Bir iletişim kuralı hızla termal kayması deneyleri ve nano fluorimetry tarama fark koşulları çeşitli proteinler termal kararlılığını sınamak için sunulmaktadır. Tampon sistemleri, tuzları ve katkı maddeleri, birlikte üç benzersiz istikrar ekran, oluşan uygun işlevsel ve yapısal çalışmalar arabelleklerini tanımlamak için protein ile denetlesinler.
Horizon2020 virüs-X Projesi seçilen aşırı Habitat virosphere keşfetmek ve yeni viral proteinler keşfetmek için 2015 yılında kurulmuştur. Bu proteinler, protein analizi potansiyel biyoteknik değerini değerlendirmek için yapıları ve işlevleri olan bu programda merkezi bir meydan okuma. Protein örnek kararlılığını hedeflerinden crystallizability artırmak ve anlamlı tahlil sonuçları sağlamak için önemlidir. Termal üst karakter tahlil (TSA), bir floresan tabanlı teknik koşullar protein istikrar içinde yüksek üretilen iş için en iyi duruma getirme için popüler bir yöntem olarak kurulur. TSAs, meslek fluorophores dışsal, çevreye duyarlı boyalar vardır. Alternatif, nano protein yerli floresans dayanır fluorimetry (nanoDSF), tarama fark benzer tekniğidir. Burada bir roman osmolyte ekran, organik katkı kristalizasyon denemeler ön TSA deneyler yoluyla rehberlik için tasarlanmış bir 96-koşul ekran mevcut. Daha önce geliştirilen pH ve tuz ekranlar ile birlikte üç ekran dizi protein istikrar tampon sistemleri ve katkı maddeleri geniş bir alanda kapsamlı bir çözümleme sağlar. Belgili tanımlık yarar ekranlar lizozim ve Protein X, virüs-X projenin hedef protein TSA ve nanoDSF analizinde gösterilmiştir.
Birçok biotechnologically yararlı enzimler viral kaynaklardan gibi tütün etch virüs (TEV) proteaz1 ve insan rhinovirus 3 C (HRV 3 C) proteaz2yazın kaynağı. Horizon2020 virüs-X (Şekil 1) projesi3. Bu program (a) bilinen enzim aileler özelliklerini aralığı genişletmek için ve (b) henüz bilinmeyen işlev (enzim X) roman enzimler karakterize etmek için amaçtır. Crystallographic yapı belirlenmesi hedef protein karakterizasyonu, çok önemli bir rol özellikle protein sequences tanıma4nerede geliştiğini bu durumlarda çalış. Protein istikrar kristalizasyon sürecinde önemli bir faktördür; örnekleri formu yüksek-nitelik, kristaller diffracting için bir süre doğurmak homojen ve yapısal olarak sağlam olması gerekir. Ayrıca, bu da olumlu bir moleküler ortamı tarafından kolaylaştırılabilir aktif onların biçimsel proteinler mevcut aktivitesi deneyleri için esastır.
Crystallographers için mevcut teknoloji geliştirmede rağmen protein kristalizasyon zaman alıcı ve emek yoğun ampirik işlemi5kalır. Ön biyofiziksel deneyler protein istikrar çözüm geliştirmek için açıkça daha iyi başlangıç noktası protein kristalizasyon için vermek ve genellikle nispeten az miktarda protein örnek6,7tüketmek, 8,9. Bu projede belirlenmesi için hedef proteinler çok sayıda da ölçeklenebilir, yüksek üretilen iş istikrar deneyleri gerektirir. Proteinler öncesi kristalizasyon biyofiziksel karakterizasyonu için en popüler yöntemlerden biri termal üst karakter tahlil (TSA veya diferansiyel fluorimetry, DSF tarama olarak da bilinir)10,11.
TSAs protein örneklerinin termal denatürasyon izlemek için bir çevreye duyarlı floresan boya istihdam. Birçok yaygın olarak kullanılan boyalar değişken floresans etkinliğe bağlı olarak sık sık hidrofobik ortamlarda yüksek floresans çıktısını görüntüleme ama hızlı kutup ortamları12‘ Şoklama geçiren çevrenin polarite sahip. Hidrofobik onların göbek denatürasyon, proteinler (Şekil 2) toplamak için Başlarken genellikle boya floresans çok yüksek sıcaklıklarda düşüş takip sırasında maruz olur gibi proteinler belirgin artışlar boya floresans genellikle neden.
Bir hydrophobicity duyarlı boya kez bir genel kullanımlı TSA boya için iyi bir seçim olsa da, proteinler ile çoğunlukla yapmayacaktır yüksek arka plan floresans görüntüler büyük, solvent maruz hidrofobik bölgeler için uygun olabilir. Eylem alternatif modları ile fluorophores (konuya bakın) vardır, ancak bunun yerine denatürasyon içsel protein floresan nanoDSF ile üzerinden izlemek için arzu olabilir.
Bir protein, nonpolar bölgelerinde gömülü olan triptofan artıkları belli bir emisyon en fazla 330 ile nm. Protein örnek yaşanıyor ve bu polar bir çözücü maruz olur gibi kendi emisyon en fazla 350 nm13bathochromic shift uğrar. nanoDSF emisyon bir protein örnek dışsal fluorophores14gerek kalmadan unfolding soruşturma için en fazla bu vardiyada patlatır.
Gösteren tek denatürasyon adımları-ebilmek var olmak çözümlemek veri Boltzmann sigmoidal modeline yaklaştırarak eğrileri eritebilir. Açılım geçiş (Tm) dönüm noktası sıcaklığında niceliksel ölçüsüdür protein termal kararlılık ve bir kriter farklı koşullar favorability karşılaştırmak için kullanılınır.
Erime eğrileri farklı koşullarda aynı proteinin bazen sigmoidal uygun bir Boltzmann olanaksız yapabilirsiniz heterojenite derecesine sahip. Klasik eğrisi çoğaltmasından sapma veri Tm değerleri ayırt etmek, sayısal yöntemler namı, bir açık kaynak TSA veri analiz programı11çalışan gibi kullanılabilir. Alternatif termodinamik çerçeveler de ProteoPlex metodoloji15gibi birden çok denatürasyon adımlarla daha karmaşık eğriler analiz etmek için kullanılabilir.
İstikrar ekranlar TSA ve nanoDSF deneylerde kullanmak için hızla bir hedef protein için uygun koşulları tanımlamak için tasarlanmıştır (Şekil 3, ekran besteleri vardır ek bilgi kullanılabilir). Ekranları ile toplanan bilgi-ebilmek var olmak kullanılmış crystallographic boru hattı da dahil olmak üzere birçok aşamalarında: örnek depolama; Arıtma, arıtma işlemi sırasında unfolding protein ile verim kaybını en aza; Tasarım, termal arabellekleri ve nihayet mantıklı bir şekilde tasarlanmış kristalizasyon denemeler rehberlik kristalizasyon, sabitleme ile faaliyet deneyleri işlevindeki protein takviye tahlil.
Protein örnek için uygun arabellek sistem temel seçimi çok önemlidir; uyumsuz pH değerlerini devre dışı bırakma veya bir proteini denatürasyon yol açabilir. Ancak, çok sayıda X-ray kristal yapıları (Tablo 1) çözüldü Co kristalize arabellek molekülleri varlığını da göstergesi teskin etkisinin, basit pH yönetmeliğine ayrıdır ve bunun yerine kimyasal kaynaklanıyor olabilir şekil-in tampon molekül.
Birkaç iyi’nın arabellekleri17,18,19 yanında diğer yaygın olarak biyolojik olarak uyumlu arabellek sistemleri kullanarak formüle, pH ekran üzerinde bir arabellek molekülünün kimyasal etkisi deconvolute için tasarlanmıştır protein istikrar üzerinden elde edilen çözüm gerçek pH. Her tampon sistemi için üç pH değerleri sağlama ve pH değeri artıklık farklı sistemler arasında birleştiren, pH ekran olumlu tampon sistemleri için bir hedef protein ve uygun pH değerleri tanımlayabilirsiniz.
Tuz ekran sık laboratuvar tuzları yanı sıra chaotropes, chelants, ağır metaller ve azalan bakiyeli aracıları içerir. Ekranda yüksek iyonik güçlü ile ortamlara benzeşme protein örneği genel bir göstergesi verebilir ama her alt grup bileşikler de potansiyel bir protein yapısını temel bilgiler sağlayabilir. Örneğin, önemli ölçüde bir protein istikrarsızlaştırma bir chelant örnek içinde önemli yapısal metallerin göstergesi olabilir. Örnek da güçlü bir metal ba * ekran içinde tarafından stabilize, bu daha fazla yapısal deneyler için umut verici bir başlangıç noktası sağlar.
Osmolytes çevreleri ozmotik özelliklerini etkileyen çözünür bileşiklerdir. Doğa, onlar “kimyasal chaperones düzensiz protein katlama ve onları, özellikle stres koşulları20,21,22sabitleme uygulayan”, olarak kullanılabilir. Bu özellikleri onları protein kristalografisi çekici katkı yapmak; Kristal hasat sırasında cryoprotectants olarak kullanılabilir, montaj ve depolama işler23. Osmolytes potansiyel kullanım de proteinlerin saflaştırılması uzatır. Rekombinant proteinlerin E. coli içinde önemli bir bölümünü çözünmez ve standart arıtma yöntemleri kullanarak yerel durumunu kurtarmak zor olabilir. Osmolytes stabilize ve proteinler çözünmez kesirler gelen kurtarma için kullanılabilir, artan arıtma24verimleri.
Osmolyte ekran kurulan bileşikler Protein veri Bankası girişleri25 ve Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated yolları (DEOP)26 veritabanı mevcut kullanılarak tasarlanmış ve yinelemeli olarak standart proteinler kullanarak optimize edilmiştir. Ekran osmolyte sekiz alt sınıflarını inşa edilmiştir: gliserol, şeker ve polyols, deterjan sulfobetaines (NDSBs), betaines ve kendi analogları Organofosfatlar, dipeptides, amino asit ve türevleri ve son çeşitli grup. Her osmolyte çözünürlük ve etkili konsantrasyon aralıkları ürününü karşılaştırma listesine göre birden fazla konsantrasyonlarda bulunur.
İletişim kuralına kritik yönleri Santrifüjü adım ve 96-şey plaka TSA deneyler (adım 1.5) için uygun sızdırmazlık içerir. Santrifüjü sağlar bu protein örnek ve ekran durum kişiye gel ve karıştırın. Ayrıca, bir mühürsüz plaka kullanılırsa TSA deneme için deney boyunca buharlaşan bir artışa neden örnek konsantrasyon ve erken protein toplama şansımızın artması solvent önemli bir riski yoktur.
TSAs ve nanoDSF protein örnekleri geniş bir mükellef bulunmaktadır; örnekleri büyük çoğunluğu yorumlanabilir eritebilir eğrileri veya boya-Alerjik nanoDSF bir muhabir hydrophobicity-esaslı boya ile üretebilir. Standart Floresan kaynakları, protein için uygun değilse, basit değişiklik keşfedilmeyi iletişim kuralına fluorophore seçimdir. Birkaç alternatif boyalar TSA deneyleri için uygun olabilir. N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), thiol27ve 4 – ile tepki sonra fluoresces bir bileşik örnekler (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), temel, floresans değişir bir bileşik Onun floresan bir protein örnek olarak artan çevresine sertlik (ikinci boya örnek yüksek konsantrasyonda kez gerektirir)28,29 izlerken.
Tm araç yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanmamışsa eritebilir eğrisi Analizi alternatif yöntemler kullanılabilir. Veri homojen ve tek bir denatürasyon adım eritebilir eğrileri belirgin ise, kesilmiş bir veri kümesi Boltzmann Aşağıdaki denklemle sigmoid ile donatılmış:
F T sıcaklığında floresan yoğunluğu, Fmin ve Fmax nerede floresans yoğunluklarda önce ve denatürasyon geçişten sonra sırasıyla, Tm orta sıcaklık denatürasyon geçiş ve C olduğunu. Tmviraj gibidir. Bu yöntem de basit iki aşamalı denatürasyon işlemleri için çalışırken, karmaşık eritebilir eğrileri ile birden çok geçiş için uygun değildir.
Erişilebilirlik TSA önemli avantajlarından biridir; TSA deneylerin herhangi bir RT-PCR sisteminde istihdam floresans boya için uygun dalga boylarında, filtreler ile gerçekleştirilebilir. Bu düşük maliyetli sarf malzemeleri, işlem ve nispeten düşük miktarda protein, TSA proje ölçekleri, sanayi ve Akademi hem de geniş bir yelpazesi için değerli bir teknik yapmak gerekli kolaylığı ile birleştiğinde.
Olumlu arabellek koşulları belirten yanı sıra, ekranları ipuçları için bir örnek protein içinde yapısal metallerin varlığını verebilir bazı kuyular içerir. Tuz ekranında özel ilgi olabilir wells G6 ve G7, 5 mM EDTA ve 5 mM EGTA, sırasıyla içeren vardır. Bu kuyu önemli termal istikrarsızlık tarafından chelants münzevi önemli metal iyonları proteini içerisinde göstergesi olabilir. Bileşikleri osmolyte ekranı da potansiyel bir protein işlevine ipuçları sağlayabilir. Birçok ekranında bileşiklerin olan enzimlerin ortak yüzeylerde sınıflara molekülünün ait. Örneğin, genel istikrar lizozim enzim, N-peptidoglikan reaksiyonlar30kurulan yüzeylerde yapısal onların benzerlik atfedilen olabilir için saccharides (kuyu A11-B10 mevcut) tarafından tanınan.
Yukarıda özetlenen TSA ve nanoDSF iletişim kuralları da protein-ligand etkileşimleri çalışmaya adapte edilebilir. Özellikle bir protein için bağlama ligandlar termal istikrarı kompleksi içinde yeni etkileşimler tanıtarak artırabilir. Protein Tm pozitif vardiya bir doz bağımlı bir başarılı protein-ligand etkileşim gelecek vaat eden bir işaretidir. Hız, performans ve TSAs bileşik kitaplıklarıyla tarama düşük maliyet yaptı çok popüler bir yöntem aşamasındaki ilaç keşfi.
31,32,33,34birçok edebiyat örnek göstermek gibi hedef proteinler ve onların ligand komplekslerinin arabellek koşullarını optimize bir projenin başarı için gerekli olabilir. Altında 2 Kurulum süresi de dahil olmak üzere h alarak tipik bir tahlil ile arabellek en iyi duruma getirmeleri için hızlı, ucuz teknik TSAs ve kararlılık perde ile birleştiğinde nanoDSF temsil eder.
The authors have nothing to disclose.
Bu proje Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (Hibe Sözleşmesi n ° 685778) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden fon aldı. Bu eser Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir (BBSRC, grant numaraları 1/M011186/BB, BB/J014516/1). DB BBSRC doktora eğitimi ortaklık Newcastle-Liverpool-Durham için bir öğrencilik ve Durham Üniversitesi bölümü olan bu eser finansman doğru katkıda bulunmak için Biosciences teşekkür. Ian Edwards için onun yardım etmek ve Protein X Durham Üniversitesi bölümü Kimya kütle spektrometresi bölümü onların Enstrümantal analiz için teşekkür ederiz. Borç verme ve bu proje için Prometheus NT.48 sistemi ile yardımcı olmak için Arnthor Ævarsson için virüs-X Proje ve sayesinde de Claire Hatty ve NanoTemper GmbH ile yaptığı çalışmalarla için sana şükrediyoruz. Son olarak, Frances Gawthrop ve Tozer tohum BBSRC iCASE ödül bir parçası olarak verdikleri destek için teşekkür ederim.
Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |