빠르게 열 교대 분석 실험 및 차동 스캔 fluorimetry 나노 통해 조건의 다양 한 단백질의 열 안정성을 테스트 하는 프로토콜 제공 됩니다. 버퍼 시스템, 소금 및 첨가물, 함께 기능 및 구조 연구에 대 한 적당 한 버퍼를 식별 하는 단백질 분석은 3 독특한 안정성 화면 구성.
Horizon2020 바이러스 X 프로젝트는 선택 된 극단적인 생활권의 virosphere를 탐구 하 고 새로운 바이러스 성 단백질을 발견을 2015 년에 설립 되었다. 이러한 단백질, 단백질의 분석의 잠재적인 공학적 가치를 평가 하 구조와 기능에이 프로그램 중앙 도전 이다. 단백질 샘플의 안정성은 의미 있는 분석 결과 제공 하는 대상의 crystallizability 증가 필수적 이다. 열 교대 분석 실험 (TSA), 형광 기반 기술, 단백질 안정성 높은 처리량에 대 한 조건을 최적화 하기 위한 인기 있는 방법으로 설정 됩니다. TSAs, 고용된 fluorophores에 외부, 환경에 민감한 염료. 대신, 비슷한 기술은 나노 단백질 천연 형광에 의존 하는 fluorimetry (nanoDSF), 검사 차동 이다. 선물이 여기 소설 osmolyte 화면, 예비 TSA 실험을 통해 결정 화 실험을 안내 하도록 설계 된 유기 첨가제의 96-조건 화면. 이전 개발 pH 및 소금 스크린, 3 스크린의 집합 버퍼 시스템 및 첨가제의 넓은 범위에서 단백질 안정성에 대 한 포괄적인 분석을 제공합니다. 스크린의 유틸리티는 lysozyme 단백질 X, 바이러스 X 프로젝트의 대상 단백질의 TSA와 nanoDSF 분석에서 보여 줍니다.
바이러스 소스에서 발생 한 많은 biotechnologically 유용 효소와 같은 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소1 인간의 이노 입력 3 C (HRV 3 C) 프로 테아 제2. Horizon2020 바이러스 X 프로젝트 (그림 1)3. 이 프로그램의 목적은 (a) 알려진된 효소 가족의 속성의 범위를 확장 하 고 (b)를 아직 알 수 없는 함수 (효소 X)의 새로운 효소의 특성입니다. 결정학 구조 결정 단백질 시퀀스 인식4넘어 진화 했습니다 경우에 특히 대상 단백질 특성에 중추적인 역할을 하고있다. 단백질 안정성; 결정 화 과정에서 중요 한 요소 이다 샘플 양식 높은-품질, 결정 diffracting 시간의 기간 동안 conformationally 균질 성 및 구조적으로 소리 되어야 합니다. 또한, 단백질 또한 유리한 분자 환경에 의해 촉진 될 수 있습니다 그들의 활성 구조에 존재 하는 활동 분석 실험을 위해 필수적 이다.
Crystallographers에 사용할 수 있는 기술 개발에도 불구 하 고 단백질 결정 화 시간과 노동 집약적인 경험적 프로세스5남아 있습니다. 솔루션에서 단백질 안정성 향상을 위해 예비 생물 실험 단백질 결정 화에 대 한 더 나은 출발점을 명확 하 게 제공 하 고 일반적으로 비교적 적은 양의 단백질 샘플6,7, 소비 8,9. 이 프로젝트에서 공부 될 대상 단백질의 다 수 또한 확장성, 높은 처리량 안정성 분석을 필요로 합니다. 사전 결정 화 단백질의 생물 특성에 대 한 가장 인기 있는 방법 중 하나는 열 교대 분석 실험 (또한 TSA 또는 시차 fluorimetry, DSF)10,11.
TSAs는 단백질의 열 변성을 추적 하는 환경에 민감한 형광 염료를 사용 합니다. 많은 염료는 일반적으로 사용 되는 그들의 환경, 종종 소수 환경에서 높은 형광 출력을 표시 하지만 극 지 환경12에 냉각 하는 빠른 진행의 극성에 따라 가변 형광 활동. 단백질은 일반적으로 그들의 소수 성 중 핵 변성, 단백질 집계 (그림 2)을 시작으로 종종 매우 높은 온도에서 염료 형광 감소 다음 중 노출 될 염료 형광에서 뚜렷한 증가 일으킬.
Hydrophobicity에 민감한 염료는 종종 일반 사용 TSA 염료에 대 한 좋은 선택, 그것은 수 있습니다 종종 해롭게 높은 배경 형광 표시 하는 큰, 용 매에 노출 된 소수 성 영역 단백질에 적합. 작업의 다른 모드와 Fluorophores 존재 (내용 참조), 하지만 대신 nanoDSF와 본질적인 단백질 형광 통해 변성을 추적 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다.
330의 방출 최대 형광 단백질의 비 극성 지구에 묻혀 있는 트립토판 잔류물 nm. 단백질 견본 펼쳐진다 고이 잔류물은 극 지 용 매에 노출 될, 그들의 방출 최대 350 nm13bathochromic 변화를 겪 습. nanoDSF 외부 fluorophores14에 대 한 필요 없이 단백질 샘플의 전개을 최대 방출에 있는이 교대를 이용 한다.
녹여 곡선 표시 단일 변성 단계 볼츠만 자형 모델에 데이터를 피팅 하 여 분석할 수 있습니다. 펼쳐진 전환 (Tm)의 굴절 점에서 온도 다른 조건의 favorability 비교 단백질 열 안정성의 정량적 측정 및 벤치 마크로 사용 됩니다.
다른 조건에서 동일한 단백질의 용융 곡선 때로는 볼츠만 자형 피팅 unfeasible 만들 수 있는 성분의 정도를 소유한 다. 고전적인 곡선 토폴로지에서 벗어나는 데이터에서 Tm 값을 분별, 수치 방법 나 미, 오픈-소스 TSA 데이터 분석 프로그램11에 같이 사용할 수 있습니다. 다른 열역학 프레임 워크 ProteoPlex 방법론15등 여러 변성 단계와 더 복잡 한 곡선 분석을 사용할 수 있습니다.
안정성 화면 빠르게 대상 단백질에 대 한 유리한 조건을 식별 하기 위해 TSA와 nanoDSF 실험에 사용 하기 위해 설계 되었습니다 (그림 3, 화면 구성을 사용할 수 있습니다는 보충 정보에). 결정학 파이프라인 등의 많은 단계에서 스크린으로 수집한 정보를 사용할 수 있습니다: 저장; 샘플 정화, 단백질 정화 과정; 전개를 통해 생산량 손실을 최소화 디자인, 강화 열 안정화 버퍼 및 마지막으로 결정 화, 합리적으로 설계 결정 화 실험을 지도 함께 활동 분석 실험에서 단백질 기능 분석
단백질 견본에 대 한 적당 한 버퍼 시스템으로 선택 하는 것은 매우 중요; 호환 되지 않는 pH 값 비활성화 또는 단백질의 변성 될 수 있습니다. 그러나, x 선 결정 구조 (표 1)의 많은 수에서 해결 하는 공동 결정된 버퍼 분자의 존재 또한 수은 간단한 pH 규정에 별도 화학 물질에서 비롯 된 대신 안정화 효과의 지표 버퍼 분자의 특징입니다.
다른 일반적으로 생물학적으로 호환 버퍼 시스템 함께 좋은 버퍼17,,1819 의 몇 가지를 사용 하 여 공식화, pH 화면에 버퍼 분자의 화학 효과 deconvolute 하도록 설계 결과 솔루션의 실제 pH에서 단백질 안정성. 각 버퍼 시스템에 대 한 세 가지 pH 값을 제공 하 고 pH 값 중복 서로 다른 시스템 간의 통합, 유리한 pH 값 및 대상 단백질에 대 한 유리한 버퍼 시스템 pH 화면 식별할 수 있습니다.
소금 스크린은 일반적으로 chaotropes, chelants, 중 금속 및 감소 시키는 대리인으로 실험실 소금 포함 되어 있습니다. 화면 높은 이온 힘을 가진 환경에 단백질 샘플의 선호도 대 한 일반적인 표시를 줄 수 있지만 화합물의 각 하위 그룹 또한 단백질의 잠재적인 구조에 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 크게 불안정 한 단백질 chelant 샘플 내에서 중요 한 구조상 금속을 나타내는 수 있습니다. 샘플 화면 내에서 금속 양이온에 의해 안정화도 강력 하 게 하는 경우이 추가 구조 실험에 대 한 유망한 출발점을 제공할 수 있습니다.
Osmolytes는 그들의 환경의 삼 투 속성에 영향을 주는 수용 성 화합물. 실제로, 그들은 무질서 단백질의 폴딩 및 스트레스 조건20,,2122에 특히 그들, 안정화 “화학 보호자”로 사용할 수 있습니다. 이러한 특성을 그들 매력적인 첨가제 단백질 결정학; 크리스탈 수확 하는 동안 cryoprotectants로 사용할 수, 장착 및 스토리지23을처리 합니다. Osmolytes의 잠재적인 사용은 또한 단백질의 정화를 확장합니다. 대장균 에서 표현 하는 재조합 형 단백질의 상당한 비율이 불용 성 고 표준 정화 방법을 사용 하 여 원래 상태에 복구 하기 어려운 될 수 있습니다. Osmolytes 안정화 및 불용 성 분수에서 단백질 회수를 사용할 수 있습니다, 그리고 증가 정화 수익률24.
Osmolyte 화면 설립된 화합물에 단백질 데이터 은행 항목25 및 Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated 경로 (DEOP)26 데이터베이스를 사용 하 여 설계 되었습니다 하 고 반복적으로 표준 단백질을 사용 하 여 최적화 된. 화면 osmolyte의 약 8 하위 만들어집니다: 글리세롤, 설탕과 폴리올, 비 세제 sulfobetaines (NDSBs), betaines 및 그들의 아날로그 organophosphates, dipeptides, 아미노산와 그들의 유도체 및 최종 기타 그룹. 여러 농도 용 해도 비교에 대 한 효과적인 농도 범위에 따라 각 osmolyte가 있습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 측면에는 원심 분리 단계 및 TSA 실험 (단계 1.5)에 대 한 96 잘 접시의 적절 한 씰링 포함 됩니다. 원심 분리 하면 단백질 샘플 화면 상태 접촉 및 혼합. 또한, 봉인 되지 않은 접시 사용 하는 경우 TSA 실험에 대 한 실험을 통해 증발, 샘플 농도 있는 증가 일으키는 원인이 되 고 조 단백질 집단의 기회를 증가 하는 용 매에 상당한 위험이 있다.
TSAs와 nanoDSF는 의무가 다양 한 단백질 견본; 샘플의 대부분 hydrophobicity 기반 기자 염료 또는 염료 무료 nanoDSF 해석할 용융 곡선을 생성할 수 있습니다. 만약 표준 형광 소스 단백질에 적합 하지 않습니다, 탐구 될 수 있는 프로토콜에 대 한 간단한 수정 fluorophore의 선택입니다. 여러 대체 염료 TSA 실험에 적합 될 수 있습니다. 예로 N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)는, thiol27, 및 4-반응 후 fluoresces 화합물 (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ)를 기반으로 하는 형광 화합물은 환경, 그것의 형광 단백질 샘플으로 증가의 강성 펼쳐져28,29 (후자 염료는 종종 샘플의 높은 농도 필요).
용융 곡선 분석의 다른 방법 Tm 은 악기 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 되지 않습니다 사용할 수 있습니다. 데이터는 동종을 하나만 변성 단계는 용융 곡선에서 잘린된 데이터 집합 다음 방정식으로 sigmoid 볼츠만에 맞을 수 있다:
온도 T에서의 형광 강도, F분 및최대 F F가 전에 형광 강렬 이며 변성 전환 후 각각 Tm 변성 전환 및 C의 중간점 온도 Tm에서 비탈길이 이다. 이 방법은 잘 간단한 2 단계 변성 과정, 하는 동안 복잡 한 용융 곡선 여러 전환 위해 적당 하다.
TSA의 주요 장점 중 하나는 접근; TSA 실험 고용 형광 염료에 대 한 적합 한 파장에서 필터 어떤 RT-PCR 시스템에서 수행할 수 있습니다. 이 소모품, 작업과 확인 TSA 프로젝트 비늘, 모두 업계와 학계에서의 광범위 한 귀중 한 기술, 필요한 단백질의 상대적으로 낮은 금액의 용이성의 저렴 한 비용으로 결합.
유리한 버퍼 상태를 나타내는 뿐만 아니라 화면 샘플 단백질 내의 구조 금속의 존재에 단서를 제공할 수 있습니다 일부 우물을 포함 되어 있습니다. 소금 화면에 특히 관심이 있을 수 있습니다 웰 스는 G6 G7, 5 mM EDTA 및 EGTA, 5mm를 각각 포함 하는. 이 우물에 상당한 열 불안은 chelants에 의해 분리 된 단백질에서 중요 한 금속 이온의 표시 될 수 있습니다. Osmolyte 화면 내에서 화합물 또한 잠재적으로 단백질의 기능에 단서를 제공할 수 있습니다. 화면에서 화합물의 많은 효소의 일반적인 기질 분자의 클래스에 속합니다. 예를 들어 lysozyme 대 saccharides (우물 A11-B10에에서 존재)에서 제공 하는 일반적인 안정화 효소, N-acetylglucosamine 올리고30의 설립된 기판에 그들의 구조적 유사성을 표시 될 수 있습니다.
위에서 설명한 TSA와 nanoDSF 프로토콜 또한 단백질-리간드 상호작용 연구에 적용할 수 있습니다. 단백질에 특히 묶는 ligands는 단지 내에 새로운 상호 작용을 도입 하 여 그것의 열 안정성을 높일 수 있습니다. 복용량-의존 긍정적인 변화 단백질 Tm 에 성공적인 단백질-ligand 상호 작용의 유망한 표시 이다. 속도, 처리량 및 낮은 비용 심사 TSAs 화합물 라이브러리의 했다 그것은 매우 인기 있는 방법을 초기 단계 약물 발견에.
대상 단백질 그리고 그들의 ligand 복합물의 버퍼 조건 최적화 될 수 있습니다 프로젝트의 성공을 위해 필수적인 많은 문학 예31,32,,3334를 보여 줍니다. 설치 시간 포함 2 시간 미만 복용 하는 일반적인 분석 결과 함께 TSAs 및 nanoDSF 안정성 화면 함께 버퍼 최적화를 위한 빠르고, 저렴 한 기술을 나타냅니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 685778) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받았다. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회에 의해 지원 되었다 (BBSRC, 부여 번호 BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB는 BBSRC 박사 교육 파트너십 뉴캐슬-리버풀-더 럼은 재학에 대 한 더 럼 대학 부의 생물 과학이이 자금으로 기여에 대 한 감사. 우리는 그의 도움에 대 한이 안 에드워즈와 더 럼 대학 부의 화학 질량 분석 학과 그들의 경 음악 분석을 위한 단백질 X 감사합니다. 우리는 대출 하 고이 프로젝트에 대 한 프로 메 테우 스 NT.48 시스템 지원에 대 한 바이러스-X 프로젝트, 그리고 클레어 Hatty를 NanoTemper GmbH에 또한 감사와 그의 작품에 대 한 Arnthor Ævarsson에 감사. 마지막으로, 감사 합니다 프랜시스 Gawthrop 하 Tozer 씨앗 BBSRC 회 어워드의 일환으로 그들의 지원에 대 한.
Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |