提出了一种通过热移分析和纳米差动扫描荧光法快速测试蛋白质在各种条件下的热稳定性的方案。缓冲系统、盐和添加剂, 包括三个独特的稳定屏幕, 与蛋白质一起进行检测, 以确定适合功能和结构研究的缓冲液。
地平线2020病毒 x 项目成立于 2015年, 旨在探索选定的极端群落生境的病毒场, 并发现新的病毒蛋白。为了评估这些蛋白质的潜在生物技术价值, 分析蛋白质结构和功能是本计划的核心挑战。蛋白质样品的稳定性对于提供有意义的检测结果和提高目标的结晶性至关重要。热移位分析 (tsa) 是一种基于荧光的技术, 是优化高通量蛋白质稳定性条件的常用方法。在 tsa 中, 使用的荧光剂是外部的、对环境敏感的染料。另一种类似的技术是纳米差动扫描荧光法 (nanoDSF), 它依赖于蛋白质的原生荧光。我们在这里提出了一个新的渗透物筛网, 一个96条件的有机添加剂屏幕, 旨在指导结晶试验通过初步的 tsa 实验。这三个屏幕与以前开发的 ph 值和盐屏一起, 全面分析了各种缓冲系统和添加剂中的蛋白质稳定性。这些屏幕的效用在对溶菌酶和病毒 x 项目的目标蛋白 x 的 tsa 和纳米 dsf 分析中得到了证明。
许多生物技术上有用的酶来源于病毒来源, 如烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶1和人类鼻病毒类型 3c (hrv 3c) 蛋白酶2。地平线2020病毒-x 项目 (图 1)3。该方案的目的是: (a) 扩大已知酶家族的特性范围, (b) 描述功能未知的新型酶 (酶 x)。晶体结构的测定在目标蛋白表征中起着关键作用, 特别是在蛋白质序列进化到超出认知范围的情况下。蛋白质稳定性是结晶过程中的关键因素;样品必须在一段时间内具有均匀性和结构性, 才能形成高质量的衍射晶体。此外, 对活性检测蛋白质存在于其活性构象中至关重要, 这也可以通过良好的分子环境来促进。
尽管晶体学家可以利用的技术有了发展, 但蛋白质结晶仍然是一个耗时和劳动密集型的经验过程5。初步的生物物理实验, 以提高蛋白质的稳定性, 在溶液中提供了一个更好的起点, 蛋白质结晶和消耗通常只有相对较少的蛋白质样本6,7, 8,9。在这个项目中, 大量的目标蛋白质需要进行可扩展的、高吞吐量的稳定性检测。最流行的蛋白质预结晶生物物理表征方法之一是热转移法 (也称为 tsa 或差动扫描荧光法, dsf)10,11。
tas 采用对环境敏感的荧光染料来跟踪蛋白质样品的热变性。许多常用染料根据其环境的极性具有可变的荧光活性, 在疏水环境中往往显示出较高的荧光输出, 但在极性环境中经历快速淬火 12.蛋白质通常会导致染料荧光的显著增加, 因为它们的疏水核心在变性过程中暴露出来, 在非常高的温度下, 随着蛋白质开始聚集, 染料荧光通常会减少 (图 2)。
虽然疏水性敏感染料通常是一般用途 tsa 染料的理想选择, 但它不适合具有大的、暴露于溶剂的疏水区域的蛋白质, 这些蛋白质通常会显示高背景荧光。具有替代作用模式的荧光体存在 (见讨论), 但它可能是可取的, 通过固有的蛋白质荧光与纳米 dsf 跟踪变性。
埋在蛋白质荧光的非极性区域的色氨酸残留物, 最大排放量为330纳米。当蛋白质样品展开, 这些残留物暴露在极性溶剂中时, 它们的最大排放会发生浴缸变色转移到 350 nm 13.nanodsf 利用排放最大值的这一变化来探测蛋白质样本的展开, 而不需要外部荧光 14.
通过将数据拟合玻尔兹曼乙状结肠模型, 可以分析显示单一变性步骤的熔融曲线。展开过渡 (tm) 拐点处的温度被用作蛋白质热稳定性的定量测量和比较不同条件的有利度的基准。
同一蛋白质在不同条件下的熔融曲线有时具有一定程度的非均质性, 这可能使玻尔兹曼乙状结肠拟合不可行。要从偏离经典曲线拓扑的数据中识别 tm 值, 可以使用诸如开源 tsa 数据分析程序 nami 中使用的数值方法.替代热力学框架也可用于分析具有多个变性步骤的更复杂的曲线, 如蛋白质 plex 方法15。
稳定屏幕设计用于 tsa 和纳米 dsf 实验, 以快速确定目标蛋白的有利条件 (图 3, 屏幕成分可在补充信息中找到)。与屏幕收集的信息可用于晶体管道的许多阶段, 包括: 样品储存;净化, 通过在纯化过程中展开的蛋白质最大限度地减少产量损失;分析设计, 通过热稳定缓冲液和最终结晶来增强活性检测中的蛋白质功能, 指导合理设计的结晶试验。
为蛋白质样品选择合适的缓冲系统基础至关重要;不兼容的 ph 值可能导致蛋白质失活或变性。然而, 在大量 x 射线晶体结构中解析的共结晶缓冲分子的存在 (表 1) 也可能表明一种稳定作用, 这种效应与简单的 ph 调节是分开的, 而是源于化学物质。缓冲分子的特征。
ph 滤与其他通常与生物兼容的缓冲系统一起使用了一些 good 的缓冲液 17、18、19 , 旨在消除缓冲分子对蛋白质稳定性从实际 ph 值的结果溶液。通过为每个缓冲系统提供三个 ph 值, 并在不同系统之间加入 ph 值冗余, ph 屏幕可以识别出有利的 ph 值和目标蛋白的有利缓冲系统。
盐屏通常含有实验室盐以及链状物、螯合剂、重金属和还原剂。屏幕可以给出蛋白质样本与离子强度高的环境的亲和力的一般指示, 但每个亚群的化合物也可以提供有关蛋白质潜在结构的信息。例如, 对蛋白质有显著破坏稳定的螯合剂可能表明样品中的重要结构金属。如果样品也被屏幕内的金属阳离子强烈稳定, 这可以为进一步的结构实验提供一个有希望的起点。
奥姆菌是影响其环境渗透特性的可溶性化合物。在自然界中, 它们可以作为 “化学伴侣”, 强制折叠无序蛋白质并稳定它们, 特别是在压力条件20、21、22 下.这些特性使它们在蛋白质晶体学中具有吸引力的添加剂;可作为低温保护剂在晶体采集、安装和储存过程中使用23。奥斯莫尔的潜在用途也延伸到蛋白质的纯化。在大肠杆菌中表达的重组蛋白的很大一部分可以不溶于本机状态, 并且难以在本机状态下使用标准的纯化方法进行恢复。奥姆菌可用于稳定和挽救蛋白质从不溶性分数, 增加纯化产量24.
渗透物筛网是使用蛋白质数据库条目 25和 osmo污染关联路径 (deop)26数据库中存在的既定化合物设计的, 并使用标准蛋白质进行迭代优化。该屏幕围绕八个亚类的渗透石: 甘油, 糖和多元醇, 非洗涤剂磺胺类 (ndsb), 甜菜碱及其类似物, 有机磷, 二肽, 氨基酸及其衍生物和最后的杂项组。每个渗透石都存在于多个浓度, 基于其溶解度和有效浓度范围进行比较。
协议中的关键方面包括为 tsa 实验而对96孔板进行离心步骤和适当密封 (步骤 1.5)。离心可确保蛋白质样品和筛分条件接触和混合。此外, 如果未密封的板材用于 tsa 实验, 则在整个实验过程中, 溶剂蒸发的风险很大, 从而导致样品浓度增加, 并增加过早聚集蛋白质的可能性。
tsa 和纳米 dsf 适用于广泛的蛋白质样品;绝大多数样品可以用基于疏水的记者染料或通过无染料纳米 dsf 产生可解释的熔体曲线。如果标准荧光源不适合您的蛋白质, 则可以探索的协议最简单的修改是荧光粉的选择。几种替代染料可适用于 tsa 实验。这方面的例子包括 n-[4-(7-二乙基氨基-4-甲基-3-香豆素) 苯 (cpm), 一种与硫醇27反应后荧光的化合物, 以及 4-(二亚诺烷基) 氯洛胺 (dcvj), 一种根据其环境的刚性, 增加其荧光作为一个蛋白质样品展开28,29 (后一种染料往往需要高浓度的样品)。
如果仪器软件不能自动计算 tm,则可采用其他熔融曲线分析方法。如果数据是同质的, 并且在熔体曲线中只有一个变性步骤是可见的, 则可以在具有以下公式的 boltzmann sigmoid 上安装一个截断的数据集:
其中 f 是 t 温度下的荧光强度, f最小值和 f最大值分别是变性过渡前后的荧光强度, tm 是变性转变和 c 的中点温度是 tm 处的斜率。虽然此方法适用于简单的两步变性过程, 但不适用于具有多个过渡的复杂熔体曲线。
tsa 的主要优点之一是它的可访问性;tsa 实验可以在任何 rt-pcr 系统中进行, 该系统的光谱具有合适的波长, 用于所使用的荧光染料。再加上耗材成本低、操作方便、所需蛋白质含量相对较低, tsa 成为工业和学术界广泛项目规模的宝贵技术。
除了表明良好的缓冲条件外, 屏幕还包含一些井, 这些井可能会为样品蛋白中存在结构金属提供线索。在盐屏中可能特别感兴趣的井是 g6 和 g7, 分别含有 5 mm edta 和 5 mm egta。这些井的热不稳定严重可能表明蛋白质中存在着被螯合剂隔离的重要金属离子。渗透石筛网内的化合物也有可能为蛋白质的功能提供线索。屏幕上的许多化合物属于一类分子, 是酶的常见底物。例如, 糖类 (在井 a11-b10 中) 为溶菌酶提供的一般稳定性可归因于它们的结构与已确定的酶—-n-乙酰氨基低聚物 30—-底物相似。
上述 tsa 和 nanodsf 协议也可用于研究蛋白质配体相互作用。专门与蛋白质结合的配体可以通过在复合体中引入新的相互作用来提高蛋白质的热稳定性。蛋白质 tm 的剂量依赖性正转变是蛋白质配体相互作用成功的一个有希望的迹象。用 tsa 筛选复合库的速度、吞吐量和低成本使其成为早期药物发现中非常流行的方法。
优化目标蛋白及其配体复合物的缓冲条件对于项目的成功至关重要, 许多文献示例都证明了31、32、33、34。在需要2小时以下的典型测试中, tsa 和 nanodsf 与稳定屏幕相结合, 是一种快速、廉价的缓冲优化技术。
The authors have nothing to disclose.
该项目在欧洲联盟 “地平线 2020” 研究和创新方案下获得了欧洲研究理事会 (erc) 的资助 (授予协议) (685778 号赠款协议)。这项工作得到了生物技术和生物科学研究理事会 (bbsrc, 赠款编号 bbp/m011186)、bb/j01412过来) 的支持。db 感谢 bbsrc 博士培训合作伙伴: 纽卡斯尔-利物浦-达勒姆, 感谢他们的学生和杜伦大学生物科学系为这项工作提供的资金。我们感谢伊恩·爱德华兹的帮助, 感谢杜伦大学化学质谱系对蛋白质 x 的仪器分析。我们感谢 arnthor etervarsson 在 viuls-x 项目方面所做的工作, 并感谢 claire hatty 和 nanotemper gmbh 为该项目提供的贷款和协助。最后, 感谢弗朗西丝·加斯罗普和托策种子公司的支持, 作为 bbsrc iccase 奖的一部分。
Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |