Summary
이 프로토콜 신경 줄기 세포 및 분화 향상을 위한 면역 형광 검출에 차가운 대기 플라즈마 처리의 자세한 실험 단계를 제공 하는 것을 목표로.
Abstract
으로 실제 플라즈마 기술, 차가운 대기 플라즈마 (모자) 개발 오염, 암 치료, 상처 치유, 루트 운하 치료, 등에서 널리 조사 되어, 플라즈마 의학 이라는 새로운 연구 분야를 형성. 전기, 화학, 및 생물학적 반응 종의 혼합물 이기 때문에, 모자 나타났습니다 신경 줄기 세포 분화를 향상 시키기 위해 그들의 능력 둘 다 생체 외에서 vivo와 는 신경 질환 치료를 위한 유망한 방법 고 미래. 훨씬 더 흥미로운 뉴스 이며 그 모자를 사용 하 여 한 단계, 깨닫지 안전 감독, 신경 줄기 세포 (NSCs)의 조직 교통. 여기 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSC 차별화를 강화 하는 성가 모자 제트 장치를 사용 하 여 뿐 아니라 셀 운명으로 거꾸로 관찰 하 고 형광 현미경 검사 법의 자세한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 면역 형광 검사 기술 얼룩의 도움으로 우리 모두는 NSCs 치료 그룹 보다 가속된 차동 속도 보였다 발견 하 고는 NSCs의 ~ 75%는 주로 성숙 하 고 해, 모터 신경에 선택적으로 분화 신경입니다.
Introduction
조직 교통에 대 한 특정 계보에 NSCs의 감독된 분화 신경 및 neurotraumatic 질병1에 대 한 가장 유망한 요법 중 하나 간주 됩니다. 예를 들어 catecholaminergic dopaminergic 신경 세포는 특히 파 킨 슨 병 (PD) 치료에 원하는 됩니다. 그러나, 교통에 대 한 원하는 세포를 준비 하는 전통적인 방법 화학 독성, 흉터 형성, 또는 다른 사람, 재생 의학2NSCs의 애플 리 케이 션을 크게 저해 하는 등 많은 단점이 있다. 따라서, 그것은 매우 NSC 차별화에 대 한 소설과 안전한 방법의 찾을 필요가 있다.
플라즈마 문제, 다음 고체, 액체, 가스의 제 4 상태 이며, 그것은 구성 하는 전체 우주에서 문제의 95% 이상. 플라즈마 전기 중립 중립 입자와 언바운드 긍정적/부정적 이며 일반적으로 실험실에서 고압 방전에 의해 생성 됩니다. 지난 2 년간에 의학에서 플라즈마의 응용 프로그램 차가운 대기압 플라즈마 기술 개발으로 세계적으로 큰 관심을 모으고 있다. 이 기술 덕분에 안정적인 저온 플라즈마 아크 형성 없이 분위기에 주위 공기에 생성 될 수 있습니다 및 종의 다양 한 반응, 반응 질소 종 (RNS), 반응성 산소 종 (선생님), 자외선 (UV)로 구성 되어 방사선, 전자, 이온, 및 전기 분야3. 모자는 마이크로-유기 체 비활성화, 암 치료, 상처 치유, 피부 질환, 세포 증식, 세포 감 별 법4,5,,67의 치료에 대 한 독특한 장점이 있다. 이전 작품에서는, 우리가 보여주는 차가운 대기 플라즈마 제트 murine 신경 줄기 세포 C17.2 (C17.2-NSCs)에 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSCs의 분화를 향상 시킬 수 있습니다는 감독에 대 한 강력한 도구가 될 큰 잠재력을 전시 NSCs8분화 NSC 차별화의 모자 향상의 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다 아직, 비록 모자에 의해 생성 된 NO는 과정에서 핵심 요소가 될 것 입증 되었다. 이 작품에서는, 우리는 NSCs 생체 외에서셀 준비 및 전처리, 거꾸로 한 현미경으로 형태학 관찰의 치료는 대기압 헬륨/산소 플라즈마 제트를 사용 하 여 자세한 실험 프로토콜을 제공을 목표로 하 고 면역 형광 염색 법의 형광 현미경 관찰입니다.
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Protocol
1. 세포 문화 및 Predifferentiation
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신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
- Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트.
참고: 최적의 조건 각 셀 라인 및 응용 프로그램에 대 한 결정 해야 합니다.- Aseptically 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 물에 coverslip의 표면 코트. 부드럽게 coverslip 표면에 코팅 되도록 바위.
- 하룻밤 (~ 12 h) 37 ° C에서 배양 후 폴 리-D-리 솔루션을 제거 하 고 씻어 표면 3 살 균 물의 1 mL x.
- 그들을 뿌리기 전에 셀 적어도 30 분을 건조.
- Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트.
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C17.2 (C17.2-NSC) 문화 murine 신경 줄기 세포 및 predifferentiation
- C17.2-NSCs Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5% 말 혈 청 (HS), 및 1% 페니실린/스 ~ 2-3 d 37 ° C, 5% CO2 보충에 25 c m2 플라스 크에서 품 어.
- 셀 85% 합류에 도달, 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS로 세포 세척 한 신선한 trypsin (0.25%)의 1 mL 플라스 크에 추가. 1 분;에 대 한 둬 그런 다음, 플라스 크 및 단일 세포 현 탁 액을 위해 여러 번 왔다 갔다 피 펫 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 밀도 계산. 2 × 104 셀/mL의 최종 셀 농도 주고 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨을 계산 합니다.
- 씨 C17.2 NSCs 코팅된 coverslips에 ~ 잘 당 104 셀 x 2의 밀도와 12-잘 접시에. 현미경으로 세포 밀도 확인 합니다.
참고: 더 나은 결과 위한 최적의 셀 밀도 면역 형광 실험 하기 전에 결정 되어야 합니다. - 첨부 파일에 대 한 있도록 12 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 첨부 후 씻어 셀 2 x 1 mL의 PBS로 1 %N2 플라즈마 치료 전에 48 h에 대 한 보완과 DMEM/F12 이루어진 차별화 매체와 셀을 육성.
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기본 쥐 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
- 5 x 105 세포의 밀도에 uncoated T25 플라스 크에 쥐 NSC 성장 매체에서 주 쥐 NSC 정지 문화.
참고: 기본 쥐 NSCs Xie 그 외 의 프로토콜을 따르고 고립 됐다 9. - 거꾸로 현미경 neurospheres의 형성을 확인 하십시오. neurospheres의 형태 전시 구형 하 고 투명 한 다세포 단지 다는 것을 확인 하십시오.
- neurospheres 직경 3 m m 이상에 도달, 전송 neurosphere 정지는 15 mL 메 마른 분리기 관 고는 neurospheres 중력에 의해 정착.
- 신중 하 게 매체의 최소한의 볼륨에는 neurospheres를 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
- Neurospheres 1 린스는 neurospheres 중력에 의해 침전 PBS의 5 mL x. PBS의 최소한의 볼륨을 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
- 차별 매체 12 ~ 15 밀리 리터 당 neurospheres에 셀 밀도 조정의 적합 한 볼륨을 추가 합니다. 기본 쥐 NSCs 차별화 매체 구성 DMEM/F12, 2 %B27, 및 1 %FBS.
- 씨 12-잘 접시에 각 코팅된 coverslip에 neurosphere 서 스 펜 션의 1 mL.
참고: 격판덮개는 neurospheres은 고르게 분포 되도록 부드럽게 흔들어. 이 단계는 더 나은 면역 형광 검사 결과 대 한 중요 한. - 인큐베이터에 접시를 놓고 플라즈마 치료 전에 24 h에 대 한 predifferentiate에 그것을 허용 합니다.
- 5 x 105 세포의 밀도에 uncoated T25 플라스 크에 쥐 NSC 성장 매체에서 주 쥐 NSC 정지 문화.
2입니다. 플라즈마 제트의 준비
- 2 m m 내부 직경 및 외부 직경 4 m m.의 반 오픈 석 영 튜브 튜브 2 m m의 직경을 가진 높은 전압 와이어 삽입 선택 하십시오.
- 5 mL 주사기로 높은 전압 와이어와 석 영 튜브를 삽입 하 고 주사기의 센터 마운트 홀더를 사용 하 여. 1 cm에서 석 영 튜브의 봉인된 끝과 주사기 끝 사이의 거리를 설정 합니다.
- 주사기의 열린 끝을 (와 12 m m 내부 직경) 1 m 실리콘 고무 파이프를 연결 하 고, 다음, 순서 대로 유량 계 및 가스 밸브에 연결.
3입니다. 제트기의 수집
- 그림 1과 같이 회로 연결 합니다. 플라즈마 제트 장치에 전원 공급 장치의 출력 와이어를 연결 하 고, 다음, 높은 전압 프로브 끝 전압을 출력 와이어 연결. 출력 전압의 정보를 기록 하는 오실로스코프에 고전압 프로브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 전체 회로 확인 하 고 전원 공급 장치, 오실로스코프, 그리고 높은 전압 프로브 모두 접지 되어 있는지 확인 하십시오.
- 가스 라인을 확인 합니다. 가스 튜브; 플라즈마 제트 장치에 연결 되어 있는지 확인 다음, 헬륨 (볼륨 분수, 99.999%)와 산소 (볼륨 분수, 99.999%)의 가스 밸브를 열고 L:0.01 1 L/min (그: O2)를 가스 흐름을 설정 합니다.
참고: 처음으로 전원 공급 장치를 켜기 전에 몇 분 동안 가스 흐름을 보자. - 펄스 진폭, 주파수, 및 펄스 폭을 8로 설정 kV, 8, 및 1600 ns, 각각. 회로 다시 확인 하 고, 출력 버튼을 플라즈마 제트를 생성, 설정.
주의: 언제 든 지 높은 전압 와이어를 만지지 마십시오.
4. 플라즈마 처리 신경 줄기 세포의
- 주사기의 노즐 및 15 mm 셀 잘 구멍 사이의 거리를 설정 합니다.
참고: 거리 12-잘 접시 배치 됩니다 플랫폼의 하단에서 측정 됩니다. - 인큐베이터에서 12-잘 접시를가지고 고 신선한 차별화 매체의 800 µ L predifferentiated 셀의 변경.
- 3 개의 그룹으로 셀 분할: 치료 되지 않는 통제 그룹, 60 s 그 O2 (1%) 가스 흐름 처리 그룹, 그리고 60 s 플라즈마 처리 그룹.
참고:가 아무 명백한 액체 치료 조건 하 에서입니다. - 플라즈마 제트 아래 12-잘 접시, 주사기 노즐 각 구멍의 중심에 고정 되어 있는지 확인 하십시오 놓고 4.3 단계에서 언급 한 다른 그룹에 관련 된 치료를 제공 합니다.
참고: 치료 컨트롤 실험 절차를 균일 한 치료 조건 동안 실 온에서 차별화 매체에 유지 했다. 그 O2 (1%) 가스 흐름 치료 그룹은만 그 치료와 O2 (1%) 가스 흐름, 플라즈마 생성 없이. 모든 치료는 3 중에서 수행 되어야 합니다.
5. 신경 줄기 세포 분화
- 치료 후, 원래의 문화를 제거 하 고 각 우물에 새로운 차별화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- 6 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어 d. 변경 매체 매일.
- 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 아래 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인 하십시오. 임의로 적어도 12 필드를 선택 하 고 형태학 상 변화를 기록 하는 사진을 찍는.
6. 면역 형광 염색
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세 정
- 셀 인큐베이터에서 샘플을 받아 고 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 1 셀 린스 1 mL의 PBS와 x.
참고: 차별화, 후 셀은 쉽게 분리. 그것은 세포에서 세척 하지 않으려면 문화 우물의 측면에서 PBS를 추가 해야 합니다.
- 셀 인큐베이터에서 샘플을 받아 고 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 1 셀 린스 1 mL의 PBS와 x.
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고정
- 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 셀을 수정 합니다. 고정, 후 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS 5 분 각, 잔여 4 %paraformaldehyde 제거.
참고: 셀 고정을 위한 최적의 시간 포인트 셀 유형에 따라 결정 되어야 합니다. 고정, 후 문화 우물의 측면에서 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 테이블에는 샘플을 두고. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
- 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 셀을 수정 합니다. 고정, 후 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS 5 분 각, 잔여 4 %paraformaldehyde 제거.
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Permeabilization
- 0.2% 샘플 permeabilize 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 TritonX-100. Permeabilization, 후 3 시간, 5 분 각 1 mL PBS와 부드럽게 셀 린스.
참고: 셀 permeabilization에 대 한 최적의 시간 포인트 셀 형식에 따라 결정 되어야 합니다. Permeabilization, 후 5 분에 대 한 테이블에는 샘플 두고 문화 우물의 측면에서 1 mL PBS를 추가. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
- 0.2% 샘플 permeabilize 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 TritonX-100. Permeabilization, 후 3 시간, 5 분 각 1 mL PBS와 부드럽게 셀 린스.
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차단
- 각 샘플에 PBS에 10% 염소 혈 청 1 mL을 추가 하 고 어떤 일반적인 상호 작용을 차단 하는 1 시간에 대 한 테이블에는 샘플을 두고.
참고: 셀 슬라이드에서 분리 되지 않도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오. 린스는이 단계에서 필요 하지 않습니다.
- 각 샘플에 PBS에 10% 염소 혈 청 1 mL을 추가 하 고 어떤 일반적인 상호 작용을 차단 하는 1 시간에 대 한 테이블에는 샘플을 두고.
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1 차적인 항 체를 가진 외피
- 1 차적인 항 체 희석 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석.
참고: 최적의 결과 대 한 1 차적인 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. (대 한 미 분화 줄기 세포), 안티 Nestin의 희석 비율 (신경)에 대 한 안티-β-Tubulin III, 안티-O4 (oligodendrocyte)에 대 한, 안티-NF200 (대 한 성숙한 뉴런), (대 한 해 신경), 반대로 채팅 안티-LHX3 (모터 신경)에 대 한 안티-GABA ( GABAergic 신경), (대 한 serotonergic 신경), 항 세로토닌 및 안티-일 (대 한 dopaminergic 신경)는 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200, 그리고 1: 100, 각각. - 300 µ L 희석된 주 항 체의 다른 샘플에 적용 됩니다.
- 4 ° c.에 하룻밤 셀 샘플을 품 어
참고: 배경 및 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 4 ° C에서 1 차 항 체를 품 어에 추천 된다. - 1 차 항 체를 제거 하 고 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS.
- 1 차적인 항 체 희석 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석.
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이차 항 체를 가진 외피
- Cy3 활용 또는 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체 3% 염소 혈 청을 사용 하 여 PBS에 희석.
참고: 최적의 결과 대 한 이차 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. - 각 1 차적인 항 체를 검출 하기 위하여 관련 2 차 항 체의 300 µ L를 적용 합니다.
참고: 모든 후속 단계 형광 냉각을 방지 하기 위해 어둠 속에서 수행 해야 합니다. - 실 온에서 2 h에 대 한 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
- 2 차 항 체를 제거 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 PBS의 1 mL와 함께 부드럽게 셀 린스.
- Cy3 활용 또는 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체 3% 염소 혈 청을 사용 하 여 PBS에 희석.
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핵 얼룩
- Hoechst 33258 작업 솔루션을 셀 샘플을 담가의 500 µ L를 적용 합니다.
- 핵을 실 온에서 8 분 동안 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
- 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS, 10 분 각, 빛 으로부터 보호.
참고: 셀의 최소한의 손실, 최적의 세척 조건 결정 되어야 합니다 경험.
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장착
- microslide의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다.
- 핀셋을 사용 하 여 (샘플)와 coverslips에서 하 고 신중 하 게 장착 매체 위에 샘플 위치. 공기 방울을 피하십시오.
- 흡수 성 종이 초과 설치 매체를 제거 합니다.
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형광 현미경 관찰
- Hoechst 33258, 알 렉 사 Fluor 488, 및 Cy3 필터 장착 형광 현미경 아래 샘플을 관찰 합니다. 각 샘플에 대 한 무작위로 선택 적어도 8-12 필드와 레코드 이미지 카메라와 함께 합니다.
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Representative Results
셀 형태 모자 치료 후 매일 거꾸로 현미경 관찰 되었다. 그림 2 는 두 셀 라인에서 세포 분화의 일반 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 이미지를 보여준다. 플라즈마 처리 그룹 가속된 분화 속도 및 제어 및 가스 흐름 그룹에 비해 높은 차별화 비율을 전시 한다.
Immunofluorescent 결과 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 NSCs 후 치료 각각그림 4 , 그림 3 에 표시 됩니다 6 d에 대 한 양식입니다. Nestin (+, 녹색) 감소, β-Tubulin III (+, 레드)이 크게 증가 하 고 O4 (+ 녹색) 약간 증가 모두 셀 라인 제어 그룹에 비해. 60의 모자 치료 s 효과적으로 제어 그룹 및 가스 흐름 처리 그룹에 비해 신경 혈통으로 C17.2 NSCs를 향상. 가스 흐름 NSC 차별화에는 효과가 없습니다 표시 했다.
그림 5 는 60 s 플라즈마 처리 그룹에서 신경 운명 명세를 보여준다. NF200 (대 한 성숙한 신경), (대 한 해 신경), 채팅 및 LHX3 (모터 신경)에 대 한 강한 식 관찰 되었다. GABAergic serotonergic 뉴런은 거의 본, 아니 dopaminergic 신경 검색 하는 동안.
그림 1 : 실험 설정의 도식. 플라즈마 제트 장치는 고압 전원의 출력 와이어에 연결 된다. 오실로스코프 고전압 프로브는 출력 전압을 감지 하는 데 사용 됩니다. 때 작동 가스는 주사기를 통해 흐르는 높은 전압에, 플라즈마 제트 생성 되 고 야외에 전파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 일반 C17.2 NSCs를 주 쥐 NSCs 단계 대조 조명 현미경 이미지 반전. 이 수치는 Xiong 외. 에서 적응 8 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 치료 C17.2-NSCs의 면역 형광 탐지 (왼쪽), 60 s 가스 흐름-대우 C17.2-NSCs (중간), 그리고 60의 플라즈마-대우 C17.2-NCSs (오른쪽) 문화 6 d. (+, 녹색) nestin / Hoechst; Β-Tubulin III (+, 레드) / Hoechst; O4 (+, 녹색) / Hoechst. 핵은 Hoechst 33258로 얼룩이 진다. 이 수치는 Xiong 외. 에서 적응 8 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 면역 형광 탐지 치료 기본 쥐 NSCs (왼쪽), 60 s 가스 흐름 처리 기본 쥐 NSCs (가운데), 및 60 s 플라즈마 처리 기본 쥐 NSCs (오른쪽) 문화 6 d. (+, 녹색) nestin / Hoechst; Β-Tubulin III (+, 레드) / Hoechst; O4 (+, 녹색) / Hoechst. 핵은 Hoechst 33258로 얼룩이 진다. 이 수치는 Xiong 외. 에서 적응 8 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 신경 운명 사양 60 s 플라즈마 처리 그룹에서 면역 형광에 의해 공부. NF200 (+, 빨간색) / Hoechst; 채팅 (+ 레드) / Hoechst; LHX3 (+, 빨간색) / Hoechst; GABA (+ 레드) / Hoechst; 세로토닌 (+ 레드) / Hoechst; 일 (+ 레드) / Hoechst. 핵은 Hoechst 33258로 얼룩이 진다. 이 수치는 Xiong 외. 에서 적응 8 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
C17.2-NSCs 일종 이다 신생아 마우스 소 뇌 세분화 된 계층 셀에서 불멸 하 게 신경 줄기 세포 선의10,11스나이더 및 다른 사람에 의해 개발. C17.2-NSCs 신경, 이다, 그리고 oligodendrocytes로 분화 할 수 있다 하 고 신경 과학12에서 널리 이용 된다. 우리의 이전 연구에서 모자 뉴런으로 C17.2 NSCs의 차별화를 향상 시킬 수 있습니다. 증거의 원리 연구 또한 실행 되었다 주 쥐 NSCs를 사용 하 여 고 주 쥐 NSCs에 플라즈마 노출의 효과 C17.2 NSCs, 뉴런의 강력한 차별화의 질적으로 유사 했다. 모자, 새로운 물리 화학적 기술, Alzheimer의 질병, PD, 척수 손상 등 신경 질환 치료를 위한 유망한 도구를 나타낼 수 있습니다.
모자 치료 C17.2 NSC와 기본 쥐 NSC 차별화에서 시험관에서 짧은 치료 시간과 작은 세포 손상을 강화 하는 1 단계 방법을 제공 합니다. 또한, 결과 ~ 75% 감독 병원에서 미래의 조직 이식 하는 유망한 방법 플라즈마 처리를 만든 신경 세포로 분화 했다. 그러나, 현재 프로토콜만 한 가지 유형의 NSC 차별화 모자 장치 채용. 이 microplasma를 사용 하 여 제한에 nonuniformity 때 플라즈마 깃털 12-잘 접시를 취급 합니다. 미래 작업 일정 한 치료에 대 한 대규모 플라즈마 장치 또는 플라즈마 활성 매체를 사용 하 여 고려할 것입니다.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 각 세척 단계 수행 되어야 합니다 신중 하 게, 세포는 쉽게 분화 후 분리에 대 한. 고정 및 permeabilization의 절차는 immunostaining에서 다른 중요 한 단계. 고정은 형태학과 셀13antigenicity을 보존 해야 합니다. Permeabilization 항 체를 세포내 핵 항14에 바인딩할 수 있습니다. 최적의 시간 고정 및 permeabilization 예비 시험을 통해 결정 해야 합니다. 면역 형광 항 체 및 외피는 부드러운 세척 단계 만큼 중요 하다. 이차 항 체와 같은 소스에서 동물 혈 청을 사용 하 여 내 생 일반적인 바인딩 단백질을 커버 하는 것이 좋습니다. 최적의 결과 대 한 항 체의 최종 희석 비율 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. 플라즈마 처리에 관해서는 플라즈마 복용량 적용 해야 합니다 매우 신중 하 게; 장기간이 고 강렬한 플라즈마 치료 세포 apoptosis 또는 괴 사를 유발 한다. 따라서, 치료 시간과 거리를 기성 해야 합니다.
요약 하자면,이 원고 대기 플라즈마 제트를 사용 하 여 유도 하는 NSC 차별화에 대 한 단계별 프로토콜을 제공 하 고 전체 과정에서 중요 한 문제를 강조. Cap 뉴런으로 NSCs의 차별화를 강화할 수 있다 고 명확 하 게 신경 질환의 치료에 대 한 도움이 될 것입니다. 그것은 또한 현재 프로토콜만 체 외에서 의 효과에 모자 NSCs에 초점을 주의 하는 가치가입니다. 플라즈마에서 vivo에서 신경 손상의 마우스 모델을 사용 하 여의 효과 평가 하기 위해 미래 연구를 위해 필요 하다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 소 학자 프로그램, Huazhong 대학의 과학 및 기술 (No. 2018KFYYXJJ071), 그리고 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31501099와 51707012)의 독립적인 혁신 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
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- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
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- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
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- Jamur, M. C., Oliver, C.
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