Automatically Generated

Summary

بروتوكول يرد بسرعة اختبار الثبات الحراري للبروتينات في مجموعة متنوعة من الظروف من خلال فحوصات التحول الحراري ونانو فرق المسح فلوريميتري. تتألف من ثلاث شاشات استقرار فريدة من نوعها، هي جزيئي نظم المخزن المؤقت والأملاح والمواد المضافة، معا مع البروتينات لتحديد مخازن مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية.

Abstract

تم إنشاء مشروع Horizon2020 الفيروس العاشر في عام 2015 لاستكشاف فيروسفيري للحيوية القصوى المحددة واكتشاف البروتينات الفيروسية الرواية. تقييم القيمة التقنية الحيوية المحتملة لهذه البروتينات، وتحليل البروتين هياكلها ووظائفها تحدي الرئيسي في هذا البرنامج. استقرار عينة البروتين ضروري لتقديم نتائج التحليل ذات مغزى وزيادة كريستاليزابيليتي الأهداف. يتم تأسيس المقايسة التحول الحراري (TSA)، تقنية تستند إلى الأسفار، كوسيلة شعبية لتحسين الظروف للاستقرار البروتين في الفائق. في الثمرة، هي fluorophores العاملين الأصباغ الخارجية وحساسة بيئياً. بديل، هو تقنية مماثلة نانو فرق المسح فلوريميتري (نانودسف)، الذي يعتمد على البروتين الأسفار الأصلية. نحن الحاضرين هنا على شاشة أوسموليتي رواية، شاشة 96-شرط العضوية المضافات مصممة لتوجيه المحاكمات تبلور من خلال التجارب الأولية في حساب السياحة الفرعي. جنبا إلى جنب مع درجة الحموضة التي وضعت سابقا وشاشات الملح، توفر المجموعة من ثلاث شاشات تحليلاً شاملا للاستقرار البروتين في طائفة واسعة من نظم العازلة والمواد المضافة. الأداة المساعدة للشاشات يتجلى في تحليل حساب السياحة الفرعي ونانودسف lysozyme و “العاشر البروتين”، بروتين المستهدف من المشروع الفيروس العاشر.

Introduction

العديد من الإنزيمات المفيدة زراعتها تأتي من مصادر الفيروسية، مثل التبغ أحفر حوزتي الفيروس (TEV)¹ واكتب رهينوفيروس البشرية مبطلات ج 3 (HRV ج 3)². المشروع (الشكل 1) فيروس Horizon2020-X³. ويهدف هذا البرنامج (أ) توسيع نطاق خصائص الأسر الإنزيم المعروف و (ب) لتوصيف الإنزيمات رواية دالة غير معروفة حتى الآن (إنزيم X). تصميم بنية بلورية يلعب دوراً محوريا في توصيف البروتين المستهدف، خاصة في تلك الحالات حيث قد تطورت تسلسل البروتين بعد اعتراف⁴. البروتين الاستقرار عامل رئيسي في عملية بلورة؛ يجب أن تكون عينات متجانسة كونفورماتيونالي والصوت هيكلياً على مدى فترة من الزمن بشكل عالي الجودة، ديفراكتينج بلورات. وعلاوة على ذلك، من الضروري لفحوصات نشاط البروتينات الموجودة في تلك المطابقة النشط، الذي يمكن أن تيسره أيضا مناخا جزيئية.

على الرغم من التطور في التكنولوجيا المتاحة لانقسامها، تبلور البروتينات تظل عملية تجريبية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة⁵. أولى التجارب الفيزيائية الحيوية لتحسين ثبات البروتين في الحل تعطي وضوح نقطة انطلاق أفضل لبلورة البروتينات وتستهلك عادة سوى كمية صغيرة نسبيا من البروتين العينة^{6،7، 8،9}. عدد كبير من البروتينات المستهدفة دراستها في هذا المشروع يقتضي أيضا فحوصات الاستقرار للتحجيم، والفائق. هو واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لتوصيف الفيزيائية قبل بلورة البروتينات المقايسة التحول الحراري (يعرف أيضا باسم إدارة أمن النقل أو التفاضلي فلوريميتري، مهرجان دبي للتسوق)^10،11.

وتستخدم الثمرة صبغة فلورسنت الحساسة بيئياً لتعقب تمسخ الحرارية لعينات البروتين. العديد من الأصباغ المستخدمة بشكل شائع بنشاط fluorescence متغيرة تبعاً للأقطاب بيئتهم، وكثيراً ما عرض على إخراج فلورية عالية في بيئات مسعور لكن تمر تبريد سريع في البيئات القطبية¹². البروتينات عموما يسبب زيادات واضحة في الأسفار صبغ كما أصبح عرضه النوى مسعور أثناء تمسخ، غالباً ما يتبعه انخفاض في الأسفار صبغ في درجات حرارة عالية جداً كما تبدأ البروتينات للتجميع (الشكل 2).

بينما صبغة حساسة hydrophobicity غالباً خياراً جيدا لصبغة السياحة ذات استخدام العام، يمكن أن يكون غير مناسب للبروتينات مع مناطق مسعور كبيرة، ويتعرض المذيبات، التي كثيرا ما تعرض fluorescence خلفية عالية ضاراً. توجد Fluorophores مع أنماط بديلة للعمل (انظر المناقشة)، ولكن بدلاً من ذلك قد يكون من المستصوب لتعقب تمسخ من خلال الأسفار البروتين المضمنة مع نانودسف.

بقايا التربتوفان التي يتم دفنها في مناطق nonpolar بروتين فلوريس بأقصى انبعاثات 330 نيوتن متر. كما تتكشف عينة بروتين وهذه المخلفات تصبح عرضه للمذيبات قطبية، يخضع الانبعاثات منها الحد الأقصى تحول باثوتشروميك إلى 350 نانومتر¹³. نانودسف يستغل هذا التحول في الانبعاثات الحد الأقصى للتحقيق تتكشف من عينة البروتين دون الحاجة إلى فلوروفوريس الخارجية¹⁴.

تذوب منحنيات تبين الخطوات تمسخ واحدة يمكن تحليلها باحتواء البيانات إلى نموذج سيجمويدال بولتزمان. درجة الحرارة عند نقطة انعطاف للعملية الانتقالية الجارية (T_m) يستخدم كمقياس كمي للبروتين الثبات الحراري ونقطة مرجعية لمقارنة فافورابيليتي الظروف المختلفة.

منحنيات تذوب من البروتين نفسه في ظروف مختلفة في بعض الأحيان يتمتع بدرجة من عدم التجانس التي يمكن أن تجعل من مناسب سيجمويدال بولتزمان غير مجد. لتمييز القيم_m T من البيانات التي ينحرف عن الطبولوجيا منحنى الكلاسيكية، يمكن استخدام الطرق العددية مثل تلك المستخدمة في نامي، مفتوح مصدر بيانات حساب السياحة الفرعي تحليل برنامج¹¹. يمكن أيضا استخدام أطر دينامي حراري بديلة لتحليل منحنيات أكثر تعقيداً مع خطوات تمسخ متعددة، مثل منهجية بروتيوبليكس¹⁵.

شاشات الاستقرار كانت مصممة للاستخدام في تجارب السياحة ونانودسف لسرعة تحديد الظروف المواتية لبروتين المستهدف (الشكل 3، التراكيب الشاشة متوفرة في المعلومات التكميلية). يمكن استخدام المعلومات التي تم جمعها مع الشاشات في مراحل عديدة من خط أنابيب بلورية، بما في ذلك: نموذج التخزين؛ تنقية، التقليل من فقدان المحصول عن طريق البروتين التي تتكشف أثناء عملية التنقية؛ الاعتداء التصميم، وتعزيز وظائف البروتين في فحوصات النشاط مع استقرار حرارياً المخازن المؤقتة، وأخيراً تبلور، توجيه المحاكمات تبلور مصممة بطريقة رشيدة.

اختيار أساس نظام المخزن مؤقت مناسبة لبروتين عينة أمر حيوي؛ يمكن أن تؤدي قيم الأس الهيدروجيني غير متوافق للتعطيل أو تمسخ البروتين. غير أنه يمكن وجود جزيئات المخزن المؤقت المشترك تبلور حلها في عدد كبير من هياكل الكريستال الأشعة السينية (الجدول 1) كما يدل على تأثير استقرار منفصل لتنظيم الأس الهيدروجيني البسيطة، وبدلاً من ذلك ينبع من المادة الكيميائية ميزات للجزيء المخزن المؤقت.

تصاغ باستخدام العديد من حسن للمخازن المؤقتة^17،18،19 جنبا إلى جنب مع النظم الأخرى العازلة عادة متوافقة بيولوجيا، صمم الشاشة الرقم الهيدروجيني ديكونفولوتي أثر الكيميائية للجزيء المخزن المؤقت في الاستقرار البروتين من درجة الحموضة الفعلية للحل الناتج عن ذلك. بتوفير ثلاث قيم الأس الهيدروجيني لكل نظام المخزن المؤقت وإدراج الرقم الهيدروجيني قيمة التكرار بين النظم المختلفة، يمكن تحديد الشاشة الرقم الهيدروجيني قيم pH ملائمة ونظم العازلة مواتية لبروتين هدف.

يحتوي على الشاشة الملح عموما أملاح المختبرات، فضلا عن تشاوتروبيس، تشيلانتس، والمعادن الثقيلة ووكلاء الحد. الشاشة يمكن أن تعطي مؤشرا عاماً للتقارب من عينة البروتين إلى البيئات عالية القوة الأيونية، ولكن كل مجموعة فرعية من المركبات يمكن أيضا تقديم معلومات عن الهيكل المحتمل للبروتين. على سبيل المثال، يمكن أن تشيلانت زعزعة الاستقرار إلى حد كبير بروتين تدل المعادن الهيكلية الهامة داخل العينة. إذا كانت العينة بشدة أيضا استقرت قبل الموجبة معدنية ضمن الشاشة، هذا يمكن أن توفر نقطة بداية مبشرة بالخير للمزيد من التجارب الهيكلية.

أوسموليتيس هي مركبات قابلة للذوبان التي تؤثر على خصائص ناضح من بيئتهم. في طبيعتها، وأنها يمكن أن تستخدم ك “مرافقين الكيميائية”، فرض طي البروتينات اضطرابه وتحقيق الاستقرار لهم، لا سيما في الإجهاد الظروف^20،،من²¹²². هذه الخصائص تجعلها إضافات جذابة في البروتين البلوري؛ يمكن استخدامها المنتجة أثناء الحصاد كريستال، تركيب وتخزين عمليات²³. إمكانية استخدام أوسموليتيس يمتد أيضا إلى تنقية البروتينات. يمكن أن تكون نسبة كبيرة من البروتينات المؤتلف المعرب عنها في كولاي غير قابلة للذوبان وصعوبة استرداد في الدولة الأصلية التي تستخدم أساليب تنقية القياسية. يمكن استخدام أوسموليتيس لتحقيق الاستقرار وإنقاذ البروتينات من كسور غير قابلة للذوبان، وتنقية زيادة غلة²⁴.

الشاشة أوسموليتي تم تصميمها باستخدام مركبات ثابتة موجودة في “مصرف بيانات البروتين” إدخالات²⁵ و²⁶ Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated مسارات (DEOP) قاعدة البيانات وتكراري الأمثل باستخدام البروتينات القياسية. الشاشة بنيت حوالي ثمانية أقسام فرعية من أوسموليتي: والغليسيرول والفوسفاتية السكريات والبوليولات، غير المنظفات سولفوبيتينيس (ندسبس)، بيتينيس، ونظائرها، وديبيبتيديس، والأحماض الأمينية ومشتقاتها ومجموعة متنوعة نهائي. كل أوسموليتي حاضرة في تركيزات متعددة على أساس القابلية للذوبان ويتراوح التركيز الفعال للمقارنة.

Protocol

1-إعداد نماذج البروتين وضع الشاشات الاستقرار ك 500 ميليلتر مختبرين في كتل 96-جيدا وختم للتخزين. نقل 10 ميليلتر لكل شرط من شاشة الاستقرار في المقابل جيدا من صفيحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات توفير الوقت (الشكل 4أ). إعداد مل 1 ملغ حوالي 1 مل-1 البروتين حل في نظام المخزن مؤقت ملائم. وبينما يختلف تكوين مخزن مؤقت للمناسبة مع كل عينة البروتين، المخزن مؤقت أول جيدة لمحاولة فوسفات الصوديوم 10 ملم مع 100 ملم كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 7.2.ملاحظة: تختلف تركيزات البروتين مقبول حالة بحالة، ولكن تركيز يتراوح من 0.5-5 ملغ مل-1 تنتج عادة منحنيات أناليزابل. المخازن المؤقتة لتمييع ينصح للاستخدام مع الشاشات الاستقرار لتجنب إخفاء آثار كل شرط. المخزن المؤقت نموذجية التراكيب هي حوالي 10 ملم المخزن المؤقت مع حوالي 100 مم كلوريد الصوديوم. إذا كان أداء تجربة حساب السياحة الفرعي، إضافة صبغة “اللون البرتقالي سيبرو” للعينة البروتين إلى نهائي تركز 20 x. مزيج أما انعكاس أو فورتيكسينج قصيرة. نقل 10 ميليلتر من الحل البروتين في كل بئر من لوحة 96-جيدا إعدادها في “الخطوة 1، 1” (الشكل 4ب). ختم والطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 2 دقيقة في 600 x ز لضمان عنصر البروتين عينة والشاشة هي مختلطة (الشكل 4ج). إعادة ختم الشاشة الاستقرار كتلة عميق جيدا وتخزين الشاشة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. تخزين الشاشة الملح في الظلام، كما أن بعض المكونات حساس. إذا كان أداء تجربة نانودسف، انتقل إلى الخطوة 2. إذا كان أداء تجربة حساب السياحة الفرعي، انتقل إلى الخطوة 4. 2-إعداد نانودسف التجربة تأكد من أن المعدات نظيفة، مع إيلاء اهتمام خاص لأي الغبار قرب رف عينة. إذا كان النظام يحتوي على مرآة باكسكاتيرينج، تنظيفه باستخدام الإيثانول وأنسجة خالية من الوبر. فتح درج عينة عن طريق الضغط على زر فتح درج . (الشكل 5ألف). تحميل الشعيرات الدموية مع حوالي 10 ميليلتر من كل بئر من لوحة 96-جيدا قبل لمس نهاية واحدة شعري في الحل، ثم وضعها في المناظرة الشعرية أصحاب رف عينة (الشكل 5ب). يجب الحرص على عدم تلويث الوسط من الشعيرات الدموية مع بصمات الأصابع، إلخ.، وهذا يمكن أن تتداخل مع قراءات الأسفار طوال التجربة. شل الشعيرات الدموية مع قطاع الختم المغناطيسي (الشكل 5ج). 3-برمجة نانودسف التجربة إطلاق مسح أولى للكشف عن موقف وكثافة كل شعري بالضغط على زر بدء التفحص الاكتشاف في علامة التبويب المسح الضوئي اكتشاف زيادة أو إنقاص قوة الإثارة الحادث من طاقة أولية بنسبة 10% حتى ذروة كل مسح الشعرية بين وحدات 4,000-12,000 (الشكل 5د). للتأكد من العينة يتم طيها وتركز بما فيه الكفاية، ينصح لمسح أولى تذوب بتدرج درجة الحرارة شديدة انحدار. في علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي ، تجربة البرنامج تذوب المسح الضوئي بواسطة تعيين الخيار المنحدر درجة الحرارة إلى 7.0 درجة مئوية دقيقة-1، تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية و نهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية، ثم الشروع في نانودسف بالضغط بدء انصهار زر. إذا كان الناتج عن ذوبان منحنيات لا تظهر نقطة انعطاف قابلة للكشف، والنظر في تركيز العينة كذلك أو التحقق إذا كان يتم طي البروتين بشكل صحيح. كرر الخطوات من 2.1-2.4 لإعداد العينات لإجراء تجربة كاملة. في علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي ، تجربة البرنامج تذوب المسح الضوئي بواسطة تعيين الخيار المنحدر درجة الحرارة إلى 1.0 درجة مئوية دقيقة-1، تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية و نهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية، ثم الشروع في نانودسف عن طريق الضغط على زر بدء ذوبان . 4-القيام بتجربة حساب السياحة الفرعي فتح درج العينة بالضغط بثبات المسافة البادئة في الجانب الأيمن من الدرج. ضع علبة 96-جيدا في النظام RT-PCR مع A1 جيدا إلى الخلف اليسار (الشكل 4د). انقر فوق الزر تجربة جديدة للبدء في إعداد تجربة حساب السياحة الفرعي. في علامة التبويب خصائص التجربة ، انقر فوق الخيار منحنى تذوب عندما سئل ما هو نوع من التجربة هل تريد إعداد؟ والخيار الآخر عندما سئل الكواشف التي تريد استخدامها للكشف عن تسلسل الهدف؟ في إعداد لوحة/تحديد الأهداف وعينات علامة التبويب، قم بإدخال اسم هدف ثم تعيين مراسل روكس و تقضي أي. في لوحة الإعداد/تعيين الأهداف وعينات ، قم بتعيين كل من لوحة 96-جيدا جيدا باسم الهدف الذي تم إدخاله في الخطوة السابقة. في علامة التبويب نفس، تعيين تحديد الصبغة لاستخدامها بمثابة إشارة سلبية أي. في علامة التبويب أسلوب تشغيل ، حذف الخطوات حتى يكون هناك ما مجموعة ثلاثة. تعيين الخطوة الأولى إلى 25.0 درجة مئوية، منحنى معدل 100%، في الساعة 00:05؛ والخطوة الثانية إلى 95.0 درجة مئوية، منحنى معدل 1%، الساعة 01:00؛ والخطوة الثالثة إلى 95.0 درجة مئوية، منحنى معدل 100%، الوقت 00:05. اختيار لجمع البيانات باستخدام القائمة المنسدلة تجميع البيانات أو عن طريق الضغط على أيقونة جمع البيانات (الشكل 6). تعيين حجم رد فعل للبئر الواحد إلى 20 ميليلتر. اضغط على زر بدء تشغيل لبدء التجربة حساب السياحة الفرعي. 5-بيانات التحليل اختر طول موجي لرسم منحنى تذوب مع. للتجارب نانودسف، ونسبة كثافة fluorescence 330 نيوتن متر و 350 نانومتر (المقابلة التربتوفان في البيئات القطبية ونونبولار، على التوالي)13 يستخدم عادة. لمعظم الثمرة، انبعاث صبغ الحد الأقصى مناسبة لرسم منحنى تذوب (الحد الأقصى الانبعاثات سيبرو البرتقالي هو 569 نيوتن متر)12. حساب القيمm T لكل شرط بتحديد نقاط الانعطاف لكل منحنى تذوب. معظم أنظمة نانودسف تلقائياً بحساب قيمm T بالتمايز العددية من منحنيات تذوب بعد الحصول على البيانات. إذا كان البرنامج المستخدم لا تلقائياً بحساب قيمm T، البرمجيات الحرة، والبديل يحركها واجهة المستخدم الرسومية مثل نامي11 يمكن أتمتة تحليل البيانات وتجهيز المصب، إعطاء الخيار لإنتاج heatmap يلخص Tm قيم للكامل التجربة 96-جيدا (الإشارة المصاحبة توفر الموارد والتوجيه لمعالجة البيانات مع نامي). مقارنة قيمm T لجميع الشروط التي شملتها الدراسة الاستقصائية. تحتوي شاشات الاستقرار على بئرين في كل شاشة (A1 و A2) التي تحتوي على الماء فقط. أخذ قيم الماء فقط كمعيار يسمح حساب قيمm ΔT، معالجة أخطاء منهجية، والسماح بمقارنة سهلة لتحقيق الاستقرار في الآثار. أعلى قيمm T تشير إلى ظروف استقرار حرارياً الذي يوصي باستخدام المتلقين للمعلومات. غالباً ما تظهر ظروف واعدة الاعتماد على تركيز في تحقيق الاستقرار بها.

Representative Results

وكان جزيئي lysozyme مع الشاشات الاستقرار وكان جزيئي X البروتين، بروتين المستهدف في المشروع الفيروس العاشر، مع الشاشة أوسموليتي. كل البروتينات عموما أنتجت تذوب المنحنيات مع التحولات تمسخ محددة بوضوح في تجارب السياحة ونانودسف (انظر المصاحبة للأرقام للمنحنيات الممثلة). وفي بعض الحالات حيث فسرت العينات التي لا تنتج منحنيات التفسير مع فترة انتقالية محددة تمسخ ولم كالتشويه والتحريف ولم تدرج في مقارناتم تي. يبين الشكل 7 نتائج العينة من الشاشة الملح، تجسد خصائص الاستقرار حرارياً كلوريد الأمونيوم نحو ليسوزيمي. تبعيات تركيز مثل تلك المبينة أعلاه غالباً ما يدل على الظروف المبشرة بالخير، ولكن فإنه يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة النتائج لزيادة تركيز أيون مع أملاح مختلفة عدة لمعرفة إذا كان الاستقرار الحراري عموما ناشئاً عن الزيادة في القوة الأيونية المخزن المؤقت أو في حالة وجود أيونات معينة يمنح الاستقرار إضافية. وتكشف مقارنة قيمm T lysozyme مع شاشة الأس الهيدروجيني (الشكل 8) قطعتين من المعلومات. أولاً، هناك اتجاه عام لزيادة الاستقرار مع انخفاض قيم الأس الهيدروجيني. ثانيا، يمكن أن تكون قيمm مجموعة تي الحصول عليها باستخدام أنظمة مختلفة المخزن المؤقت مع قيم الأس الهيدروجيني متطابقة هامة. البيانات في الشكل 8 يشير إلى أن الاتفاق المبرم بين إدارة أمن المواصلات ونانودسف في هذه التجربة جيد عموما، ولكن نانودسف يظهر ميلا تحديد قيمm T أعلى قليلاً وأكبر قليلاً تيم تحولات من حساب السياحة الفرعي. ومع ذلك، إظهار بعض الآبار مع قيم الأس الهيدروجيني أعلاه 8.5 التفاوت الكبير بين قيمm T التي تم الحصول عليها من إدارة أمن المواصلات ونانودسف. الاختلافات المحتملة يمكن أن يعزى إلى إليه تمسخ البروتين في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة؛ على سبيل المثال، يمكن أن تعطي صبغة حساسة hydrophobicity تي منخفضة نسبيام القراءة إذا كانت مناطق مسعور من البروتين تصبح عرضه للمذيبات أسرع كثيرا من البيئة التربتوفان بقايا التغييرات في قطبية. ويبين الشكل 9 heatmap تيم القيم التي تم الحصول عليها باستخدام شاشة أوسموليتي ليسوزيمي. الشروط معم ر أعلى الزيادات مقارنة بمراقبة الآبار (آبار A1 و A2، التي تحتوي على المياه) ملونة زرقاء داكنة. تشمل خاصة استقرار الأوضاع المحددة في الشكل 9 والغليسيرول 1 م د-السوربيتول وهيبوتوريني 100 مم و 10 مم الغليسين علاء (الآبار A4 A6، A9، E7 و F8، على التوالي). يبين الشكل 10 heatmap تيم القيم التي تم الحصول عليها مع “حساب السياحة الفرعي عاشرا البروتين” وتجارب نانودسف مع الشاشة أوسموليتي تكشف عن أن أغلبية أوسموليتيس اختبار إعطاء أي زيادة طفيفة في تيم (في حدود 1 درجة مئوية) أو يكون لها تأثير ضار على استقرار “العاشر البروتين”. على وجه الخصوص، وحمض ديبيكولينيك بتركيز 10 ملم (D1 جيدا) يبدو أن تؤذي العينة في درجة حرارة الغرفة. نتائج حساب السياحة الفرعي ونانودسف بسرعة تحديد حمض ديبيكولينيك كمادة مضافة غير متوافقة ل X البروتين التي يجب تجنبها عند العمل مع البروتين. على الرغم من ذلك، تركيزات عالية من د-السوربيتول وارابينوز (الآبار A9 و B9، سواء في م 1) فضلا عن الجلسرين وتماو (الآبار A4-A6 و E1، على التوالي) اعتبرت استقرار حرارياً. ل lysozyme، تم اختبار تركيبات من الظروف التي تدر أعلى قيمm T من كل شاشة الاستقرار للتحقيق لتأثير تآزري مجتمعة. يبين الشكل 11 زيادة عامة في القيمm T أكثر مكونات نظام المخزن المؤقت يتم إضافة (درجة الحموضة والملح وأوسموليتي). في حالة العلم، وسلفات الأمونيوم ود-السوربيتول، زيادة تيم كبيرا كما 10 ° C يمكن ملاحظتها عندما تكون كافة المكونات موجودة بالمقارنة مع مس وحدها. ويبين الشكل 11 أن له تأثير ملحوظ في تآزر يمكن أن يحدث عندما المكونات الفردية للمخزن المؤقت هي الأمثل وجنبا إلى جنب مع الشاشات الاستقرار. على صعيد أكثر عمومية، يوضح الشكل 11 أيضا حجم القيمm ΔT التي يمكن ملاحظتها في حساب السياحة الفرعي ونانودسف التجارب. يختلف حجم ΔTم قابلة للتحقيق استناداً إلى حد كبير إلى نظام البروتين، ولكن أي قيمةم ΔT حولها وما فوقها 5 درجة مئوية في كثير من الأحيان يدل على أثر تحقيق الاستقرار مفيد. الشكل 1 : التنقيب البيولوجي. جمع العينات من بيئة متطرفة في “المشروع” الفيروس العاشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2: التخطيطي TSA- المثال المشروح منحنى تذوب النموذجية التي تم الحصول عليها من تجربة حساب السياحة الفرعي. هذا المنحنى من سمات تتكشف الكلاسيكية “دولتين” البروتين، حيث ينتقل السكان عينة من مطوية التشويه والتحريف دون وسيطة قابلة للاكتشاف مطوية جزئيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : الاستقرار شاشات سير العمل. سير العمل القياسية لاستخدام شاشات الاستقرار الأمثل العازلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : سير العمل على مستوى حساب السياحة الفرعي التجربة مع الشاشات الاستقرار. من اليسار إلى اليمين: (أ) مختبرين بيبيتينج من الشاشات الاستقرار في لوحة 96-جيدا. (ب) بيبيتينج عينة البروتين بصبغة الفلورسنت في اللوحة. (ج) إغلاق اللوحة قبل الطرد المركزي. (د) وضع اللوحة في نظام RT-PCR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5: سير العمل لتجربة نانودسف القياسية. (أ) فتح شعري تحميل حامل. (ب) تحميل الشعيرات الدموية في الرف. (ج) شل حركة الشعيرات الدموية مع قطاع الختم المغناطيسي. (د) تجربة البرمجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 6 : واجهة المستخدم الخاصة نظام RT-PCR. وقد تم برمجة تجربة حساب السياحة الفرعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 7 : ملح الشاشة عينة البيانات. (أ) نسبة شدة الأسفار في 350 نانومتر مقابل 330 نيوتن متر لتجربة خالية من التسمية نانودسف مع ليسوزيمي. وتتوافق مع عينات الآبار C7-C12 الشاشة الملح (1.5 م-كلوريد الأمونيوم M 0.2). تيم القيم المحسوبة لكل شرط يتم فرضه على الأرض. (ب) ملخص لقيمm T المحسوبة من البيانات المعروضة في الشكل 7ألف. (ج) الأسفار الكثافات في 590 نانومتر لتجربة حساب السياحة الفرعي باستخدام ليسوزيمي بصبغة حساسة hydrophobicity مراسل. مثل الرقم 7A، تتوافق مع العينات الآبار C7-C12 الشاشة الملح. يتم فرضه القيمm T المحسوبة على الرسم البياني. (د) موجز لقيمm T المحسوبة من البيانات الموجودة في الشكل 7ج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 8: الرقم الهيدروجيني الشاشة عينة البيانات. موجز لتحولاتم تي حصل مع lysozyme وشاشة الأس الهيدروجيني. كل نقطة تمثل شرط مستقل؛ النقاط في نفس قيمة pH نظم العازلة مختلفة على نفس درجة الحموضة. تيم تحولات تحسب بالنسبة إلى تحكم Tم 68.0 درجة مئوية لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي و 71.9 درجة مئوية للتجارب نانودسف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 9 : أوسموليتي الشاشة عينة البيانات (lysozyme)- ملخص قيمm T التي تم الحصول عليها من تجربة خالية من التسمية نانودسف مع ليسوزيمي وكل من الشاشة أوسموليتي جيدا. تتم مقارنة القيمm T (في درجة مئوية) إلى الآبار A1 و A2 التي تحتوي على المياه كعنصر تحكم. Heatmap تم إنشاؤها استناداً إلى قيمm ΔT المقارنة (الأزرق يدل زيادةم تي والأحمر انخفاضام تي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 10: أوسموليتي شاشة بيانات العينة (البروتين X)- (أ) ملخص لقيمm T التي تم الحصول عليها من تجربة نانودسف خالية من التسمية مع البروتين X والشاشة أوسموليتي. تتم مقارنة القيمm T إلى الآبار A1 و A2 التي تحتوي على المياه كعنصر تحكم. Heatmap تم إنشاؤها استناداً إلى قيمm ΔT المقارنة (الأزرق يدل زيادةم تي والأحمر انخفاضام تي). (ب) منحنيات نانودسف التي تم الحصول عليها من A9 جيدا (1 م د-السوربيتول، شرط تحقيق استقرار) ودال-1 (حمض ديبيكولينيك 10 ملم، شرط المزعزعة للاستقرار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 11 : المخزن المؤقت التأثير الأمثل في تيم. تي تسام قيم lysozyme جنبا إلى جنب مع ظروف كل الشاشة التي توفرها أكبر زيادة في تيم. واختيرت pH حامض الخليك pH 4.2 و 100 مم، 100 مم 5.6، كنظم المخزن المؤقت، جنبا إلى جنب مع سلفات الأمونيوم 1.5 متر كالملح. وكانت التركيزات أوسموليتي مماثلة لتلك الموجودة في الشاشة أوسموليتي: 10 مم علاء-الغليسين، 1 م د-السوربيتول، 50 مم L-يسين وهيبوتوريني 100 مم. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لستة replicates. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- جزيء رمز PDB التردد كريستاليسيشن المشارك الفوسفات PO4 5132 خلات قانون 4521 حمض-(N-Morpholino) 2-اثانيسولفونيك (MES) زاره التربية والعلم 1334 تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) TRS 1155 فورمات معاهدة المواد الانشطارية 1072 الجدول 1: موجز للمخزن المؤقت جزيء تبلور المشارك التردد في إدخالات مصرف بيانات البروتين (PDB). البيانات التي تم الحصول عليها من خلال بدبسوم16 من مجموع الإدخالات 144,868 (الصحيح اعتبارا من 05/12/18). معلومات تكميلية. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.  التكميلية الجدول 1- الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.  التكميلية الجدول 2- الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.  التكميلية الجدول 3- الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف. 

Discussion

وتشمل الجوانب الحاسمة ضمن البروتوكول خطوة الطرد المركزي وختم الصحيح من لوحة 96-جيدا لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي (الخطوة 1، 5). الطرد المركزي يضمن الشرط عينة والشاشة البروتين تتلامس ومزيج. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم استخدام صفيحة الغلق لتجربة حساب السياحة الفرعي، هناك خطر كبير من المذيبات التبخر طوال هذه التجربة، ويسبب زيادة في تركيز العينة وزيادة فرصة لتجميع البروتينات سابق لأوانه.

الثمرة ونانودسف قابلة لمجموعة واسعة من عينات البروتين؛ يمكن أن تنتج الغالبية العظمى من العينات منحنيات تذوب التفسير مع صبغة مراسل المستندة إلى هيدروفوبيسيتي أو عن طريق نانودسف خالية من الصبغة. إذا كانت مصادر الأسفار القياسية ليست مناسبة للبروتين، تعديل أبسط للبروتوكول التي يمكن استكشافها هو خيار fluorophore. عدة الأصباغ البديلة يمكن أن تكون مناسبة لإجراء التجارب على حساب السياحة الفرعي. تشمل الأمثلة N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)، مركب فلوريسسيس بعد التفاعل مع ثيول²⁷، و 4-(ديسيانوفينيل) جولوليديني (دكفج)، مجمع يختلف بالأسفار، على أساس تصلب بيئتها، وزيادة في الأسفار كعينة بروتين تتكشف^28،29 (صبغ هذه الأخيرة غالباً ما يتطلب تركيزات عالية من العينة).

تتوفر طرق بديلة لتحليل منحنى تذوب إذا ت_م لا يحسب تلقائياً بالبرمجيات الصك. إذا كانت بيانات متجانسة وخطوة تمسخ واحدة فقط الظاهر في المنحنيات تذوب، يمكن تركيبها مجموعة بيانات مقتطعة إلى بولتزمان سينية بالمعادلة التالية:

حيث F هي شدة الأسفار عند درجة حرارة T، و_دقيقة و_ماكس كثافات الأسفار قبل وبعد الانتقال تمسخ، على التوالي، تي_م هي درجة حرارة الوسط الانتقالية تمسخ وجيم هو المنحدر في تي_م. بينما يعمل هذا الأسلوب جيدا لعمليات تمسخ خطوتين بسيطة، غير مناسب للمنحنيات المعقدة تذوب مع التحولات متعددة.

واحدة من المزايا الرئيسية لحساب السياحة الفرعي هو إمكانية الوصول إليها؛ يمكن إجراء تجارب السياحة في أي نظام RT-PCR مع المرشحات في الأطوال الموجية المناسبة لصبغ fluorescence المستخدمة. هذا بالإضافة إلى التكلفة المنخفضة للمواد الاستهلاكية، وسهولة التشغيل وكمية منخفضة نسبيا من البروتين اللازم، جعل حساب السياحة الفرعي تقنية قيمة لمجموعة واسعة من جداول المشروع، سواء في الصناعة والأوساط الأكاديمية.

كذلك تشير إلى ظروف مواتية المخزن المؤقت، تحتوي على شاشات بعض الآبار التي قد تعطي أدلة على وجود المعادن الهيكلية داخل بروتين عينة. هي الآبار التي قد تكون ذات أهمية خاصة في الشاشة الملح G6 ومجموعة ال 7، والتي تحتوي على يدتا 5 ملم و 5 ملم عطا، على التوالي. زعزعة استقرار حراري كبير في هذه الآبار قد يكون مؤشرا من أيونات المعادن الهامة في البروتين التي يتم عزلها قبل تشيلانتس. يمكن أن توفر المركبات داخل الشاشة أوسموليتي كما يحتمل أن تكون القرائن الدالة البروتين. العديد من المركبات في الشاشة تنتمي إلى فئات من جزيء التي ركائز مشتركة للإنزيمات. على سبيل المثال، استقرار عامة يوفرها السكريات (موجودة في الآبار A11-B10) ل lysozyme يمكن أن يعزى إلى على التشابه الهيكلي لركائز ثابتة للانزيم، N-أسيتيلجلوكوساميني ليغومرات³⁰.

حساب السياحة الفرعي ونانودسف البروتوكولات المذكورة أعلاه يمكن تكييفها لدراسة تفاعلات البروتين-يجند أيضا. يمكن زيادة يغاندس التي تربط على وجه التحديد لبروتين استقرارها الحراري عن طريق إدخال التفاعلات الجديدة داخل المجمع. تحولاً إيجابيا تعتمد على الجرعة في البروتين T_m علامة واعدة التفاعل الناجح البروتين-يجند. السرعة والإنتاجية وانخفاض تكلفة فحص مكتبات مجمع مع الثمرة جعلت طريقة شعبية جداً في اكتشاف المخدرات في مرحلة مبكرة.

تحسين شروط المخزن المؤقت البروتينات المستهدفة ومجمعات يجند بها يمكن أن تكون ضرورية لنجاح المشروع، كما تدل على ذلك العديد من الأمثلة على الأدب^31،32،،من³³³⁴. مع مقايسة نموذجية أخذ تحت ح 2، بما في ذلك وقت الإعداد، تمثل الثمرة ونانودسف مقترنة بشاشات الاستقرار تقنية سريعة وغير مكلفة للمخزن المؤقت لتحسين الأداء.

Materials

Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1).