एक प्रोटोकॉल तेजी से थर्मल शिफ्ट परख और नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry के माध्यम से शर्तों की एक किस्म में प्रोटीन के थर्मल स्थिरता परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया है । बफर सिस्टम, लवण और additives, एक साथ तीन अद्वितीय स्थिरता स्क्रीन शामिल, प्रोटीन के साथ परख के लिए कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त बफ़र्स की पहचान कर रहे हैं ।
Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना २०१५ में चयनित चरम biotopes और डिस्कवर उपंयास वायरल प्रोटीन की virosphere का पता लगाने के लिए स्थापित किया गया था । इन प्रोटीन के संभावित तकनीकी मूल्य का मूल्यांकन करने के लिए, प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों का विश्लेषण इस कार्यक्रम में एक केंद्रीय चुनौती है । प्रोटीन के नमूने की स्थिरता के लिए सार्थक परख परिणाम प्रदान करने और लक्ष्यों की सघन वृद्धि आवश्यक है । थर्मल शिफ्ट परख (TSA), एक प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक, उच्च प्रवाह में प्रोटीन स्थिरता के लिए शर्तों के अनुकूलन के लिए एक लोकप्रिय विधि के रूप में स्थापित किया गया है । TSAs में कार्यरत fluorophores बाह्य हैं, पर्यावरण के प्रति संवेदनशील रंजक हैं. एक वैकल्पिक, इसी तरह की तकनीक नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry (nanoDSF) है, जो प्रोटीन देशी प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है । हम यहां एक उपंयास osmolyte स्क्रीन, जैविक additives के एक ९६ की स्थिति स्क्रीन प्रारंभिक TSA प्रयोगों के माध्यम से क्रिस्टलीकरण परीक्षण के लिए मार्गदर्शन डिजाइन प्रस्तुत करते हैं । पहले से विकसित पीएच और नमक स्क्रीन के साथ, तीन स्क्रीन के सेट बफर सिस्टम और additives की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन स्थिरता का एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है । स्क्रीन की उपयोगिता TSA और lysozyme और प्रोटीन एक्स, वायरस एक्स परियोजना के एक लक्ष्य प्रोटीन के nanoDSF विश्लेषण में प्रदर्शन किया है ।
कई प्रौद्योगिकी उपयोगी एंजाइमों वायरल स्रोतों से शुरू, जैसे कि तंबाकू खोदना वायरस (टेव)1 और मानव राइनोवायरस प्रकार 3 सी (HRV 3 सी) को छेड़ो2। Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना (चित्रा 1)3. इस कार्यक्रम का उद्देश्य (क) ज्ञात एंजाइम परिवारों के गुणों की सीमा का विस्तार करने के लिए है और (ख) अभी तक अज्ञात समारोह के उपंयास एंजाइमों की विशेषताएं (एंजाइम एक्स) । Crystallographic संरचना निर्धारण लक्ष्य प्रोटीन लक्षण वर्णन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां प्रोटीन अनुक्रम मांयता4से परे विकसित किया है । प्रोटीन स्थिरता क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कारक है; नमूने समरूप और संरचनात्मक रूप से उच्च गुणवत्ता, diffracting क्रिस्टल बनाने के लिए समय की एक अवधि से अधिक ध्वनि होना चाहिए । इसके अलावा, यह गतिविधि परख के लिए आवश्यक है कि प्रोटीन उनके सक्रिय रूप में मौजूद है, जो भी एक अनुकूल आणविक वातावरण की सुविधा हो सकती है ।
crystallographers के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकी के विकास के बावजूद, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण एक समय लेने वाली और श्रम गहन अनुभवजंय प्रक्रिया5रहता है । प्रारंभिक भौतिक प्रयोगों में प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक बेहतर प्रारंभिक बिंदु दे और आमतौर पर केवल प्रोटीन नमूना6,7की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि का उपभोग, 8,9. लक्ष्य प्रोटीन की बड़ी संख्या में इस परियोजना में अध्ययन किया जा करने के लिए भी आवश्यक स्केलेबल, उच्च प्रवाह स्थिरता परख । एक पूर्व के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक-क्रिस्टलीकरण प्रोटीन के भौतिक लक्षण वर्णन थर्मल शिफ्ट परख (भी TSA या अंतर स्कैनिंग fluorimetry, DSF)10,11के रूप में जाना जाता है ।
TSAs एक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई को रोजगार के लिए प्रोटीन के नमूनों की थर्मल विकार ट्रैक । कई सामांयतः-रंजक इस्तेमाल अपने पर्यावरण के ध्रुवीकरण के आधार पर चर प्रतिदीप्ति गतिविधि है, अक्सर hydrophobic वातावरण में एक उच्च प्रतिदीप्ति उत्पादन प्रदर्शित लेकिन ध्रुवीय वातावरण12में तेजी से शमन के दौर से गुजर । प्रोटीन आमतौर पर डाई प्रतिदीप्ति में स्पष्ट वृद्धि के कारण के रूप में उनके hydrophobic कोर विकार के दौरान उजागर हो, अक्सर बहुत उच्च तापमान पर डाई प्रतिदीप्ति में कमी के बाद प्रोटीन के रूप में कुल शुरू (चित्रा 2) ।
जबकि एक hydrophobicity-संवेदनशील डाई अक्सर एक सामांय उपयोग TSA डाई के लिए एक अच्छा विकल्प है, यह बड़े, विलायक उजागर hydrophobic क्षेत्रों, जो अक्सर हानिकारक उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शन के साथ प्रोटीन के लिए अनुपयुक्त हो सकता है । कार्रवाई के वैकल्पिक साधनों के साथ Fluorophores मौजूद (चर्चा देखें), लेकिन यह बजाय nanoDSF के साथ आंतरिक प्रोटीन प्रतिदीप्ति के माध्यम से विकार ट्रैक वांछनीय हो सकता है ।
Tryptophan अवशेषों कि ३३० एनएम के एक उत्सर्जन अधिकतम के साथ एक प्रोटीन fluoresce के ध्रुवीय क्षेत्रों में दफन कर रहे हैं । एक प्रोटीन नमूने के रूप में करेंगी और इन अवशेषों एक ध्रुवीय विलायक को उजागर हो, उनके उत्सर्जन अधिकतम ३५० एनएम13के लिए एक bathochromic बदलाव से गुजरना । nanoDSF बाह्य fluorophores14के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रोटीन नमूने का खुलासा जांच करने के लिए उत्सर्जन अधिकतम में इस बदलाव का दोहन ।
पिघल एक विकार कदम दिखा घटता एक बोल्ट्जमान sigmoidal मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । खुलासा संक्रमण के मोड़ बिंदु पर तापमान (टीएम) प्रोटीन थर्मल स्थिरता और एक बेंचमार्क के एक मात्रात्मक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है विभिंन स्थितियों के पक्ष की तुलना ।
पिघला विभिंन स्थितियों में एक ही प्रोटीन के curves विविधता है कि एक बोल्ट्जमान sigmoidal फिटिंग व्यवहार्य बना सकते है की एक डिग्री के अधिकारी कभी नहीं । डेटा से टीएम मूल्यों विचार है कि क्लासिक वक्र टोपोलॉजी से भटक, संख्यात्मक तरीके ऐसे नामि, एक खुला स्रोत TSA डेटा विश्लेषण कार्यक्रम11में कार्यरत लोगों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक ऊष्मा चौखटे भी ऐसे ProteoPlex15पद्धति के रूप में कई विकार कदम, के साथ और अधिक जटिल curves का विश्लेषण किया जा सकता है ।
स्थिरता स्क्रीन TSA और nanoDSF प्रयोगों में उपयोग के लिए तेजी से एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल परिस्थितियों की पहचान करने के लिए डिजाइन किए गए थे (चित्रा 3, स्क्रीन रचनाओं पूरक जानकारी में उपलब्ध हैं) । जानकारी स्क्रीन के साथ इकट्ठा crystallographic पाइपलाइन के कई चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है सहित: नमूना भंडारण; शुद्धिकरण, प्रोटीन शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान खुलासा करने के माध्यम से उपज हानि को कम; परख डिजाइन, थर्मल स्थिर बफ़र्स और अंत में क्रिस्टलीकरण के साथ गतिविधि परख में प्रोटीन कार्यक्षमता मजबूत, तर्कसंगत डिजाइन क्रिस्टलीकरण परीक्षण मार्गदर्शक ।
एक प्रोटीन नमूने के लिए एक उपयुक्त बफर सिस्टम के आधार का चयन महत्वपूर्ण है; असंगत पीएच मान एक प्रोटीन की निष्क्रियता या विकार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, सह के एक बड़ी संख्या में हल-सघन बफर अणुओं की उपस्थिति एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं (तालिका 1) भी एक स्थिर प्रभाव है कि सरल पीएच विनियमन के लिए अलग है और इसके बजाय रासायनिक से उपजी का संकेत हो सकता है बफर अणु की विशेषताएँ.
अंय सामांयतः जैविक रूप से संगत बफर सिस्टम के साथ है गुड buffers17,18,19 के कई का उपयोग कर तैयार की, पीएच स्क्रीन पर एक बफर अणु के रासायनिक प्रभाव deconvolute के लिए डिज़ाइन किया गया है परिणामस्वरूप समाधान के वास्तविक पीएच से प्रोटीन स्थिरता । प्रत्येक बफर सिस्टम के लिए तीन पीएच मूल्यों को उपलब्ध कराने और विभिंन प्रणालियों के बीच पीएच मूल्य अतिरेक को शामिल करके, पीएच स्क्रीन दोनों अनुकूल पीएच मूल्यों और एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल बफर सिस्टम की पहचान कर सकते हैं ।
नमक स्क्रीन आमतौर पर प्रयोगशाला लवण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से chaotropes, chelants, भारी धातुओं और एजेंटों को कम होता है । स्क्रीन उच्च ईओण ताकत के साथ वातावरण के लिए एक प्रोटीन नमूना के संबध के एक सामांय संकेत दे सकते हैं, लेकिन यौगिकों के प्रत्येक उपसमूह भी एक प्रोटीन की क्षमता संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक chelant काफी एक प्रोटीन स्थिर नमूना के भीतर महत्वपूर्ण संरचनात्मक धातुओं का संकेत हो सकता है । नमूना भी दृढ़ता से स्क्रीन के भीतर एक धातु कटियन द्वारा स्थिर है, तो यह आगे संरचनात्मक प्रयोगों के लिए एक आशाजनक प्रारंभिक बिंदु प्रदान कर सकते हैं ।
Osmolytes घुलनशील यौगिकों कि उनके पर्यावरण के आसमाटिक गुणों को प्रभावित कर रहे हैं । प्रकृति में, वे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है “रासायनिक chaperones”, परिक्रमा प्रोटीन की तह लागू करने और उन्हें स्थिर, विशेष रूप से तनाव की स्थिति में20,21,22. ये विशेषताएँ उन्हें प्रोटीन क्रि में आकर्षक additives बनाते हैं; क्रिस्टल संचयन के दौरान cryoprotectants के रूप में प्रयोग करने योग्य, बढ़ते और भंडारण23प्रक्रियाओं । Osmolytes ‘ संभावित उपयोग भी प्रोटीन की शुद्धि के लिए फैली हुई है. रिकॉमबिनेंट ई. कोलाई में व्यक्त प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अनुपात अघुलनशील और देशी राज्य में ठीक करने के लिए मुश्किल मानक शोधन विधियों का उपयोग कर सकते हैं । Osmolytes को स्थिर और अघुलनशील भिन्नताओं से प्रोटीन को उबारने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्धीकरण पैदावार में वृद्धि24.
osmolyte स्क्रीन प्रोटीन डेटा बैंक प्रविष्टियों में वर्तमान स्थापित यौगिकों का उपयोग कर डिजाइन किया गया था25 और Osmoprotection के ड्रैगन एक्सप्लोरर-जुड़े रास्ते (DEOP)26 डाटाबेस और iteratively मानक प्रोटीन का उपयोग कर अनुकूलित । स्क्रीन osmolyte के आठ उपवर्गों के आसपास बनाया गया है: ग्लिसरॉल, शर्करा और polyols, गैर-डिटर्जेंट sulfobetaines (NDSBs), betaines और उनके एनालॉग, organophosphates, dipeptides, अमीनो एसिड और उनके डेरिवेटिव और एक अंतिम विविध समूह । प्रत्येक osmolyte तुलना के लिए अपनी घुलनशीलता और प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला के आधार पर कई सांद्रता में मौजूद है ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल है केंद्रापसारक कदम और ९६ के उचित सील-TSA प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से थाली (१.५ कदम) । केंद्रापसारक सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन का नमूना और स्क्रीन हालत संपर्क और मिश्रण में आते हैं । इसके अतिरिक्त, एक सील प्लेट एक TSA प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है, तो प्रयोग भर में विलायक वाष्पीकरण का एक महत्वपूर्ण जोखिम है, नमूना एकाग्रता में वृद्धि के कारण और समय से पहले प्रोटीन एकत्रीकरण की संभावना बढ़ रही है ।
TSAs और nanoDSF प्रोटीन नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी हैं; नमूनों की विशाल बहुमत एक hydrophobicity आधारित रिपोर्टर डाई के साथ या डाई मुक्त nanoDSF के माध्यम से व्याख्यात्मक पिघल घटता उत्पादन कर सकते हैं. यदि मानक प्रतिदीप्ति सूत्रों अपने प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हैं, प्रोटोकॉल है कि पता लगाया जा सकता है के लिए सरलतम संशोधन fluorophore की पसंद है । कई वैकल्पिक रंजक TSA प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है । उदाहरणों में शामिल है N-[4-(7-diethylamino-4-मिथाइल-3-coumarinyl) फिनाइल] maleimide (सीपीएम), एक यौगिक है कि एक fluoresces27के साथ प्रतिक्रिया करने के बाद thiol, और 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), एक यौगिक है कि अपने प्रतिदीप्ति के आधार पर बदलता है अपने पर्यावरण की कठोरता, एक प्रोटीन नमूने के रूप में अपनी प्रतिदीप्ति में वृद्धि28,29 (उत्तरार्द्ध डाई अक्सर नमूना के उच्च सांद्रता की आवश्यकता है) करेंगी ।
पिघल वक्र विश्लेषण के वैकल्पिक तरीकों उपलब्ध है अगर टीएम स्वचालित रूप से साधन सॉफ्टवेयर द्वारा गणना नहीं है । यदि डेटा समरूप है और केवल एक विकार चरण में पिघल curves स्पष्ट है, तो एक छोटा dataset बोल्ट्जमान अवग्रह के साथ निंन समीकरण के लिए फ़िट किया जा सकता:
जहां च तापमान टी, एफमिनट और एफमैक्स पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है प्रतिदीप्ति तनाव से पहले और बाद विकार संक्रमण, क्रमशः, टीएम विकार संक्रमण और सी के मध्यबिंदु तापमान है टीएमपर ढलान है । हालांकि इस विधि सरल दो कदम विकार प्रक्रियाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह कई संक्रमण के साथ जटिल पिघल curves के लिए अनुपयुक्त है ।
TSA के प्रमुख लाभों में से एक इसकी पहुंच है; TSA प्रयोगों प्रतिदीप्ति डाई कार्यरत के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर फिल्टर के साथ किसी भी आरटी-पीसीआर प्रणाली में किया जा सकता है । यह उपभोग्य सामग्रियों की कम लागत के साथ युग्मित, ऑपरेशन की आसानी और प्रोटीन की जरूरत अपेक्षाकृत कम राशि, TSA परियोजना तराजू की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मूल्यवान तकनीक बनाने, दोनों उद्योग और शिक्षा में ।
के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुकूल बफर शर्तों का संकेत है, स्क्रीन कुछ कुओं कि एक नमूना प्रोटीन के भीतर संरचनात्मक धातुओं की उपस्थिति के लिए सुराग दे सकता है होते हैं । कुओं कि नमक स्क्रीन में विशेष रुचि के हो सकता है G6 और G7, जो क्रमशः 5 मिमी EDTA और 5 मिमी EGTA होते हैं । महत्वपूर्ण इन कुओं में थर्मल स्थिरीकरण प्रोटीन है कि chelants द्वारा तनहा है में महत्वपूर्ण धातु आयनों का संकेत हो सकता है । osmolyte स्क्रीन के भीतर यौगिकों भी संभावित एक प्रोटीन के समारोह के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं । स्क्रीन में यौगिकों के कई अणु की कक्षाएं है कि एंजाइमों की आम सब्सट्रेट कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सामांय स्थिरीकरण saccharides द्वारा afforded (वेल्स A11-B10 में मौजूद) lysozyme के लिए उनके संरचनात्मक समानता एंजाइम की स्थापित सब्सट्रेट करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, N-acetylglucosamine oligomers30।
TSA और nanoDSF प्रोटोकॉल ऊपर उल्लिखित भी प्रोटीन ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लाइगैंडों कि विशेष रूप से एक प्रोटीन को बांध परिसर के भीतर नई बातचीत शुरू करने से अपने थर्मल स्थिरता में वृद्धि कर सकते हैं । प्रोटीन टीएम में एक खुराक पर निर्भर सकारात्मक बदलाव एक सफल प्रोटीन-ligand बातचीत का एक आशाजनक संकेत है । गति, प्रवाह और TSAs के साथ यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के कम लागत यह प्रारंभिक चरण दवा खोज में एक बहुत लोकप्रिय तरीका बना दिया है ।
लक्ष्य प्रोटीन और उनके ligand परिसरों के बफर शर्तों के अनुकूलन एक परियोजना की सफलता के लिए आवश्यक हो सकता है, के रूप में कई साहित्य उदाहरण31,३२,३३,३४का प्रदर्शन । एक ठेठ सेटअप समय, TSAs और स्थिरता स्क्रीन के साथ मिलकर nanoDSF सहित 2 एच के तहत ले परख के साथ बफर अनुकूलन के लिए एक तेजी से, सस्ती तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान करार n ° ६८५७७८) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है. यह काम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (BBSRC, अनुदान संख्या बी ओ/M011186/1, bb/J014516/ DB धंयवाद BBSRC डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी न्यूकैसल-लिवरपूल-डरहम के लिए एक छात्र और डरहम विश्वविद्यालय के वित्त पोषण की ओर योगदान के लिए इस काम के लिए विज्ञान विभाग । हम उनकी मदद के लिए इयान एडवर्ड्स और रसायन विज्ञान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विभाग के डरहम विश्वविद्यालय के विभाग उनके वाद्य प्रोटीन एक्स के विश्लेषण के लिए धंयवाद । हम वायरस के साथ अपने काम के लिए Arnthor Ævarsson के लिए आभारी है एक्स परियोजना, और धंयवाद भी क्लेयर Hatty और NanoTemper GmbH को ऋण देने के लिए और इस परियोजना के लिए प्रोमेथियस NT. 48 प्रणाली के साथ सहायता । अंत में, आप BBSRC iCASE पुरस्कार के भाग के रूप में उनके समर्थन के लिए फ्रांसिस Gawthrop और Tozer बीज के लिए धंयवाद ।
Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |