Nerve stamcelle differentiering af en et-trins kolde atmosfæriske Plasma behandling In Vitro
Summary
Denne protokol har til formål at give detaljerede eksperimenterende trin af en kold atmosfæriske plasma behandling på neurale stamceller og immunfluorescens opdagelse for differentiering ekstraudstyr.
Abstract
Som udviklingen af fysiske plasmateknologi, kolde atmosfæriske plasmaer (CAPs) har undersøgt bredt i dekontaminering, kræftbehandling, sårheling, Rodbehandling, etc., danner et nyt forskningsområde opkaldt plasma medicin. At være en blanding af elektriske, kemiske og biologiske reaktive arter, CAPs har vist deres evner til at forbedre nerve stamceller differentiering både in vitro- og i vivo og er ved at blive en lovende måde til neurologiske sygdomme behandling i fremtiden. Den langt mere spændende nyheder er at bruge hætter kan realisere et-trins, og sikkert instrueret, differentiering af neurale stamceller (NSCs) for væv transport. Vi viser her den detaljeret forsøgsplan bruge en self-made CAP jet enhed til at forstærke NSC differentiering i C17.2-NSCs og primære rotte neurale stamceller, samt observere celle skæbne af inverteret og Fluorescens mikroskopi. Med hjælp fra immunofluorescens farvning teknologi, vi fandt begge de NSCs viste en hurtig differential hastighed end den ubehandlede gruppe og ~ 75% af NSCs differentieret selektivt til neuroner, som er hovedsagelig modne, kolinerge og motor neuroner.
Introduction
Styret differentieringen af NSCs i en bestemt slægt til væv transport betragtes som en af de mest lovende behandlinger for neurodegenerative og neurotraumatic sygdomme1. For eksempel, er catecholaminergic dopaminerge neuroner især ønsket i Parkinsons sygdom (PD) behandling. Traditionelle metoder til at forberede de ønskede celler for transport har imidlertid mange ulemper, som kemiske toksicitet, scar dannelse eller andre, som i høj grad hæmmer anvendelser af NSCs i regenerativ medicin2. Derfor er det meget nødvendigt at finde en roman og sikkert måde NSC differentiering.
Plasma er den fjerde tilstand af sager, følgende fast, flydende og gas, og det udgør mere end 95% af sager i hele universet. Plasma er elektrisk neutral med ubundne positiv/negativ og neutrale partikler og genereres sædvanligvis af en høj spænding decharge i laboratoriet. I de sidste to årtier, har anvendelsen af plasma i biomedicin tiltrukket stor opmærksomhed på verdensplan som udvikling af kolde atmosfæretryk plasmateknologi. Takket være denne teknik, stabil lav temperatur plasma kan genereres i den omgivende luft ved atmosfære uden arc dannelse og består af forskellige reaktive arter, såsom reaktive nitrogen arter (RNS), reaktive ilt arter (ROS), ultraviolet (UV) stråling, elektroner, ioner og elektrisk felt3. CAPs har enestående fordele for mikroorganismen inaktivering, kræftbehandling, sårheling, behandling af hudsygdomme, celleproliferation og celle differentiering4,5,6,7. I tidligere arbejde viste vi at kolde atmosfæriske plasma jet kan øge differentiering af NSCs i både murine neurale stamceller C17.2 (C17.2-NSCs) og primære rotte neurale stamceller, udviser et stort potentiale til at blive et effektivt redskab til den rettet differentiering af NSCs8. Selv om mekanismen for fælles landbrugspolitik forbedring af NSC differentiering ikke er fuldt forstået endnu, ingen genereret af CAPs har vist sig for at være en vigtig faktor i processen. I dette arbejde, vi tilstræber at give en udførlig forsøgsplan for at bruge en atmosfærisk tryk helium/ilt plasma jet til behandling af NSCs i vitro, celle forberedelse og forbehandling, morfologi observation af inverteret mikroskop, og Fluorescens mikroskopi observation af immunofluorescens farvning.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSCs er en form af udødeliggjort neurale stamceller linje fra neonatal mus cerebellare granulerende lag celler, udviklet af Snyder, og andre10,11. C17.2-NSCs kan differentiere sig til neuroner, astrocytter, og oligodendrocytes og er meget udbredt i neurovidenskab12. I vores tidligere undersøgelse, kan CAPs øge differentiering af C17.2-NSCs til neuroner. En proof-of-principle undersøgelse blev også foretaget ved hjælp af primær…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Huazhong Scholar Program, den uafhængige innovationsfond Huazhong University of Science og Technology (nr. 2018KFYYXJJ071) og den National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099 og 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
