Summary
急速に熱ゲルシフト試金およびナノ示差走査/蛍光定量による条件の様々 なタンパク質の熱安定性をテストするためのプロトコルが表示されます。バッファー システム、塩・添加物、一緒には、構造と機能の研究の適切なバッファーを識別するために蛋白質の試金される 3 つのユニークな安定画面を構成します。
Abstract
Horizon2020 ウイルス X プロジェクトは、選択した極端なビオトープの virosphere を探索し、新規ウイルスのタンパク質を発見する 2015 年に設立されました。これらのタンパク質は、タンパク質の解析の潜在的なバイオ技術の価値を評価するには、構造と機能はこのプログラムの中心的課題です。蛋白質のサンプルの安定性は、意味のある分析結果を提供する、ターゲットの crystallizability を増加に不可欠です。タンパク質高スループットの安定性のための条件を最適化するための一般的な方法として熱シフト試金 (TSA) 蛍光ベースの手法を設立します。採用の蛍光物質は、Tsa、外因性、配慮が必要な染料です。代わりに、同様の手法が示差走査タンパク質自然螢光に依存しています/蛍光定量 (nanoDSF)、ナノです。新規 osmolyte 画面、有機添加物の結晶化裁判の TSA の予備的実験を導くために設計の 96 条件画面をご紹介します。一緒に前に開発した pH と塩の画面は、3 つのスクリーンのセットは、バッファー システムおよび添加物の広い範囲でタンパク質の安定性の包括的な分析を提供します。画面のユーティリティは、リゾチームとタンパク質 X、X ウイルス プロジェクトのターゲット蛋白質の TSA と nanoDSF の分析で示されています。
Introduction
タバコ etch ウイルス (TEV) プロテアーゼ1ライノ タイプ 3 C (HRV 3 C) プロテアーゼ2など、多くのバイオ テクノロジー有用酵素はウイルスのソースに属します。Horizon2020 ウイルス X プロジェクト (図 1)3。このプログラムの目的は知られている酵素の家族の特性の範囲を拡張するには (a) と (b) 未知関数 (酵素 X) の新規酵素を特徴付けるため。結晶構造決定は、タンパク質のシーケンスが認識4を超えて進化しているような場合特にターゲット蛋白質の特性評価に重要な役割を果たしています。タンパク質の安定性は、結晶ができる過程の重要な要素サンプルは、フォーム高品位結晶を回折する時間の期間にわたってコンホメーション同種と構造的に音をある必要があります。さらに、有利な分子環境によっても促進することができます彼らのアクティブな構造に存在するタンパク質活性測定法のために不可欠です。
にもかかわらず、crystallographers に利用可能な技術の開発、蛋白質の結晶化時間のかかり、労働集約的な経験的プロセス5のままです。溶液中のタンパク質の安定性を改善するために予備の生物物理実験蛋白質結晶化のはっきりより良い出発点を与えるし、タンパク質サンプル6,7、量が比較的少ないが通常消費 8,9。このプロジェクトで検討するターゲット蛋白質の多数もスケーラブルで高スループットの安定性アッセイが必要です。蛋白質の結晶化前生物物理特性の最も人気のある方法の 1 つは熱シフト試金 (TSA や示差走査 DSF/蛍光定量とも呼ばれる)10,11。
Tsa は、蛋白質のサンプルの熱変性を追跡する環境に敏感な蛍光染料を採用しています。多くの一般的に使用される染料は、しばしば疎水性環境で高い蛍光出力を表示するが、極域環境12の超急冷を受ける環境の極性に応じて可変蛍光活性を持ちます。その疎水性コアは変性、しばしば非常に高温で染料の蛍光性の減少が続く蛋白質集合体 (図 2) を開始中にさらされるとなるとタンパク質に染料の蛍光性の顕著な増加が普通です。
疎水性感受性色素は TSA 染料の一般的な使用のための良い選択ではしばしば、頻繁に悪影響高いバック グラウンド蛍光を表示、大きな、溶媒露出の疎水性領域が付いている蛋白質に適してできます。アクションの代替モードでの同時存在 (ディスカッションを参照)、しかし、それ nanoDSF と本質的な蛋白質の蛍光性変性を追跡することが望ましいこともあります。
排出量最大 330 の蛍光を発するタンパク質の無極性の地域に埋もれているトリプトファン残基 nm。蛋白質のサンプルを展開し、これらの残基は極性溶媒にさらされる、最大排出量は 350 nm13深シフトを受けます。nanoDSF は、この発光プローブの外因性フルオロ14を必要とせず蛋白質のサンプルの展開に最大の変化を悪用します。
曲線の示す単一の変性のステップはボルツマン字モデルにデータをフィットで解析することができますを溶かします。アンフォールディング転移 (Tm) の変曲点の温度は、さまざまな条件の好ましさを比較するタンパク質の熱安定性の定量測定、ベンチマークとして使用されます。
異なる条件で同じ蛋白融解曲線は時々、ボルツマン シグモイド フィットを不可能に作ることができる多様性のある程度を所有しています。古典的なカーブ トポロジから逸脱したデータから Tm値を識別するには、数値計算法は、ナミ、オープン ソース TSA データ解析プログラム11に用いられるものなど使えます。代替の熱力学的フレームワークは、ProteoPlex 方法論15などの複数の変性のステップをより複雑な曲線の分析にも使用できます。
安定性スクリーンは TSA と nanoDSF の実験で使用するため急速にターゲット蛋白質のための有利な条件を識別するために設計された (図 3、画面構成、補足情報で利用できる)。などの結晶構造のパイプラインのさまざまな段階で画面で収集した情報を使用できます: 検体の保存;蛋白質の浄化プロセスの間に繰り広げられる歩留まり損失を最小限に抑え、精製バッファーと最後に結晶化、結晶化を合理的に設計された試験を指導の熱安定化と活性測定法で蛋白質の機能を強化、デザインを分析します。
蛋白質のサンプルのための適切なバッファー システム基礎を選ぶことは必要不可欠です。互換性のない pH 値は非アクティブ化またはタンパク質の変性につながることができます。ただし、結晶化バッファー分子の x 線結晶構造解析 (表 1) の多数の解決の存在可能性がありますは別に簡単な pH の調節をし、代わりに由来する化学物質を安定させる効果を示す場合もバッファー分子の機能。
良いのバッファー17,18,19その他一般生物学的互換バッファー システムの横のいくつかを使用して定式化、pH 画面ではバッファー分子の化学的効果のようになりました、します。結果のソリューションの実際の ph 値からタンパク質の安定性。各バッファー システムに対する 3 つの pH 値を提供し、異なるシステム間の pH 値冗長性を組み込むことで pH 画面は有利な pH 値とターゲット蛋白質のための有利なバッファー システムの両方を識別できます。
研究室塩として chaotropes、キレート剤、重金属、還元剤の塩の画面は、一般的に含まれています。画面は高いイオン強度を持つ環境に蛋白質のサンプルの親和性の一般的な指標を与えることができますが、各サブグループ化合物の蛋白質の潜在的な構造に関する情報を提供できます。たとえば、蛋白質が著しく不安定になる chelant はサンプルには、重要な構造の金属を示す可能性があります。サンプルは、画面内で金属陽イオンによって安定化も強く場合、これはさらに構造実験の有望な開始点を提供できます。
浸透は、彼らの環境の浸透特性に影響を与える水溶性の化合物です。自然の中で、彼らは天然タンパク質のフォールディングと特にストレス条件20,21,22で安定しており、それらを強制する「ケミカルシャペロン」として使用できます。これらの特性は、それら魅力的な添加剤タンパク質結晶構造解析;クリスタルの収穫時に凍結保護剤として使用可能なマウント ・23を処理します。浸透圧物質の潜在的な使用は、タンパク質の精製にも当てはまります。大腸菌で発現組換え蛋白質のかなりの割合が不溶性の標準的な浄化方法を使用して本来の状態に回復することは困難ことができます。浸透を使用して安定、不溶性画分からタンパク質を回収し、精製増加利回り24。
Osmolyte 画面は蛋白質のデータ ・ バンクのエントリ25と Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated 経路 (DEOP)26データベースで現在確立された化合物を用いた設計し、標準蛋白質を使用してに繰り返し最適化します。画面構築 osmolyte の約 8 つのサブクラス: グリセリン、糖と糖アルコール、1l5ndsb類 (NDSBs)、ベタイン、その類縁化合物の有機リン剤、ジペプチド、アミノ酸とその誘導体、その他の最終的なグループ。各 osmolyte は溶解性や比較のため効果的な濃度範囲に基づいて複数の濃度で存在します。
Protocol
1. 蛋白質のサンプルの準備
- 96 ウェル ブロックで 500 μ 因数として安定性スクリーンを定式化し、ストレージ用シール.96 ウェル プレート マルチ チャンネル ピペットを使用して (図 4A) の時間を節約するのも対応に安定画面の各状態の 10 μ L を転送します。
- 適切なバッファー システムで約 1 mg mL-1タンパク質溶液の 1 mL を準備します。適切なバッファーの組成は、各蛋白質のサンプルと異なりますしようとする良い最初のバッファーは 100 mm NaCl、Ph7.2 のリン酸ナトリウム 10 mM。
メモ: 許容濃度変化ケースバイ ケースが 0.5 - 5 mg mL-1濃度範囲は通常解析可能な曲線を作り出します。希釈バッファーは、マスキング各条件の効果を避けるために安定画面で使用に適しています。通常、バッファー組成が約 100 mM の NaCl を約 10 mM バッファーです。 - TSA の実験を実行している場合は、20 x の最終的な集中に蛋白質のサンプルに可視オレンジ色素を追加します。反転または簡単なボルテックスをミックスします。
- 手順 1.1 (図 4B) で作製した 96 ウェル プレートの各ウェルにタンパク質溶液 10 μ L を転送します。
- 遠心分離機の 600 x gタンパク質サンプル画面コンポーネント (図 4C) を混合されていることを確認するために 2 分の 96 ウェル プレートとシールします。
- 再シール安定画面ディープ ウェル ブロックし 4 ヶ月の 4 ° C で画面を保存します。いくつかのコンポーネントは感光性、暗闇の中で塩の画面を保存します。
- NanoDSF 実験を実行している場合は、手順 2 に進みます。TSA の実験を実行している場合は、手順 4 に進みます。
2. nanoDSF 実験の準備
- 装置はクリーン、サンプル ラック近く任意のほこりに特に注意を払ってを確認します。システムに後方のミラーがある場合エタノールと糸くずのティッシュを使用してそれをきれいに。
- 開いた引き出しボタンを押して、サンプル] ドロワーを開きます。(図 5A)。
- 96 ウェル プレートの各ウェルからソリューションに毛細血管の感動の一方の端によって約 10 μ L で毛細血管を読み込むサンプル ラック (図 5B) の対応するキャピラリー ホルダーにそれらを配置します。指紋などの毛細血管の中を汚染しないために注意してください。 これは実験を通して蛍光測定を妨げる可能性として。
- 磁気シール ストリップ (図 5C) 毛細血管を固定します。
3. プログラミング nanoDSF 実験
- 位置と検出スキャンタブ増加の検出スキャンの開始ボタンを押すと各毛管の強度を検出または 10% までの初期電力から入射励起強度を減少する事前スキャンを起動、キャピラリー スキャンのピークは 4,000-12,000 台 (図 5D) の間です。
- サンプルを折り畳まれ、十分に集中できるように、急な温度勾配を有する初期メルト スキャンの使用をお勧めします。溶融をスキャン] タブで溶かす 7.0 ° C 分-1、開始温度25 ° C と終了温度95 ° C、温度勾配のオプションを設定してスキャンし、nanoDSF を起動プログラムは、を押すことによって実験します。溶融を開始ボタン。曲線は、検出可能な変曲点を表示しない結果を溶かす場合、さらにサンプルを集中またはタンパク質が正しく折り返されているかどうかのチェックをご検討ください。
- 2.1 2.4 完全な実験のサンプルを準備する手順を繰り返します。
- 溶融をスキャン] タブでプログラム、メルト 1.0 ° C 分-1、開始温度25 ° C と終了温度95 ° C、温度勾配のオプションを設定してスキャンし、nanoDSF を起動実験を押すことによって融解開始ボタン。
4. TSA 実験を実行します。
- しっかりと引き出しの右側にインデントを押すことによってサンプル] ドロワーを開きます。背面左 (図 4D) にも A1 と RT-PCR システムに 96 ウェル トレイを配置します。
- TSA の実験のセットアップを開始する新しい実験ボタンをクリックします。
- 実験のプロパティ] タブでクリックを溶かす曲線] オプションが表示されたらを設定する実験の種類?と他のオプションが表示されたらターゲット シーケンスの検出に使用するどの試薬?
- プレート セットアップ/ターゲットの定義とサンプルタブ、ターゲット名を入力し、ロックスとどれもがクェンチャーとして記者を設定します。
- プレート セットアップ ターゲットとサンプルを割り当てる/ ] タブで、前の手順で入力したターゲット名 96 ウェル プレートの各ウェルに割り当てます。同じタブで、どれもが受動的な参照として使用する染料を選択を設定します。
- [メソッドの実行] タブで合計 3 つまでの手順を削除します。時刻 00:05; ランプ率 100%、25.0 ° C に最初の手順を設定します。95.0 ° c、ランプ率 1%、時間 1:00; 2 番目のステップ95.0 ° c、ランプ率 100%、3 番目のステップは時間 00時 05分です。データを収集ドロップ ダウン メニューを使用してデータの収集を選択またはデータ コレクションアイコン (図 6) を押すことによって。
- 20 μ L をウェルあたりの反作用ボリュームを設定します。
- TSA の実験を開始する起動し、実行ボタンを押します。
5. データの解析
- 融解曲線をプロットする波長を選択します。NanoDSF 実験、330 での蛍光強度比の nm、350 nm (非極性と極性環境でトリプトファンにそれぞれ対応する)13は一般的に使用されます。ほとんど Tsa の色素の排出量の最大は融解曲線のプロットに適しています (可視オレンジの発光極大は 569 nm)12。
- 各溶解曲線の屈曲ポイントを決定することにより各条件の Tm値を計算します。ほとんどの nanoDSF システムは、データ集録後融解曲線の数値微分で Tm値を自動的に計算します。ナミ11などの代替、無料の GUI ドリブン ソフトウェアがデータ解析と下流の処理、ヒートマップ要約 Tmを生産するオプションを与えることを自動化できます使用ソフトウェアは、Tm値を自動的に計算されていない場合全体の値 96 ウェル実験 (付属の参照には、ナミとデータ処理のガイダンスとリソースが用意されています)。
- 調査のすべての条件の Tm値を比較します。安定の画面には、水だけを含む (A1 および A2) 各画面で 2 つの井戸が含まれます。ベンチマークとして水専用の値により体系的なエラーに対処し、安定効果を比較しやすいように、ΔTm値の計算。高い Tm値は、下流用に推奨されている熱安定の条件を示します。有望な条件は、しばしば彼らの安定化濃度依存性を示します。
Representative Results
安定画面で検定したリゾチームとウイルス X プロジェクトのターゲット蛋白質蛋白質 X osmolyte 画面で検定しました。一般的に生産両方の蛋白質を溶かす TSA と nanoDSF の両方の実験 (代表的な曲線の数値を伴うを参照) で変性の明確に定義された遷移曲線。いくつかの場合どこ定義された変性転移は、解釈曲線を生成したサンプルの変性とに含まれていない Tm比較として解釈されました。
チームパワーに向かってリゾチーム塩化アンモニウムの熱安定化特性塩画面からサンプルの結果を図 7に示します。上記などの濃度依存性は、有望な条件を示すが、それは熱安定化が一般的にから発生したかどうか参照してくださいにいくつかの異なる塩のイオン濃度の増加の結果を比較することができます、バッファーのイオン強度の増加や、特定のイオンの存在が追加の安定性を付与するかどうか。
PH 画面 (図 8) リゾチーム Tm値の比較では、2 つの情報を明らかにします。まず、pH 値の減少と安定性の増加の一般的な傾向があります。第二に、同じ pH 値の異なるバッファー システムを使用して得られる範囲の Tm値は、大きくなります。
図 8のデータでは、TSA は、この実験では nanoDSF 間の合意は、一般的に良いが、nanoDSF はわずかにより高い T のm値と同一視する傾向を示しています、TSA よりわずかに大きい Tmシフトを示唆しています。しかし、pH 値が 8.5 以上のいくつかの井戸は、TSA は、nanoDSF から取得された Tm値に大きな差を示します。違いが異なる pH 値でタンパク質の変性のメカニズムに起因する可能性があります。たとえば、疎水性感受性色素は比較的低い Tmかどうか蛋白質の疎水性領域にさらされる溶媒トリプトファン残基の変更の環境よりも大幅に高速極性で読書を与えることができます。
Osmolyte スクリーンを用いたリゾチームで得られた Tm値のヒートマップを図 9に示します。コントロール井戸 (ウェルズ A1 と A2、脱イオン水を含む) と比較して最高の Tm増加の条件は、濃い青が着色されます。図 9で識別された特に安定条件は、グリセロール、1 M D-ソルビトール、100 mM ヒポタウリン、10 mM 翼 Gly (井戸 A4 A6、A9、E7、F8、それぞれ) に含まれます。
図 10に示すタンパク質 X. TSA で得られた Tm値のヒートマップと浸透テストの大半 Tm (内 1 ° C) のいずれかマイナーな増加を与えるか、悪影響を及ぼす Osmolyte 画面 nanoDSF 実験が明らかにタンパク質 X の安定性。特に、室温でサンプルを変性するジピコリン酸濃度 10 mM (よく D1) が表示されます。TSA と nanoDSF の結果は、すぐに蛋白質を操作するときに避けるべきである蛋白質 X の互換性のない添加物としてジピコリン酸を識別します。それにもかかわらず、高濃度の D-ソルビトールとアラビノース (ウェルズ A9 および B9 1 M の両方)、グリセリン、TMAO (井戸 A4 A6 や E1、それぞれ) 熱安定化として識別されました。
リゾチーム、各安定画面から最高の Tm値を降伏の条件の組み合わせが相乗相乗効果のプローブ テストされました。図 11 Tm値の一般的な増加で表示バッファー システムのより多くのコンポーネント (pH、塩、osmolyte) が追加されます。MES のアンモニウムの硫酸塩、D-ソルビトール、場合 Tmは 10 ° C 観察できるすべてのコンポーネントが存在する場合だけで MES と比較して大きく増加します。図 11は、バッファーの個々 のコンポーネントを最適化され、安定画面と組み合わせるときに、顕著な相乗効果が発生することが示しています。
一般的なノートでは、図 11は、TSA の nanoDSF 実験を観察することができます ΔTm値の大きさを示しています。ΔTm達成の大きさ異なります蛋白質システムに基づいて大幅が、5 ° c 前後 ΔTm値はしばしば安定効果を示す。
図 1: バイオプロスペクティング。ウイルス X プロジェクトで極端な環境からサンプルのコレクションです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: TSA 概略図。TSA の実験から得られた典型的な融解曲線の例。この曲線は、古典的な"2 つの状態「タンパク質の変性の特徴, サンプル人口の遷移検出可能な部分的に折り返されている中間体なしに変性折り返されていますいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 安定画面ワークフロー 。安定画面を使用してバッファー最適化の標準的なワークフローです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: TSA 実験安定画面で標準のワークフロー 。左から右へ: 96 ウェル プレートに安定画面の (、) Pipetting 因数。(B) プレート蛍光色素と蛋白質のサンプルをピペッティングします。(C) 遠心分離前にプレートをシールします。(D) RT-PCR システムにプレートを配置すること。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:標準 nanoDSF 実験ワークフロー 。(A) ラックを読み込み毛細血管を開きます。(B) ラックに毛細血管を読み込んでいます。(C) 磁気シール ストリップと毛細血管を固定します。(D) 実験をプログラミング。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: RT-PCR システムのユーザー インターフェイスです。TSA 実験がプログラムされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 塩の画面サンプル データ。(A) リゾチームとラベル無料 nanoDSF 実験のための 350 nm 対 330 nm での蛍光強度の比。サンプルは、塩の画面 (1.5 M - 塩化アンモニウム 0.2 M) の井戸 C7 C12 に対応します。各条件の計算 Tm値プロットに重畳しています。(B) Tm値の概要は、図 7に示したデータから計算されます。(C) 蛍光強度 590 にリゾチームを用いた疎水性敏感なレポーター色素 TSA 実験の nm。図 7Aのようなサンプルは、塩の画面の井戸 C7 C12 に対応します。計算 Tm値はグラフに重なっています。(D) Tm値の概要は、図 7Cに存在するデータから計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: pH 画面サンプル データ。リゾチームと pH 画面で得られた Tmシフトの概要です。各ポイントを表す主体的条件;同じ pH 値でのポイントが同じ pH で別のバッファー システムです。Tmシフトは、TSA の実験のため 68.0 ° C と ° C、71.9 nanoDSF 実験のコントロール Tmを基準にして計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: Osmolyte 画面サンプル データ (リゾチーム).リゾチームと osmolyte 画面のラベル無料 nanoDSF 実験から得られた Tm値の概要です。Tm値 (° C) では、コントロールとして水を含んだ井戸 A1 と A2 と比較されます。ヒートマップは比較 ΔTm値に基づいて生成された (青を表す Tm増加と赤 Tm低下)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: Osmolyte 画面サンプル データ (タンパク質 X).(A) タンパク質 X と osmolyte スクリーン ラベル無料 nanoDSF 実験から得られた Tm値の概要です。Tm値はコントロールとして水を含んだ井戸 A1 と A2 と比較されます。ヒートマップは比較 ΔTm値に基づいて生成された (青を表す Tm増加と赤 Tm低下)。(よく A9 から得られる nanoDSF B) 曲線 (1 M D-ソルビトール、安定条件) および D1 (10 mM ジピコリン酸、不安定状態)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: バッファーの最適化に及ぼす Tm.リゾチームの TSA Tm値 Tmで最大の増加を与えられる各画面の条件と組み合わせます。100 mM 100 mM、MES、pH 4.2, 酢酸の pH 5.6、横 1.5 M アンモニウム硫酸塩として、バッファー システムとして選ばれました。Osmolyte 濃度の osmolyte 画面で見つけられるそれらと同じ: 10 mM 翼 Gly、100 mM ヒポタウリン 50 mM L リジン、D-ソルビトール 1 M。誤差範囲は、六つの複製の標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 分子 | PDB コード | 共同結晶化の頻度 |
| リン酸 | PO4 | 5132 |
| 酢酸 | 法 | 4521 |
| 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic 酸 (MES) | MES | 1334 |
| トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) | TRS フォン ジャック | 1155 |
| ギ酸 | FMT | 1072 |
表 1: 蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) エントリのバッファー分子共結晶周波数の概要。144,868 エントリ (18/12/05 現在正解) の合計から PDBsum16を通じて取得されたデータ。
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Discussion
プロトコルの中で重要な側面には、遠心分離のステップと TSA 実験 (ステップ 1.5) のための 96 ウェル プレートの適切なシールがあります。遠心分離により、タンパク質サンプル画面条件接触に入って来るし、ミックスします。さらに、封印されていないプレートを使用する場合 TSA 実験の溶媒蒸発実験を通じて、サンプル濃度の増加を引き起こして、早期蛋白質の集合のチャンスを増やすことの重大なリスクがあります。
NanoDSF の Tsa および蛋白質のサンプルの広い範囲に適しています。サンプルの大半は、疎水性レポーター色素や色素フリー nanoDSF を通じて解釈メルト曲線を生成できます。標準蛍光源が蛋白質のために適していない場合、探検することができるプロトコルに最も簡単な修正は、fluorophore 適しています。いくつかの代替の染料は、TSA の実験に適した可能性があります。例としては、N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)、チオール27・ 4 で反応後蛍光を発する化合物 (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ)、変化に基づく蛍光化合物、その環境には蛋白質のサンプルとしてその蛍光を増加の剛性には、28,29 (後者の色素がしばしば必要サンプルの濃度が高い) が繰り広げられます。
融解曲線分析の代替方法 Tmが計測器のソフトウェアによって自動的に計算されない場合があります。データは均質な溶融カーブで感じ取ることができます 1 つだけの変性のステップ、その切り捨てられたデータセットは次の式により s 状結腸ボルツマンに合うことが。
ここで F は温度 T での蛍光強度、F分F最大前に蛍光強度あり変性移行後それぞれ、Tmは変性転移と C の中間温度Tmで勾配であります。このメソッドは、単純な 2 段階の変性プロセスに適して中、複数のトランジションを持つ複雑なメルト カーブに適したじゃないです。
TSA の主要な利点の 1 つは、アクセシビリティ;TSA 実験は、採用されている蛍光色素の適切な波長フィルターを任意の RT-PCR システムで実行できます。これは、消耗品、操作性と比較的少量の必要なプロジェクト規模、業界と学界の両方の広い範囲のための貴重な技術 TSA を作るタンパク質の低コストと相まってください。
有利なバッファーの状態を示すだけでなく、画面にサンプルの蛋白質の構造の金属の存在に手がかりを与える可能性がありますいくつかの井戸です。塩画面で特定の興味のある井戸には、G6、G7、それぞれ 5 mM EDTA と 5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、格納があります。これらの井戸で重要な熱不安定は、キレート剤による隔離は、蛋白質の重要な金属イオンの示す可能性があります。Osmolyte 画面内の化合物はまた、潜在的蛋白質の機能を手がかりを提供できます。画面中の化合物の多くは酵素の共通の基質分子のクラスに属しています。たとえば、リゾチーム (現井戸 A11 B10) 糖によって与えられる一般的な安定化は酵素、n-アセチルグルコサミン オリゴマー30の確立された基板の構造的類似性に起因すること。
上記 TSA および nanoDSF プロトコルもタンパク質-リガンド相互作用の研究に適応することができます。特にタンパク質に結合するリガンドは、複合施設内の新しい相互作用を導入することにより熱安定性を増やすことができます。用量依存的タンパク質 Tm正のシフトは成功したタンパク質-リガンド相互作用の有望な兆候です。速度、スループットおよび Tsa の化合物ライブラリーのスクリーニングの低コストしました非常に普及した方法に初期段階の創。
ターゲット蛋白質及びその配位子錯体バッファー条件を最適化することができます多く文献例31,32,33,34としてのプロジェクトの成功に不可欠。セットアップ時間を含む 2 h を取って下典型的なアッセイ、Tsa および安定性スクリーンと相まって nanoDSF バッファーの最適化のための高速、安価な技術を表しています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (グラント契約 n ° 685778) の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金を受けています。この仕事に支えられたバイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC、許可番号 BB/J014516/1 BB/M011186/1)。DB は、BBSRC 博士研修パートナーシップ ニューカッスル-リバプール-ダーラムは学生の身分のためとダラム大学バイオ サイエンス学科のこの作品の資金に貢献を感謝します。彼の助けの Ian エドワーズとタンパク質 X の機器分析ダーラム大学化学部の質量分析部に感謝します融資とこのプロジェクトのプロメテウス NT.48 システム支援のためウイルス X プロジェクトとクレア ハティー、NanoTemper 社にも感謝彼の仕事のため Arnthor Ævarsson に感謝しております。最後に、フランシス Gawthrop およびトーザー種子 BBSRC iCASE 賞の一部として彼らのサポートをありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
| The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
| SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
| 96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
| Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
| Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |
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