Summary
Denne protokol har til formål at give detaljerede eksperimenterende trin af en kold atmosfæriske plasma behandling på neurale stamceller og immunfluorescens opdagelse for differentiering ekstraudstyr.
Abstract
Som udviklingen af fysiske plasmateknologi, kolde atmosfæriske plasmaer (CAPs) har undersøgt bredt i dekontaminering, kræftbehandling, sårheling, Rodbehandling, etc., danner et nyt forskningsområde opkaldt plasma medicin. At være en blanding af elektriske, kemiske og biologiske reaktive arter, CAPs har vist deres evner til at forbedre nerve stamceller differentiering både in vitro- og i vivo og er ved at blive en lovende måde til neurologiske sygdomme behandling i fremtiden. Den langt mere spændende nyheder er at bruge hætter kan realisere et-trins, og sikkert instrueret, differentiering af neurale stamceller (NSCs) for væv transport. Vi viser her den detaljeret forsøgsplan bruge en self-made CAP jet enhed til at forstærke NSC differentiering i C17.2-NSCs og primære rotte neurale stamceller, samt observere celle skæbne af inverteret og Fluorescens mikroskopi. Med hjælp fra immunofluorescens farvning teknologi, vi fandt begge de NSCs viste en hurtig differential hastighed end den ubehandlede gruppe og ~ 75% af NSCs differentieret selektivt til neuroner, som er hovedsagelig modne, kolinerge og motor neuroner.
Introduction
Styret differentieringen af NSCs i en bestemt slægt til væv transport betragtes som en af de mest lovende behandlinger for neurodegenerative og neurotraumatic sygdomme1. For eksempel, er catecholaminergic dopaminerge neuroner især ønsket i Parkinsons sygdom (PD) behandling. Traditionelle metoder til at forberede de ønskede celler for transport har imidlertid mange ulemper, som kemiske toksicitet, scar dannelse eller andre, som i høj grad hæmmer anvendelser af NSCs i regenerativ medicin2. Derfor er det meget nødvendigt at finde en roman og sikkert måde NSC differentiering.
Plasma er den fjerde tilstand af sager, følgende fast, flydende og gas, og det udgør mere end 95% af sager i hele universet. Plasma er elektrisk neutral med ubundne positiv/negativ og neutrale partikler og genereres sædvanligvis af en høj spænding decharge i laboratoriet. I de sidste to årtier, har anvendelsen af plasma i biomedicin tiltrukket stor opmærksomhed på verdensplan som udvikling af kolde atmosfæretryk plasmateknologi. Takket være denne teknik, stabil lav temperatur plasma kan genereres i den omgivende luft ved atmosfære uden arc dannelse og består af forskellige reaktive arter, såsom reaktive nitrogen arter (RNS), reaktive ilt arter (ROS), ultraviolet (UV) stråling, elektroner, ioner og elektrisk felt3. CAPs har enestående fordele for mikroorganismen inaktivering, kræftbehandling, sårheling, behandling af hudsygdomme, celleproliferation og celle differentiering4,5,6,7. I tidligere arbejde viste vi at kolde atmosfæriske plasma jet kan øge differentiering af NSCs i både murine neurale stamceller C17.2 (C17.2-NSCs) og primære rotte neurale stamceller, udviser et stort potentiale til at blive et effektivt redskab til den rettet differentiering af NSCs8. Selv om mekanismen for fælles landbrugspolitik forbedring af NSC differentiering ikke er fuldt forstået endnu, ingen genereret af CAPs har vist sig for at være en vigtig faktor i processen. I dette arbejde, vi tilstræber at give en udførlig forsøgsplan for at bruge en atmosfærisk tryk helium/ilt plasma jet til behandling af NSCs i vitro, celle forberedelse og forbehandling, morfologi observation af inverteret mikroskop, og Fluorescens mikroskopi observation af immunofluorescens farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kulturer og Predifferentiation
-
Neurale stamceller kultur og predifferentiation
- Forberede poly-D-lysin-belagt coverslips. Lagt en steril coverslip (20 mm i diameter) i en 12-godt plade. Coat dække glas med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vand (Table of Materials) for bedre celle vedhæftning på coverslips ved at følge de næste trin.
Bemærk: Optimale betingelser skal fastsættes for hver cellelinie og applikation.- Aseptisk coat overfladen af coverslip med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vand. Rock forsigtigt at sikre en selv belægning af coverslip overflade.
- Efter dyrkning overnatning (~ 12 h) ved 37 ° C, fjerne den poly-D-lysin løsning og skyl overflade 3 x med 1 mL sterilt vand.
- Tørre celler mindst 30 min. før såning dem.
- Forberede poly-D-lysin-belagt coverslips. Lagt en steril coverslip (20 mm i diameter) i en 12-godt plade. Coat dække glas med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vand (Table of Materials) for bedre celle vedhæftning på coverslips ved at følge de næste trin.
-
Murine neurale stamceller C17.2 (C17.2-NSC) kultur og predifferentiation
- Inkubér C17.2-NSCs i en 25 cm2 kolbe i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 5% hest serum (HS) og 1% penicillin/streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 til ~ 2-3 d.
- Når cellerne nå 85% sammenløb, fjerne medium, cellerne vaskes med 1 mL PBS og tilsættes 1 mL frisk trypsin (0,25%) i kolben. Lad det i 1 min; derefter tilsættes 1 mL af næringssubstratet kolbe og pipetteres op og ned flere gange for at sikre en enkelt cellesuspension.
- Regne massefylden af celler i suspension ved hjælp af en hemocytometer. Beregning af det nødvendige volumen af cellesuspension til at give en afsluttende celle koncentration af 2 x 104 celler/mL.
- Frø C17.2-NSCs på den coatede coverslips i 12-godt plade med tætheden af ~ 2 x 104 celler pr. brønd. Kontrollere celle tæthed under et mikroskop.
Bemærk: For et bedre resultat, optimal celle tæthed skal bestemmes før immunofluorescens eksperiment. - Inkuber celler ved 37 ° C i en celle inkubator for 12 h til at tillade vedhæftede fil.
- Efter vedhæftet fil, vaske celler 2 x med 1 mL PBS og dyrke celler med differentiering medium bestående af DMEM/F12 med 1% N2 supplement for 48 h før plasma behandling.
-
Primære rotte neurale stamceller kultur og predifferentiation
- Kultur den primære rotte NSC suspension i rotte NSC vækstmediet i ubestrøget T25 kolber med en tæthed på 5 x 105 celler.
Bemærk: Den primære rotte NSCs blev isoleret efter protokollen af Xie et al. 9. - Kontrollere dannelsen af neurospheres under en inverteret mikroskop. Kontroller, at morfologi af neurospheres udstiller sfæriske og gennemsigtig flercellede komplekser.
- Når neurospheres nå en diameter på 3 mm eller større, overføre neurosphere suspension til et 15 mL sterilt centrifugeglas, og lad neurospheres løse ved hjælp af tyngdekraften.
- Fjern supernatanten omhyggeligt for at forlade neurospheres i en minimal mængde af medium.
- Skyl neurospheres 1 x med 5 mL PBS og lad neurospheres løse ved hjælp af tyngdekraften. Fjern supernatanten for at forlade en minimal mængde af PBS.
- Tilføje et passende volumen af differentiering medium til at justere den celle tæthed til ~ 12-15 neurospheres per milliliter. Differentiering medium for primære rotte NSCs består af DMEM/F12, 2% B27, og 1% FBS.
- Frø 1 mL af neurosphere suspension på hver belagt coverslip i 12-godt plade.
Bemærk: Ryste plade forsigtigt for at sikre, at neurospheres er jævnt fordelt. Dette trin er afgørende for en bedre immunofluorescens resultat. - Pladen anbringes i rugemaskinen og gør det muligt at predifferentiate i 24 timer før plasma behandling.
- Kultur den primære rotte NSC suspension i rotte NSC vækstmediet i ubestrøget T25 kolber med en tæthed på 5 x 105 celler.
2. forberedelse af Plasma-Jets
- Vælg en halvåben kvarts rør med en indvendig diameter på 2 mm og udvendig diameter på 4 mm. Indsæt en højspændings ledning med en diameter på 2 mm i røret.
- Indsæt kvarts rør med høj spænding wire i en 5 mL sprøjte og bruge en holder til at montere det inde i midten af sprøjten. Angive afstanden mellem den lukkede ende af kvarts rør og sprøjte tip på 1 cm.
- Tilslut en 1 m silicone gummi rør (med en indre diameter på 12 mm) til den åbne ende af sprøjten, og Forbind den derefter med flowmeter og gas ventilen i rækkefølge.
3. erhvervelse af jetfly
- Tilslut kredsløbet, som vist i figur 1. Tilsluttes enheden plasma jet output wire af strømforsyningen, og tilslut derefter, spidsen af højspændings sonden med output wire til at opdage spændingen. Tilslut anden enden af højspændings sonden til oscilloskop til at registrere oplysninger i udgangsspændingen. Kontroller hele kredsløbet og sørg for strømforsyningen, oscilloskopet og højspændings sonden er alle forankret.
- Kontroller gas linjen. Sørg for gas røret har været forbundet med plasma jet enhed; derefter åbner gas ventil af helium (volumenfraktion, 99,999%) og ilt (volumenfraktion, 99,999%) og indstille gasstrømmen til 1 L:0.01 L/min (han: O2).
Bemærk: Lad gasstrømmen i flere minutter, før du tænder på strømforsyning for første gang. - Indstille pulsen amplitude, frekvens og pulse bredde som 8 kV, 8 kHz og 1600 ns, henholdsvis. Kontrollere kredsløbet igen, og drej på knappen output til at oprette en plasma jet.
Forsigtig: Rør ikke den højspændings ledning til enhver tid.
4. plasma behandling af neurale stamceller
- Angiv afstanden mellem dysens af sprøjten og celle godt hullet til 15 mm.
Bemærk: Afstanden måles fra bunden af den platform, hvor den 12-godt plade er placeret. - Tage 12-godt pladen ud af rugemaskinen og ændre medium af de predifferentiated celler til 800 µL af frisk differentiering medium.
- Opdele celler i tre grupper: en ubehandlede kontrolgruppe, en 60 s han og O2 (1%) gas flow behandling gruppe og en 60 s plasma behandling gruppe.
Bemærk: Der er ingen indlysende flydende tab på betingelse af behandling. - Sted 12-godt plade under plasma jets, Sørg for, at sprøjte dyse er fast i midten af hvert hul, og give den relevante behandling til de forskellige grupper, der er nævnt i trin 4.3.
Bemærk: Den ubehandlede kontrol blev holdt i differentiering medium ved stuetemperatur under forsøgsmetoden at sikre ensartet behandling. Han og O2 (1%) gas flow behandling gruppe blev behandlet med kun en han og O2 (1%) gasflow, uden plasma generation. Alle behandlinger skal udføres i tre eksemplarer.
5. neurale stamceller differentiering
- Efter behandling, fjerne den oprindelige kultur og tilsættes 1 mL af nye differentiering medium til hver brønd.
- Inkuber celler i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 til 6 d. ændre medium hver anden dag.
- Kontrollere status for differentiering af de forskellige grupper dagligt under en inverteret fasekontrast lysmikroskop. Tilfældigt vælge mindst 12 felter og tage billeder til at registrere de morfologiske ændringer.
6. immunofluorescens farvning
-
Skylning
- Udtage prøver af celle inkubator og fjerne medium ved aspiration. Skyl celler 1 x med 1 mL PBS.
Bemærk: Efter differentieringen, cellerne er uden sammenligning løsrevet. Det er nødvendigt at tilføje PBS fra siden af kultur wells til at undgå at vaske ud cellerne.
- Udtage prøver af celle inkubator og fjerne medium ved aspiration. Skyl celler 1 x med 1 mL PBS.
-
Fiksering
- Fix cellerne med 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. ved stuetemperatur. Efter fiksering, skylles forsigtigt celler 3 x med 1 mL PBS, 5 min hver, til at fjerne de resterende 4% PARAFORMALDEHYD.
Bemærk: Den optimale tidspunkt for celle fiksering skal bestemmes efter celletyper. Efter fiksering, tilsættes 1 mL PBS fra siden af kultur brønde og lad prøven på bordet til 5 min. Brug ikke en lab shaker, for at sikre et minimalt tab af celler.
- Fix cellerne med 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. ved stuetemperatur. Efter fiksering, skylles forsigtigt celler 3 x med 1 mL PBS, 5 min hver, til at fjerne de resterende 4% PARAFORMALDEHYD.
-
Permeabilization
- Permeabilize prøver med 0,2% TritonX-100 i PBS i 10 min ved stuetemperatur. Efter permeabilization, skyl celler forsigtigt med 1 mL PBS for tre gange, 5 min hver.
Bemærk: Den optimale tidspunkt for cellen permeabilization skal bestemmes efter celletyper. Efter permeabilization, tilføje 1 mL PBS fra siden af brøndene Kultur forlade prøven på bordet til 5 min. Brug ikke en lab shaker til at sikre det minimale tab af celler.
- Permeabilize prøver med 0,2% TritonX-100 i PBS i 10 min ved stuetemperatur. Efter permeabilization, skyl celler forsigtigt med 1 mL PBS for tre gange, 5 min hver.
-
Blokering
- Der tilsættes 1 mL af 10% ged serum i PBS til hver prøve og lade prøven på bordet til 1 h at blokere enhver uspecifik interaktioner.
Bemærk: Brug ikke en lab shaker, for at forhindre cellerne i afmontering fra diaset. En skylning er ikke nødvendige i dette trin.
- Der tilsættes 1 mL af 10% ged serum i PBS til hver prøve og lade prøven på bordet til 1 h at blokere enhver uspecifik interaktioner.
-
Inkubering med primær antistof
- Fortynd den primære antistof ved hjælp af primære antistof fortynding buffer.
Bemærk: Optimale resultater, det endelige fortyndingsforholdet af det primære antistof skal fastsættes af anstille. Fortyndingsforhold af anti-Nestin (for udifferentierede stamceller), anti-β-Tubulin III (for neuron), anti-O4 (for oligodendrocyte), anti-NF200 (for modne neuroner), anti-ChAT (til kolinerge neuroner), anti-LHX3 (for motoriske neuroner), anti-GABA (for GABAergic neuroner), anti-serotonin (for serotonerge neuroner), og anti-TH (for dopaminerge neuroner) er 1:80, 1:200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1:200, 1: 100, 1:200 og 1: 100, henholdsvis. - Anvende 300 µL fortyndede primære antistoffer til forskellige prøver.
- Inkuber celle prøver natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Det anbefales at udruge primære antistoffer ved 4 ° C til at reducere baggrund og uspecifik farvning. - Fjerne de primære antistoffer og forsigtigt skyl celler 3 x med 1 mL PBS.
- Fortynd den primære antistof ved hjælp af primære antistof fortynding buffer.
-
Inkubering med sekundær antistof
- Fortynd Cy3-konjugeret eller Alexa Fluor 488-konjugeret sekundære antistoffer ved hjælp af 3% ged serum i PBS.
Bemærk: Optimale resultater, det endelige fortyndingsforholdet sekundær antistof skal fastsættes af Prætest. - Anvende 300 µL af relevante sekundære antistoffer til at opdage hver primære antistof.
Bemærk: Alle de efterfølgende trin skal udføres i mørket at forhindre fluorescens dæmper. - Inkuber celle prøven i mørke i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjerne de sekundære antistoffer og skyl celler forsigtigt med 1 mL PBS i 10 min ved stuetemperatur.
- Fortynd Cy3-konjugeret eller Alexa Fluor 488-konjugeret sekundære antistoffer ved hjælp af 3% ged serum i PBS.
-
Nukleare farvning
- Anvende 500 µL af Hoechst 33258 brugsopløsning at fordybe celle prøven.
- Inkuber celle prøven i mørke for 8 min ved stuetemperatur til at mærke kerner.
- Forsigtigt skyl celler 3 x med 1 mL PBS, 10 min hver, beskyttet mod lys.
Bemærk: For et minimalt tab af celler, den optimale vask betingelse skal bestemmes empirisk.
-
Montering
- Anbring en dråbe af montering medium i midten af microslide.
- Tage ud af coverslips (med eksempler) ved hjælp af pincet og Placer prøve oven på montering medium. Undgå luftbobler.
- Fjern eventuelle overskydende montering medium med absorberende papir.
-
Fluorescens mikroskopi observation
- Observere prøver under Fluorescens mikroskopi udstyret med filtre til Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 og Cy3. For hver prøve, tilfældigt udvælge mindst 8-12 felter og optage billeder med et kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celle morfologi blev observeret under den inverterede mikroskop hver dag efter CAP behandling. Figur 2 viser almindelige inverteret fasekontrast lysmikroskop billeder af Celledifferentiering i begge cellelinjer. Plasma-behandlede gruppen udstiller en accelereret differentiering sats og forholdet høj differentiering i forhold til gruppen kontrol og gas flow.
Immunfluorescent resultaterne af C17.2-NSCs og primære rotte NSCs kulturperler for 6 d efter behandling er vist i figur 3 og figur 4, henholdsvis. Nestin (+, grøn) faldt, β-Tubulin III (+, red) steget betydeligt, og O4 (+ grøn) lidt øget i både cellelinjer sammenlignet med kontrolgruppen. CAP behandlinger af 60 s effektivt udvidet C17.2-NSCs i neuronal afstamning i forhold til kontrolgruppen og gas flow behandling gruppe. Ren gasflow havde ingen synlig effekt på NSC differentiering.
Figur 5 viser specifikationen neuronal skæbne i gruppen med 60 s plasma behandling. Stærke udtryk af NF200 (for modne neuron), ChAT (til kolinerge neuron) og LHX3 (for motorneuron) blev observeret. GABAergic og serotonerge neuroner blev sjældent set, mens ingen dopaminerge neuroner ikke blev fundet.
Figur 1 : Skematisk af den eksperimentelle set-up. Plasma jet-enheden er tilsluttet udgang wire af høj spænding strømforsyning. Højspændings sonden med oscilloskop bruges til at påvise udgangsspændingen. Når arbejde gasser flyder gennem sprøjten, og den høje spænding er på plasma jet vil blive genereret og udbrede i fri luft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Almindelige omvendt fase-kontrast lysmikroskop billeder til C17.2-NSCs og primære rotte NSCs. Dette tal er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunofluorescens påvisning af ubehandlet C17.2-NSCs (venstre), 60 s gas flow-behandlede C17.2-NSCs (i midten) og 60 s plasma-behandlede C17.2-NCSs (til højre) for 6 d kultur. Nestin (+, grøn) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, red) / Hoechst; O4 (+, grøn) / Hoechst. Den nukleare er plettet med Hoechst 33258. Dette tal er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Immunofluorescens påvisning af ubehandlet primære rotte NSCs (venstre), 60 s gas flow-behandlede primære rotte NSCs (midt) og 60 s plasma-behandlede primære rotte NSCs (til højre) for 6 d kultur. Nestin (+, grøn) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, red) / Hoechst; O4 (+, grøn) / Hoechst. Den nukleare er plettet med Hoechst 33258. Dette tal er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Neuronal skæbne specifikation studerede ved immunfluorescens i gruppen med 60 s plasma behandling. NF200 (+, rød) / Hoechst; ChAT (+ rød) / Hoechst; LHX3 (+, rød) / Hoechst; GABA (+ rød) / Hoechst; Serotonin (+ rød) / Hoechst; TH (+ rød) / Hoechst. Den nukleare er plettet med Hoechst 33258. Dette tal er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C17.2-NSCs er en form af udødeliggjort neurale stamceller linje fra neonatal mus cerebellare granulerende lag celler, udviklet af Snyder, og andre10,11. C17.2-NSCs kan differentiere sig til neuroner, astrocytter, og oligodendrocytes og er meget udbredt i neurovidenskab12. I vores tidligere undersøgelse, kan CAPs øge differentiering af C17.2-NSCs til neuroner. En proof-of-principle undersøgelse blev også foretaget ved hjælp af primære rotte NSCs, og effekten af plasma eksponering på den primære rotte NSCs var kvalitativt svarer til C17.2-NSCs, med en stærkere differentiering af neuroner. CAPs, en roman fysisk-kemiske teknologi, kan repræsentere et lovende redskab for neurologiske sygdom behandling, såsom Alzheimers sygdom, PD, rygmarvsskade m.fl.
CAP behandling tilbyder en et-trins måde at forbedre både C17.2 NSC og primære rotte NSC differentiering i vitro med en kort behandling tid og lille celleskader. Derudover viste en ~ 75% instrueret differentiering af neuroner, som gjorde plasma behandling en lovende metode til fremtidige væv transplantationscentre i klinikken. Men den nuværende protokol kun ansættes én type af CAP enheder til NSC differentiering. Begrænsning af brug af denne microplasma er nonuniformity når plasma plume behandler den 12-godt plade. Fremtidige arbejde vil overveje at bruge en stor mængde plasma enhed eller plasma-aktiveret medium til ensartet behandling.
Der er flere kritiske trin i protokollen. Først, hver vask skridt skal omhyggeligt udføres, for cellerne er let adskilles efter differentiering. Fiksering og permeabilization procedurer er andre kritiske trin i immunfarvning. Fiksering er nødvendigt at bevare morfologi og antigenicity af celler13. Permeabilization giver mulighed for antistoffer bindes til den intracellulære og nukleare antigener14. Det optimale tidspunkt for fiksering og permeabilization skal bestemmes gennem Prætest. Immunfluorescens blokering og antistof inkubation er lige så vigtig som skånsom vask trin. Det anbefales at bruge animalsk serum fra samme kilde som den sekundære antistof til dækning af endogent uspecifik bindende proteiner. For optimale resultater, skal antistoffet endelige fortyndingsforholdet bestemmes ved Prætest. Med hensyn til behandlingen af plasma skal plasma dosering anvendes nøje; lang tid og intens plasma behandling vil fremkalde celle apoptose eller nekrose. Derfor skal være afprøvet behandling tid og afstand.
Sammenfattende er dette manuskript giver en trinvis protokol for at fremkalde NSC differentiering ved hjælp af en atmosfærisk plasma jet og fremhæver kritiske spørgsmål under hele processen. CAPs kan øge differentiering af NSCs i neuroner og vil klart være til gavn for behandling af neurologiske sygdomme. Det er også værd at bemærke, at den nuværende protokol kun fokuserer på in vitro- -effekt af hætter på NSCs. Det er nødvendigt for fremtidige undersøgelser for at evaluere effekten af plasma i vivo ved hjælp af musen modeller af nerveskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Huazhong Scholar Program, den uafhængige innovationsfond Huazhong University of Science og Technology (nr. 2018KFYYXJJ071) og den National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099 og 51707012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
