Ett protokoll presenteras för att snabbt testa den termiska stabiliteten av proteiner i en mängd olika förhållanden genom termisk Skift analyser och nano differential scanning fluorimetry. Buffertsystem, salter och tillsatser, grupp är bestående av tre unika stabilitet skärmar, analyseras med proteiner för att identifiera lämpliga buffertar för funktionella och strukturella studier.
Horisont 2020 Virus-X projektet etablerades 2015 för att utforska virosphere valda extrema biotoper och upptäck nya virala proteiner. För att utvärdera potentiella bioteknisk värdet av dessa proteiner, analys av protein är strukturer och funktioner en central utmaning i detta program. Stabiliteten i protein prov är nödvändigt att ge meningsfull analys resultat och öka crystallizability målen. Termiska Skift analysen (TSA), en fluorescens-baserad teknik, är etablerad som en populär metod för att optimera förutsättningarna för protein stabilitet i hög genomströmning. I TSA är de anställda fluorophores extrinsic, miljövänliga färger. Ett alternativ, liknande teknik är nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), som bygger på protein infödda fluorescens. Vi presenterar här en roman osmolyte skärm, en 96-skick skärmen av organiska tillsatser avsedda att vägleda kristallisering prövningar genom preliminära TSA experiment. Tillsammans med tidigare utvecklade pH och salt skärmar ger uppsättningen tre skärmar en omfattande analys av protein stabilitet i ett brett utbud av buffertsystem och tillsatser. Nyttan av skärmarna demonstreras i TSA och nanoDSF analys av lysozym och Protein X, ett målprotein för Virus-X projektet.
Många biotechnologically-användbara enzymer har viral källor, såsom tobaken etch virus (TEV) proteas1 och humant rhinovirus typ 3 C (HRV 3 C) proteas2. Horisont 2020 Virus-X projektet (figur 1)3. Syftet med detta program är (a) att utöka utbudet av egenskaperna för kända enzym familjer och (b) att karakterisera roman enzymer av ännu okänd funktion (enzym X). Kristallografiska strukturbestämning spelar en nyckelroll i mål protein karakterisering, särskilt i de fall där proteinsekvenser har utvecklats bortom erkännande4. Protein stabilitet är en nyckelfaktor i kristallisation; prover måste vara conformationally homogen och strukturellt ljud under en viss tidsperiod till formuläret i högkvalitativt, diffracting kristaller. Det är dessutom viktigt för aktivitet analyser som proteinerna som finns i deras aktiv konformation, som också kan underlättas genom en gynnsam molekylär miljö.
Trots utvecklingen i tekniken som finns för kristallografer förblir protein kristallisering en tidskrävande och arbetsintensiva empiriska processen5. Preliminära biofysiska experiment för att förbättra protein stabilitet i lösning ger helt klart en bättre utgångspunkt för protein kristallisation och konsumerar oftast endast en jämförelsevis liten mängd protein prov6,7, 8,9. Det stora antalet målproteiner studeras i detta projekt kräver också skalbar, hög genomströmning stabilitet analyser. En av de mest populära metoderna för pre kristallisering biofysiska karaktärisering av proteinerna är termisk Skift analysen (även känd som TSA eller differential scanning fluorimetry, DSF)10,11.
TSA anställa en miljövänliga fluorescerande färgämne att spåra den termiska denaturering av protein prover. Många vanliga färgämnen har variabel fluorescens aktivitet beroende på polariteten av sin miljö, ofta visar en hög fluorescence utgång i hydrofoba miljöer men som genomgår snabb kylning i polara miljöer12. Proteiner orsakar allmänt uttalad ökar i dye fluorescens som sina hydrofoba kärnor blir utsatta under denaturering, ofta följt av en minskning av färgämne fluorescens vid mycket höga temperaturer som proteiner börjar aggregat (figur 2).
Medan ett vattenavvisande egenskaper-känsliga färgämne är ofta ett bra val för ett allmänt använda TSA färgämne, kan det vara olämpliga för proteiner med stora, lösningsmedel-exponerade hydrofoba regioner, som ofta visar negativt hög bakgrund fluorescens. Fluorophores med alternativa verkningsmekanismer finns (se diskussion), men det kan istället vara önskvärt att spåra denaturering genom inneboende protein fluorescens med nanoDSF.
Tryptofan-rester som är begravda i nonpolar regioner i ett protein fluorescerar med ett utsläpp på högst 330 nm. Som ett protein prov utspelar sig och dessa rester blir utsatt för en polära lösningsmedel, genomgår deras maximala utsläpp en bathochromic övergång till 350 nm13. nanoDSF utnyttjar detta skifte i utsläpp maximal sond unfoldingen av ett protein prov utan behov av yttre fluorophores14.
Smälta kurvor visar enda denaturering steg kan analyseras genom att montera data till en Boltzmann sigmoidal modell. Temperaturen vid en brytpunkt för den pågående övergången (Tm) används som ett kvantitativt mått av protein termisk stabilitet och ett riktmärke för att jämföra favorability av olika villkor.
Smälta kurvor av samma protein i olika förhållanden äg ibland en grad av heterogenitet som kan göra en Boltzmann sigmoidal passande ogenomförbara. För att urskilja Tm värden från data som avviker från den klassiska kurva topologin, kan numeriska metoder användas som sysselsatta i NAMI, en öppen källkod TSA data analys program11. Alternativa termodynamiska ramar kan också användas för att analysera mer komplexa kurvor med flera denaturering steg, till exempel de ProteoPlex metodik15.
Stabilitet skärmarna har utformats för användning i TSA och nanoDSF experiment att snabbt identifiera goda förutsättningar för ett målprotein (figur 3, skärmen kompositioner finns kompletterande uppgifter i). Information som samlats in med skärmar kan användas i många skeden av kristallografiska pipeline, inklusive: prova lagring; rening, minimera avkastning förlust genom protein som utspelas under reningsprocessen; assay design, förstärka protein funktionalitet i aktivitet analyser med termiskt stabilisera buffertar och slutligen kristallisering, vägledande rationellt-designade kristallisering prövningar.
Att välja en lämplig buffert system grunden för ett protein prov är avgörande; inkompatibla pH-värden kan leda till inaktivering eller denaturering av ett protein. Förekomsten av samtidig kristalliserad buffert molekyler löst i ett stort antal röntgen kristallen strukturerar (tabell 1) kunde dock också vara vägledande för en stabiliserande effekt som är separat enkel pH-reglering och i stället härstammar från kemiskt funktioner av buffert molekylen.
Formulerad med flera av Goods buffertar17,18,19 tillsammans med andra vanligen biologiskt-kompatibel buffertsystem, är pH skärmen utformad för att deconvolute kemiska effekten av en buffert molekyl på protein stabilitet faktiska pH-värdet i den resulterande lösningen. Genom att erbjuda tre pH-värden för varje buffertsystem och införliva pH värde redundans mellan olika system, kan skärmen pH identifiera både goda pH-värden och gynnsamma buffertsystem för ett målprotein.
Salt skärmen innehåller vanligen laboratorium salter samt chaotropes, chelants, tungmetaller och reduktionsmedel. Skärmen kan ge en allmän indikation på ett protein prov affinitet till miljöer med höga Joniska styrkor, men varje undergrupp av föreningar kan också ge information om potentiella strukturen av ett protein. Exempelvis kan en chelant som avsevärt destabiliserande ett protein vara vägledande viktiga strukturella metaller inom provet. Om provet är också starkt stabiliseras av en metall cation inom skärmen, kan detta ge en lovande utgångspunkt för ytterligare strukturella experiment.
Osmolytes är lösliga föreningar som påverkar egenskaperna osmotisk i deras miljö. I naturen, kan de användas som ”kemiska chaperones”, att genomdriva den vikningen av oordnade proteiner och stabilisera dem, särskilt i stress villkor20,21,22. Dessa egenskaper gör dem attraktiva tillsatser i röntgenkristallografi; kan användas som cryoprotectants under crystal skörd, montering och förvaring processer23. Osmolytes’ potentiella användning omfattar även rening av proteiner. En betydande andel av rekombinanta proteiner som uttrycks i E. coli kan vara olösliga och svårt att återställa i native tillstånd att använda standard reningsmetoder. Osmolytes kan användas för att stabilisera och rädda proteiner från olösliga fraktioner, ökande rening avkastningen24.
Skärmen osmolyte utformades med hjälp av etablerade föreningar som finns i Protein Data Bank poster25 och Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vägar (DEOP)26 databasen och optimerad iterativt använder standard proteiner. Skärmen är byggd omkring åtta underklasser till osmolyte: glycerol, sockerarter och polyoler, icke-tvättmedel sulfobetaines (NDSBs), betaines och deras analoger, organiska fosforföreningar, dipeptider, aminosyror och deras derivat och en slutlig Diverse grupp. Varje osmolyte är närvarande i flera koncentrationer baserad på dess löslighet och effektiv koncentration spänner för jämförelse.
Kritiska aspekter inom protokollet omfatta centrifugeringssteget och ordentlig tätning av plattan med 96 brunnar för TSA experiment (steg 1,5). Centrifugering säkerställer att villkoret protein prov och skärmen kommer i kontakt och blanda. Dessutom, om en oförseglade plattan används för ett TSA experiment, finns det en betydande risk för lösningsmedel avdunstar hela experimentet, orsakar en ökning i provets koncentration och ökar risken för prematur protein aggregering.
TSA och nanoDSF kan bli föremål för ett brett utbud av protein prover; den stora majoriteten av prover kan producera tolkningsbara smälta kurvor med en vattenavvisande egenskaper-baserade reporter färgämne eller genom dye-fri nanoDSF. Om standard fluorescens källor inte är lämplig för ditt protein, är enklaste ändring till det protokoll som kunde utforskas valet av fluorophore. Flera alternativa färgämnen kan vara lämplig för TSA experiment. Exempel är N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), en förening som fluorescerar i efter reagerar med en tiol274-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), en förening som varierar dess fluorescens baserat på den stelhet i dess miljö, öka dess fluorescens som protein prov utspelar sig28,29 (senare färgen ofta kräver höga koncentrationer av provet).
Alternativa analysmetoder smälta kurvan är tillgängliga om Tm inte beräknas automatiskt av programvaran instrument. Om data är homogen och endast en denaturering steg framgår i smälta kurvorna, kan en stympad datamängd monteras på en Boltzmann sigmoideum med följande ekvation:
Där F är fluorescensintensiteten vid temperaturen T, Fmin och Fmax är fluorescens stödnivåerna före och efter denaturering övergången, respektive, Tm är mittpunkten temperaturen i denaturering övergång och C är lutningen på Tm. Även denna metod fungerar bra för enkla two-step denaturering processer, är det olämpligt för komplexa smälta kurvor med flera övergångar.
En av de stora fördelarna med TSA är dess tillgänglighet. TSA experiment kan utföras i alla RT-PCR-system med filter lämpliga våglängder för fluorescens färgämnet anställd. Detta i kombination med den låga kostnaden för förbrukningsvaror, enkel drift och relativt låg mängd protein som behövs, göra TSA en värdefull teknik för en lång rad projekt skalor, både inom industrin och akademin.
Förutom som visar gynnsamma buffert villkor, innehåller skärmarna några brunnar som kan ge ledtrådar till förekomsten av strukturella metaller inom ett prov protein. Brunnar som kan vara av särskilt intresse i salt skärmen är G6 och G7, som innehåller 5 mM EDTA och 5 mM EGTA, respektive. Betydande termisk destabilisering i dessa brunnar kan vara vägledande för viktiga metalljoner i proteinet som är binds av chelants. Föreningar inom osmolyte skärmen kan också potentiellt ge ledtrådar till funktionen av ett protein. Många av föreningarna i skärmen tillhör klasser av molekylen som är gemensamma substrat för enzymerna. Till exempel kunde allmänna stabiliseringen av sackarider (närvarande i brunnar A11-B10) för lysozym hänföras till deras strukturella likheten till etablerade substrat av enzymet, N-acetylglukosamin oligomerer30.
Protokollen TSA och nanoDSF som beskrivs ovan kan också anpassas till studera protein-ligand interaktioner. Ligander som binder specifikt till ett protein kan öka dess termiska stabilitet genom att införa nya interaktioner inom komplexet. En dosberoende positiv förskjutning i protein Tm är ett lovande tecken på en lyckad protein-ligand interaktion. Hastighet, genomströmning och låga kostnader för screening sammansatta bibliotek med TSA har gjort det till en mycket populär metod i tidig läkemedelsutveckling.
Optimera buffert villkoren för målproteiner och sin ligand komplex kan vara avgörande för ett projekts framgång, som många litteratur exempel visar31,32,33,34. Med en typisk analys tar under 2 h inklusive ställtid, representerar TSA och nanoDSF tillsammans med stabilitet skärmar en snabb, billig teknik för buffert optimeringar.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation (grant avtalet n ° 685778). Detta arbete stöddes av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC, grant antalet BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB tack den BBSRC forskarnivå utbildning partnerskap Newcastle-Liverpool-Durham för en STUDENTTILLVARO och Durham University Institutionen för biovetenskaper bidra mot den finansiering som detta arbete. Vi tackar Ian Edwards för hans hjälp och Durham University Institutionen för kemi Mass Spectrometry avdelningen för deras instrumentell analys av Protein X. Vi är tacksamma mot Arnthor Ævarsson för sitt arbete med Virus-X projekt och tack även till Claire Hatty och NanoTemper GmbH för utlåning och bistå med Prometheus NT.48 systemet för detta projekt. Slutligen, tack till Frances Gawthrop och Tozer Seeds för deras stöd som en del av BBSRC iCASE award.
Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |