8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Neuronala öde specifikation studerade genom immunofluorescens i 60 s plasma behandlingsgruppen. NF200 (+, röd) / Hoechst; Chatt (+, röd) / Hoechst; LHX3 (+, röd) / Hoechst; GABA (+, röd) / Hoechst; Serotonin (+, röd) / Hoechst; TH (+, röd) / Hoechst. Den nukleära är målat med Hoechst 33258. Denna siffra är anpassade från Xiong o.a. 8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C17.2-Karolina är en typ av förevigade neurala stamceller linje från neonatal mus cerebellär korniga lagret celler, utvecklat av Snyder och andra10,11. C17.2-Karolina kan differentieras till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter och används allmänt i neurovetenskap12. I vår tidigare studie kunde CAPs förbättra differentieringen av C17.2-Karolina till nervceller. En proof-of-principle studie genomfördes också använda primära råtta Karolina, och effekten av exponeringen i plasma på primära råtta Karolina var kvalitativt liknar de C17.2-Karolina, med en starkare differentiering av nervceller. Kepsar, en roman fysikalisk-kemisk teknologi, kan representera ett lovande verktyg för neurologisk sjukdom behandling, såsom Alzheimers sjukdom, PD, ryggmärgsskada och andra.
CAP-behandling erbjuder ett steg sätt att öka både C17.2 NSC och primära råtta NSC differentiering in vitro- med en kort behandlingstid och lilla cellskador. Dessutom visade en ~ 75% regisserad differentiering till nervceller, som gjorde plasmabehandling en lovande metod för framtida vävnad transplantationer i kliniken. Det nuvarande protokollet rekryteras emellertid endast en typ av CAP enheter för NSC differentiering. Begränsning av använder denna microplasma är nonuniformity när plasma plymen behandlar 12-väl plattan. Framtida arbete kommer att överväga att använda en stor volym plasma enhet eller plasma-aktiverat medium för enhetlig behandling.
I området i närheten finns det flera kritiska steg i protokollet. Först måste varje tvätt steg noggrant utföras, för cellerna är enkelt fristående efter differentiering. Förfarandena för fixering och permeabilisering är andra kritiska steg i immunfärgning. Fixeringen är nödvändigt att bevara morfologi och antigenicitet av celler13. Vilket tillåter antikroppar att binda till intracellulära och nukleära antigener14. Den optimala tiden för fixering och permeabilisering skall bestämmas genom pretest. Immunofluorescens blockering och antikropp inkubation är lika viktiga som skonsam tvätt steg. Det rekommenderas att använda animaliska serum från samma källa som den sekundära antikroppen för att täcka de endogena ospecifika bindande proteinerna. För optimalt resultat, måste slutliga utspädningsfaktorn antikroppens bestämmas genom pretest. När det gäller plasmabehandling, måste plasma doseringen tillämpas mycket noga; långvariga och intensiva plasmabehandling kommer att framkalla cell apoptos eller nekros. Därför måste behandlingstid och avstånd vara färdigtestat.
I sammanfattning, här manuskriptet ger en steg för steg-protokollet för att inducera NSC differentiering genom att använda en atmosfärsplasma jet och belyser kritiska frågor under hela processen. CAPs kan förbättra differentieringen av Karolina till nervceller och tydligt kommer att vara fördelaktigt för behandling av neurologiska sjukdomar. Det är också värt att notera att det nuvarande protokollet endast fokuserar på in vitro- effekt CAPs på Karolina. Det är nödvändigt för framtida studier för att utvärdera effekten av plasma i vivo som använder musmodeller av nervskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av programmet Scholar Huazhong, oberoende innovationsfonden av den Huazhong universitet av vetenskap och teknik (nr 2018KFYYXJJ071) och den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr 31501099 och 51707012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B.
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
