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Biochemistry

अनुयाई कक्षों में लक्ष्य सहभागिता के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करना

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/58670
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

Summary

दवा लक्ष्य सगाई की माप प्रभावी दवा विकास और रासायनिक जांच सत्यापन के लिए केंद्रीय हैं । यहां, हम विस्तार से दवा को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल-लक्ष्य सगाई सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) के एक microplate-संगत अनुकूलन में उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग कर ।

Abstract

Quantitating अपने इच्छित प्रोटीन लक्ष्य के साथ छोटे अणुओं की बातचीत दवा विकास, लक्ष्य सत्यापन और रासायनिक जांच सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण है । तरीकों कि प्रोटीन लक्ष्य या छोटे अणु के संशोधन के बिना इस घटना को मापने विशेष रूप से हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मूल्यवान हैं । सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) एक तकनीक को जीवित कोशिकाओं में लक्ष्य सगाई की निगरानी है । यहां, हम मूल CETSA प्रोटोकॉल है, जो उच्च प्रवाह माप के लिए अनुमति देता है, जबकि एक सेल स्तर पर उपसेलुलर स्थानीयकरण को बनाए रखने के एक अनुकूलन का वर्णन । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए CETSA के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण अग्रिम प्रदान करता है यौगिक-लक्ष्य बातचीत की गहराई लक्षण वर्णन, विशेष रूप से कोशिकाओं की विषम आबादी में ।

Introduction

जब नई दवाओं या रासायनिक जांच के विकास के लिए यह जोड़ा आवश्यक है औषधीय प्रभाव या कार्यात्मक readout लक्ष्य अधिभोग या सगाई की माप के लिए जीना कोशिकाओं1,2,3में । इन आंकड़ों दोनों को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि वास्तव में छोटे अणु अपने वांछित लक्ष्य तक पहुंचता है और प्रोटीन लक्ष्य चयन4,5के पीछे जैविक परिकल्पना को मांय । इसके अलावा, दवा के विकास के दौरान, बढ़ती जटिलता के मॉडल प्रणालियों का चयन करें और नैदानिक परीक्षणों से पहले एक नेतृत्व यौगिक पुष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन नैदानिक प्रणाली में जीव विज्ञान के अनुवाद की पुष्टि करने के लिए, दवा का पता लगाने के लिए तरीके लक्ष्य सगाई और साथ जीव विज्ञान इस विकास प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं ।

दवा-लक्ष्य सगाई पारंपरिक रूप से एक स्थानिक संकल्प6,7के साथ एकल सेल स्तर पर, unfunctional छोटे अणुओं और प्रोटीन के साथ लाइव कोशिकाओं में निगरानी करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है । हाल ही में एक विधि unmodifiedd दवाओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (एक गर्मी चुनौती के जवाब में एक देशी प्रोटीन के ligand प्रेरित स्थिरीकरण) है quantified8, 9,10. यह एक गर्मी चुनौती के लिए जोखिम के बाद शेष घुलनशील प्रोटीन को बढ़ाता है द्वारा पूरा किया है । CETSA के आरंभिक खुलासे में पश्चिमी ब्लाटर का इस्तेमाल पता लगाने के लिए किया गया था । स्क्रीनिंग अभियानों को सक्षम करने के लिए और बड़ा यौगिक संग्रह के हिट triaging, CETSA प्रयोगों का प्रवाह बढ़ाने के प्रयासों में कई समरूप के विकास के लिए नेतृत्व किया है, microplate-परख10,11आधारित. हालांकि, इन पद्धतियों के साथ एक सीमा है कि वे वर्तमान में सबसे अच्छा है सेल सस्पेंशन में यौगिक उपचार के लिए अनुकूल है और पता लगाने के सेल lysis, स्थानिक जानकारी के नुकसान के लिए अग्रणी की आवश्यकता है । CETSA एक ही तापमान पर प्रोटीन को स्थिर करने के लिए आवश्यक छोटे अणु या ligand एकाग्रता के एक एकल एकाग्रता पर थर्मल एकत्रीकरण तापमान (टीagg) में एक ligand प्रेरित बदलाव के रूप में या तो प्रयोगात्मक लागू किया जा सकता है । बाद इज़ोटेर्माल खुराक प्रतिक्रिया फिंगरप्रिंट (ITDRF) के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों पर इन माप की निर्भरता दर्शाता है ।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य immunofluorescent द्वारा अनुयाई कोशिकाओं में CETSA का उपयोग कर लक्ष्य सगाई को मापने के लिए है (यदि) उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी12के साथ एंटीबॉडी का पता लगाने । यह कार्यविधि उपसेलुलर स्थानीयकरण के संरक्षण के साथ लक्ष्य सगाई के एकल-कक्ष ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए मूल CETSA प्लेटफ़ॉर्म बढ़ाता है । विशेष रूप से, कई पिछले रिपोर्टों के विपरीत, इस प्रक्रिया में यौगिक उपचार सतह टुकड़ी या धोने के बिना लाइव अनुयाई कोशिकाओं में किया जाता है गर्मी चुनौती से पहले, इस प्रकार की स्थापना की बाध्यकारी संतुलन हम13को मापने के उद्देश्य के संरक्षण । वर्तमान में, विधि एक लक्ष्य प्रोटीन p38α के लिए मान्य है (MAPK14) कई सेल लाइनों में, और हमें उम्मीद है कि इस प्रक्रिया को साझा करने के द्वारा तकनीक मोटे तौर पर पिघलने proteome भर में लागू किया जा सकता है. हमें आशंका है कि इस प्रोटोकॉल स्क्रीनिंग से दवा विकास पाइपलाइन में अनुकूलित किया जा सकता है, vivo मेंलक्ष्य सगाई की निगरानी के माध्यम से triaging मारा ।

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Protocol

1. कोशिकाओं की सीडिंग

नोट: वर्कफ़्लो के सामांय ओवरव्यू के लिए, चित्र 1देखें । सामग्री और रिएजेंट की एक विस्तृत सूची सामग्री की तालिकामें उपलब्ध हैं ।

  1. कोशिकाओं के बोने से पहले, काले ३८४ के फ्रेम में एक मानक ड्रिल के साथ ड्रिल छेद-अच्छी तरह से इमेजिंग परख प्लेट हवा बुलबुले से बचने के लिए हीटिंग कदम के दौरान बाद में थाली के नीचे फंस जा रहा है । प्लास्टिक कणों से बचने के लिए इस कदम के दौरान कुओं में प्रवेश करने और बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए, एक चिपकने वाला एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्लेटों को सील या एक ऊतक संस्कृति हुड में ड्रिलिंग करने से पहले प्लेट को कवर । आमतौर पर, प्लेट (छोटी धार) पर्याप्त की ओर से प्रत्येक पर ३.५ मिमी का व्यास के साथ 3 छेद ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ सफाई से एक लामिना प्रवाह बेंच तैयार करते हैं । मानक अपूतित ऊतक संस्कृति तकनीक के बाद, सेल कुप्पी या पकवान से मीडिया को हटा दें । फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 5-10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर कुप्पी में 2 मिलीलीटर trypsin जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी की मशीन जब तक एक-४३१ कोशिकाओं को अलग । या तो haemocytometer या सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती । संस्कृति माध्यम में ५०,००० कोशिकाओं/एमएल का एक सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
  3. सेल निलंबन के ४० µ एल तिरस्कृत (प्रति अच्छी तरह से २,००० कोशिकाओं के एक अंतिम सेल घनत्व दे) एक परख प्लेट के एक अच्छी तरह से एक थोक एजेंट मशीन या एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर, प्रयोग के पैमाने पर निर्भर करता है । संक्षेप में थाली की तरफ से थाली को समान रूप से फैलाने के लिए साइड से प्लेट ले जाएं ।
  4. प्लेट एज प्रभाव को कम करने के लिए, कोशिकाओं लामिना फ्लो हूड के पीछे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए परख थाली के तल पर बसने के लिए अनुमति देते हैं । फिर आर्द्र वातावरण सुनिश्चित करने के लिए थाली को सीलन वाले कागजी तौलिए से प्लास्टिक के कंटेनर में रखें । पहले का उपयोग करने के लिए, ७०% इथेनॉल के साथ प्लास्टिक कंटेनर पोंछ ।
  5. 2-3 दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में एक पारंपरिक humidified मशीन में परख थाली के साथ बॉक्स मशीन । 50-75% तक कोशिकाओं के प्रवाह की निगरानी, के रूप में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ दृश्य निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया ।

2. यौगिक उपचार

  1. प्रयोग के दिन, एक प्लेट वॉशर का उपयोग कर एक अच्छी तरह से माध्यम महाप्राण । प्लेट वॉशर पर थाली प्लेस और आकांक्षा कार्यक्रम का चयन करें । यदि एक प्लेट वॉशर उपलब्ध नहीं है, तो तरल एक बेकार ट्रे या सिंक पर एक तेजी से हाथ मोड़ के साथ प्लेट औंधा द्वारा हटाया जा सकता है । तरल को पूरा हटाने के अच्छे प्रदर्शन के लिए आवश्यक है । किसी भी अतिरिक्त तरल तो कागज तौलिए के साथ dabbing द्वारा हटा दिया है ।
  2. सेल संस्कृति माध्यम में उपयुक्त एकाग्रता के लिए पतला यौगिकों के 30 µ एल जोड़ें स्वचालित वितरण या प्रयोग के पैमाने पर निर्भर करता है एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । एक नकारात्मक (DMSO) और एक परख प्लेट पर कई कुओं के लिए सकारात्मक (ज्ञात ligand) नियंत्रण जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें । चूंकि यह एक थर्मल शिफ्ट परख है, यह आवश्यक है कि यौगिक एकाग्रता पृथक्करण स्थिरांक प्रोटीन स्थिरीकरण का पालन करने के लिए से अधिक है । इस प्रकार, यौगिक एकाग्रता के लिए एक मोटा दिशानिर्देश 50-100 बार आईसी५०है, लेकिन यौगिक सांद्रता के लिए और अधिक विवरण विवरण चर्चा अनुभाग में पाए जाते हैं ।
    नोट: DMSO सहनशीलता का प्रयोग करने से पहले कक्ष रेखाओं का परीक्षण किया जाना चाहिए ।
  3. एक सांस प्लेट सील और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में 30 मिनट के लिए एक humidified मशीन में मशीन के साथ यौगिक इलाज परख प्लेट सील ।

3. हीट चैलेंज

  1. सबसे पहले, वांछित तापमान के लिए पानी स्नान निर्धारित किया है । ध्यान दें कि अंतिम तापमान है कि परख प्लेट के कुओं के अंदर पहुंच गया है पानी स्नान में अंतिम तापमान से अलग हो सकता है । एक डमी थाली और thermocouple थर्मामीटर के साथ पहले से ऑफसेट की जांच । यह आमतौर पर स्नान के लिए 30 मिनट लगते है वांछित तापमान पर स्थिर ।
  2. सत्यापित करें कि वांछित तापमान हीटिंग कदम के दौरान परख थाली के कुओं में पहुंच गया है करने के लिए, परख थाली के रूप में मध्यम की एक ही मात्रा युक्त एक सील डमी प्लेट तैयार करते हैं ।
  3. मशीन से परख प्लेटें निकालें । सांस सील बंद लो और फिर से परख प्लेट एक तंग चिपकने वाला एल्यूमीनियम पंनी के साथ यौगिक इलाज कोशिकाओं है कि कोई पानी कुओं में पानी स्नान में बाद में हीटिंग के दौरान रिसाव होगा युक्त सील । सुनिश्चित करें कि प्लेट फ्रेम में ड्रिल्ड छेद पहुंच रहे हैं ।
  4. पानी की सतह की ओर angled प्लेट के नीचे के साथ जल स्नान में परख थाली और डमी थाली प्लेस किसी भी शेष हवा के नीचे से प्लेटों के लिए मजबूर करने के लिए ।
  5. एक thermocouple थर्मामीटर का उपयोग कर एक नया डमी प्लेट के कुओं के अंदर तापमान की निगरानी ।
  6. 3 मिनट के लिए पानी के स्नान में परख थाली गर्मी । तुरंत कमरे के साथ एक और पानी स्नान के लिए परख और डमी थाली हस्तांतरण-पानी तड़के 5 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए । परख प्लेट अब आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार है ।

4. निर्धारण

  1. वितरण 10 µ एल 16% (डब्ल्यू/वी) paraformaldehyde (पीएफए) सीधे परख प्लेट एक थोक एजेंट मशीन या एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    नोट: कुछ fixatives को यलो और इंस्टीट्यूशनल सेफ्टी नियमों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है ।
  2. महाप्राण पीएफए समाधान और एक प्लेट वॉशर का उपयोग कर ३०० µ l पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । प्लेट वॉशर पर थाली प्लेस और आकांक्षा कार्यक्रम का चयन करें ।
    नोट: इस प्रक्रिया में तरल एक साथ तिरस्कृत और निकाल दिया है जो प्लेट वॉशर पर एक ओवरफ़्लो प्रोटोकॉल का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है । एक प्लेट वॉशर या इसी तरह की प्रक्रिया उपलब्ध नहीं है, तो धुलाई कदम वैकल्पिक रूप से मैन्युअल रूप से किया जा सकता है ।
  3. मैनुअल धुलाई प्रक्रिया: एक बेकार ट्रे या सिंक पर तेजी से हाथ मोड़ के साथ प्लेट औंधा द्वारा कुओं से तरल निकालें । तरल को पूरा हटाने के अच्छे प्रदर्शन के लिए आवश्यक है । एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ पंजाब के ८० µ एल जोड़ें और प्लेट फिर से पलटना के रूप में ऊपर वर्णित है, दो बार धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ । पिछले धोने के बाद, साफ कागज तौलिए के खिलाफ प्लेट दाग किसी भी अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए ।

5. Permeabilization

  1. ०.१% के 20 µ l जोड़ें (v/v) NP-४० एक मल्टीचैनल प्लास्टिक के साथ कुओं के लिए और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर कोशिकाओं को धो लें (४.२ चरण) ।
  2. वैकल्पिक रूप से, जब उपयुक्त हो, एक antigen पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल, जैसेलागू करें:
    1. एक मल्टीचैनल प्लास्टिक के साथ कुएं में 1% एसडीएस के 20 µ l को जोड़ें । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और एक ही ऊपर वर्णित प्रक्रिया के अनुसार धोने (चरण ४.२) ।
    2. ८० पीएच ७.२ पर 10 मिमी glycine के μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । प्लेट वॉशर पर रखकर और आकांक्षा प्रोटोकॉल का चयन करके एक प्लेट वॉशर का उपयोग कर glycine समाधान महाप्राण । २.१ और ४.२ में नोट देखें अगर एक प्लेट वॉशर उपलब्ध नहीं है ।

6. अवरुद्ध

  1. 1% के 15 µ एल जोड़ें (डब्ल्यू/वी) पंजाब में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) कुओं को एक थोक एजेंट मशीन या एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर । 1 घंटे या एक एल्यूमीनियम पंनी प्लेट सील के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन ।

7. प्राथमिक एंटीबॉडी

  1. महाप्राण प्लेट वॉशर पर रखकर और आकांक्षा प्रोटोकॉल का चयन करके एक प्लेट वॉशर का उपयोग कर ब्लॉकिंग समाधान । २.१ और ४.२ में नोट देखें अगर एक प्लेट वॉशर उपलब्ध नहीं है ।
  2. एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर कुओं को पंजाब में BSA 1% (डब्ल्यू/वी) में तदनुसार पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 µ एल जोड़ें । 1 घंटे या एक एल्यूमीनियम पंनी प्लेट सील के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन ।

8. माध्यमिक एंटीबॉडी

  1. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया के अनुसार कुओं धो (चरण ४.२) ।
  2. जोड़ें 10 µ एल के Alexa ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी में तदनुसार पतला 1% (डब्ल्यू/v) BSA में पंजाब. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । एक चिपकने वाला एल्यूमीनियम पंनी सील के साथ प्लेट सील प्रकाश से बचाने के लिए ।
    नोट: इस और बाद के चरणों के दौरान प्रकाश से प्लेट को सुरक्षित रखें ।

9. परमाणु धुंधला और सेल मास्क

  1. एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर कुओं को पंजाब में ०.०५ मिलीग्राम/एमएल को पतला करने के 10 µ एल जोड़ें । अतिरिक्त 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  2. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी और Hoechst समाधान और ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर कुओं धो (४.२ चरण) ।
  3. एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर कुओं को पंजाब में २०० एनजी/एमएल करने के लिए पतला सेल मास्क के 10 µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  4. महाप्राण सेल मास्क समाधान और ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर कुओं धो (४.२ कदम) ।
  5. सभी कुओं के लिए पंजाब के ६० µ एल वितरण प्लेट वॉशर, एक थोक एजेंट मशीन, या एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर, और एक चिपकने वाला एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्लेटें सील ।

10. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. DAPI (387/447), GFP (472/520), और TexasRed (562/624): 3 फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग कर एक उच्च सामग्री imager पर छवियों पर कब्जा । अच्छी तरह से 10x उद्देश्य का उपयोग कर प्रति 4 छवियां मोल । स्वचालित लेजर स्वत फोकस का उपयोग करें और अधिग्रहण के दौरान 2 बिन्नी लागू होते हैं । छवियों को मेटाडेटा के साथ 16 बिट, धूसर स्केल tiff फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत करें ।
  2. उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण । DAPI (नाभिक) और TexasRed (कोशिका द्रव्य) के साथ एक सेल स्कोरिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग कर सेल सीमाओं की पहचान करें ।
  3. आगे डेटा विश्लेषण के लिए सभी अधिग्रहीत तरंग दैर्ध्य के लिए औसत तीव्रता निकालें ।
  4. परख की मजबूती सुनिश्चित करने के लिए Z-कारक की गणना ।
  5. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर% स्थिरीकरण की गणना: 100 * (1-(अच्छी तीव्रता-औसत अच्छी तरह से तीव्रता नकारात्मक नियंत्रण)/(औसत तीव्रता सकारात्मक नियंत्रण-औसत तीव्रता नकारात्मक नियंत्रण)). यहाँ नकारात्मक नियंत्रण DMSO है और सकारात्मक नियंत्रण संदर्भ पदार्थ है. यौगिकों के बीच अधिकतम स्थिरीकरण के बाद से भिन्न हो सकते हैं और वास्तव में ITDRF curves के लिए सकारात्मक नियंत्रण से अधिक हो सकता है, प्रत्येक यौगिक के लिए अधिकतम और न्यूनतम स्थिरीकरण तीव्रता नियंत्रण कुओं की गहनता मूल्यों के स्थान पर कभी-कभार इस्तेमाल किया जाता है .

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Representative Results

चित्र 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल उच्च सामग्री इमेजिंग द्वारा शेष घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने के साथ अनुयाई कोशिकाओं पर CETSA परख चलाने के लिए बुनियादी कार्यप्रवाह का वर्णन । इस कार्यप्रवाह आसानी से परख विकास के सभी चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है यौगिकों या14एजेंट की थाली लेआउट को संशोधित करके । हम विस्तार से नीचे कई प्रत्याशित उपयोग के मामलों के लिए परिणाम की उंमीद ।

एंटीबॉडी की पहचान और परख विकास। सफल परिणामों के लिए एक शर्त एक प्राथमिक एंटीबॉडी या अंय उपयुक्त संबध रिएजेंट की पहचान है कि चुनिंदा प्रोटीन के समग्र और उपजी प्रोटीन की उपस्थिति में देशी रूप को पहचानता है गर्मी के दौरान गठित चरण 3 में चुनौती । CETSA इमेजिंग परख स्थापित करने के लिए यहां वर्णित है, हम 9 सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच संकेत खिड़की के लिए 52 डिग्री सेल्सियस पर p38α लक्ष्यीकरण के एक पैनल की जांच की । हम तो सबसे अच्छा एंटीबॉडी titrated और एक ज्ञात ligand (सकारात्मक नियंत्रण) और DMSO (नकारात्मक नियंत्रण) द्वारा स्थिर p38α के लिए प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के साथ चित्रा 2 ए, बी में दिखाया शर्तों पर बसे. एंटीबॉडी मान्यता भी ligand बाध्यकारी (चित्रा 2c) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है कि लक्ष्य प्रोटीन के गठन के परिवर्तन से बाधित नहीं किया जाना चाहिए. एक उदाहरण के रूप में, BIRB796 है एक लंबा बंद दर, और लक्ष्य सहभागिता की ठहराव केवल एक antigen पुनर्प्राप्ति चरण (५.२; लागू करके संभव था; चित्र 2d) । यह ज्ञात लाइगैंडों के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रदर्शन को मांय करने के लिए महत्वपूर्ण है अगर उपलब्ध लक्ष्य प्रोटीन के विभिंन बाध्यकारी साइटों को कवर । एंटीबॉडी सत्यापन अधिमानतः दोनों के साथ और antigen पुनर्प्राप्ति चरण के बिना किया जाता है ।

टीagg और ITDRF घटता है । जैसा कि ऊपर बताया गया है, CETSA प्रयोगों को दो अलग मोड, टीagg घटता और ITDRF प्रयोगों में चलाया जा सकता है. दोनों वेरिएंट्स चित्रा 1 और प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित एक ही मूल प्रोटोकॉल का उपयोग । पहले सेटअप में, उद्देश्य एक तापमान ढाल के साथ कोशिकाओं को चुनौती और उपस्थिति और ligand की एक एकाग्रता के अभाव में टीagg घटता तुलना है । एक टीagg वक्र प्रदर्शन करने के लिए, अलग प्लेटें तापमान की एक सीमा के पार 3 मिनट के लिए गर्म कर रहे हैं । इस प्रयोग के प्रदर्शन में, यह समय पानी स्नान के लिए नए तापमान को स्थिर करने के लिए लेता है के साथ प्रत्येक थाली के लिए यौगिक उपचार लंबाई समय के लिए महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, पानी स्नान में गर्मी चुनौती कदम peforming एक पीसीआर मशीन में हीटिंग ट्यूबों की तुलना में अधिक समय लगता है । प्रयोगात्मक पथ को एक निश्चित तापमान पर एक ligand की एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता अगले चलाने के लिए ITDRF curves उत्पन्न करने के लिए है । सामान्य तौर पर, कई यौगिकों का परीक्षण करते समय, यौगिक के लिए तैयार प्लेटें परख स्वचालित तरल हैंडलिंग का उपयोग करने के लिए सबसे reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए तैयार कर रहे हैं. यौगिकों DMSO में और फिर वांछित सांद्रता के लिए कोशिका संस्कृति मीडिया में भंग प्रश्नपत्र पतला कर रहे हैं । हम आम तौर पर परीक्षण किया है 11 बिंदु एकाग्रता श्रृंखला में शुरू ५०-१०० µ m में 3 या 4 गुना कमजोर पड़ने, लेकिन यह उपयोग लाइगैंडों की शक्ति पर निर्भर करता है. यह पहले दोनों अनुपस्थिति और एक ligand की उपस्थिति में टीagg वक्र स्थापित करने और बाद में इज़ोटेर्माल प्रयोगों के लिए तापमान का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है, जहां curves के बीच एक बदलाव मनाया जा सकता है । चयनित तापमान के आसपास या सिर्फ टीaggके ऊपर होना चाहिए । दोनों स्वरूपों लक्ष्य सगाई की पुष्टि के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन यौगिक समानताएं ITDRF प्रयोगों की रैंकिंग के लिए अक्सर अधिक उपयुक्त हैं । एक टीagg वक्र और चित्रा 3 बी एक ठेठ ITDRF प्रयोग के quantifies परिणाम के लिए अनुमानित quantified परिणामों का एक उदाहरण से पता चलता है चित्रा ।

स्क्रीनिंग अभियान चलायागया । प्रोटोकॉल भी स्क्रीनिंग अभियानों के लिए अनुकूलित करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के उपंयास बांधने की पहचान कर सकते हैं । इस मामले में, इज़ोटेर्माल गर्मी चुनौतियों की पहचान स्थिर यौगिकों के लिए ITDRF प्रयोगों के बाद एक एकल एकाग्रता पर यौगिकों की एक बड़ी संख्या के लिए लागू कर रहे हैं. हम परख तैयार स्क्रीनिंग प्लेटें तैयार करने और संस्कृति मीडिया में परख प्लेटों में पतला यौगिकों हस्तांतरण स्वचालित तरल हैंडलिंग का उपयोग कर । सभी थर्मल स्थिरता परख के साथ के रूप में, यह पृथक्करण निरंतर से अधिक के लिए प्रोटीन स्थिरीकरण का पालन करने के लिए आवश्यक है, और इस प्रकार हम ५० µ मीटर पर छोटे अणु पुस्तकालयों लागू किया है हिट पहचान की सुविधा । ITDRF का उपयोग कर हिट की Triaging बाद में रैंकिंग और इन यौगिकों की प्राथमिकता की अनुमति होगी । चित्रा 4 एक स्क्रीनिंग प्लेट से एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है.

Figure 1
चित्रा 1 . इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध ओवरव्यू । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . एंटीबॉडी की पहचान और परख विकास । a) a-४३१ कक्षों में मानव p38α का पता लगाने के लिए उदाहरण डेटा. सकारात्मक (1 µ एम AMG548) और नकारात्मक (DMSO) नियंत्रण के प्रतिनिधि छवियां । लाल-नाभिकीय Hoechst धुंधला, हरा-p38α धुंधला । 10x आवर्धन के साथ लिया छवियों; सफेद पैमाने पर बार का प्रतिनिधित्व करता है ७३ µm. B) quantified डेटा का उदाहरण औसत तीव्रता के रूप में व्यक्त/ 6 अलग प्लेट्स के लिए 16 प्रतिकृति के माध्य की मानक त्रुटि पट्टियाँ त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक थाली में एक पानी स्नान कोशिकाओं के निर्धारण के बाद, permeabilization और बाद में immunostaining में ५२ ° c करने के लिए गरम किया गया था । ग) इम्यूनोफ्लोरेसेंस संकेत तीव्रता 1 µ मीटर BIRB796 या DMSO के साथ एक-४३१ कोशिकाओं के इलाज के बाद ऊपर वर्णित के रूप में सीधे निर्धारण द्वारा पीछा मापा । एक हीटिंग कदम के अभाव में, BIRB796 संकेत DMSO संकेत से कम है, सुझाव है कि BIRB796 इस एंटीबॉडी के साथ p38α का पता लगाने में खलल न डालें । घ) या तो के साथ BIRB796 के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए ITDRFCETSA घटता (नीला त्रिभुज) या बिना (धूसर त्रिभुज) antigen पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल । यह आंकड़ा Axelsson एट अल. २०१८12से संशोधित किया गया है । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . थर्मल एकत्रीकरण और ITDRF प्रयोगों । A) थर्मल एकीकरण वक्र प्रयोगों के साथ कोशिकाओं के लिए सकारात्मक (1 µ एम AMG548, ऑरेंज में) और नकारात्मक (ग्रे में DMSO) नियंत्रण. त्रुटि पट्टियों ३२ या ४६४ प्रतिकृति के माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । ख) ITDRFCETSA प्रयोग नीले रंग में SB203580 के धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए ५२ डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया, Skepinone-एल में हरे और लाल रंग में RWJ67657 । त्रुटि पट्टियों के माध्य का मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व 6 प्रतिकृति करता है । Quantified डेटा औसत तीव्रता/सेल के रूप में व्यक्त कर रहे है और संबंधित यौगिक के उच्चतम एकाग्रता के खिलाफ सामान्यीकृत । यह आंकड़ा Axelsson एट अल. २०१८12से संशोधित किया गया है । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . 10x आवर्धन पर एक स्क्रीनिंग प्लेट के प्रतिनिधि सिंहावलोकन । सकारात्मक नियंत्रण (1 µ m AMG548) कॉलम 2 और 24 में है और नकारात्मक नियंत्रण (DMSO) कॉलम 1 और 23 में हैं । अंय सभी कुओं पुस्तकालय यौगिकों कई हिट चिह्नित के साथ स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल की ५० µ एम होते हैं । इनसेट आंकड़ों में, निचले दाहिने कोने में सफेद रेखा २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । यह आंकड़ा Axelsson एट अल. २०१८12से संशोधित किया गया है । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

के रूप में परिणाम अनुभाग में चर्चा की, वहां कई मुख्य प्रक्रिया के लिए कदम उठाए हैं । सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है एक उच्च गुणवत्ता संबध एजेंट की पहचान । हम प्रत्येक इच्छित लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी के एक छोटे पुस्तकालय स्क्रीनिंग की सलाह देते हैं । एक प्राथमिक एंटीबॉडी चयन किया गया है के बाद, यह भी प्रोटीन लक्ष्य के विभिंन बाध्यकारी साइटों की एक संख्या के लिए प्रणाली को मांय यदि उपयुक्त है महत्वपूर्ण है । गर्मी चुनौती का लोप करके चित्रा 2c में दिखाया के रूप में परख संकेत के साथ हस्तक्षेप कि यौगिकों के लिए काउंटर स्क्रीनिंग अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है. एक ligand की उपस्थिति में एक कम संकेत स्वीकार्य है, जब एक antigen पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल चरण ५.२ में वर्णित के रूप में परीक्षण किया जा सकता है । प्लेटों की असमान हीटिंग मनाया डेटा में उतार चढ़ाव और थाली से प्लेट रूपांतरों का कारण बन सकता है । चूंकि प्लेटें आंशिक रूप से क्षणिक गर्मी चुनौती के दौरान एक पानी के स्नान में जलमग्न हो जाती हैं (स्टेप ३.४) प्लेटों के बाहरी कुएँ न केवल कुएँ के नीचे बल्कि बाहरी दीवार के माध्यम से भी गर्म पानी के संपर्क में आ जाते हैं. इससे प्लेट के बाहरी कुओं में एक ही डुबकी समय के दौरान अधिक तापमान और बाद में प्लेट एज इफेक्ट हो सकता है. इसलिए, यह प्लेट के बाहरी कुओं से बचने के लिए सिफारिश की है । इसी तरह के प्रभाव भी देखा जा सकता है अगर हवा के बुलबुले हीटिंग चरण के दौरान प्लेट के नीचे गर्म पानी और कुओं के नीचे के बीच पर्याप्त संपर्क को रोकने के लिए फंस रहे हैं । हीटिंग इमेजिंग प्लेटें, उपकरणों और प्लेटों विशेष रूप से गर्मी के लिए जोखिम के लिए बनाया के साथ चुनौतियों को देखते हुए इस विधि अग्रिम मदद कर सकता है । हम कई सेल लाइनों के उपयोग का पता लगाया है, और अनुयाई सेल प्रकार के लिए गर्मी चुनौती के बाद सतह लगाव में परिवर्तनशीलता पाया है । हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक प्रयोगों का सुझाव है कि एक कोटिंग या extracellular मैट्रिक्स जैसे Synthemax द्वितीय के उपयोग-अनुसूचित जाति या सेल-आजतक सेल टुकड़ी को कम कर सकते हैं, लेकिन यह एक तकनीकी चुनौती पैदा कर सकता है जब अर्द्ध संलग्न कोशिका प्रकार का उपयोग कर । के बाद से यौगिक उपचार जीवित कोशिकाओं में किया जाता है, छोटे अणुओं सेल पारगंय होना चाहिए. यदि यौगिक झिल्ली पारगंय नहीं है, तो वैकल्पिक उच्च प्रवाह CETSA विधियों की सिफारिश की जाती है । कुछ यौगिकों चयापचय करने के लिए अपने लक्ष्य प्रोटीन11से बाइंड करने के लिए सक्रिय होने की जरूरत है । ऐसे मामलों में, गर्मी चुनौती से पहले यौगिक के साथ अब उपचार कोशिकाओं की सिफारिश की है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए यह उच्च प्रवाह जांच अभियानों के लिए उत्तरदायी बनाने इमेजिंग के लिए सेल सीडिंग से एक एकल थाली की आवश्यकता है । प्रत्येक प्रयोग के लिए कोशिकाओं की संख्या बहुत कम है से पश्चिमी दाग या पिछले AlphaScreen परख15के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, धुलाई या सेल टुकड़ी कदम है, जो यौगिक उपलब्धता और बाध्यकारी बदल सकते हैं, हटा रहे हैं, गर्मी चुनौती कदम के माध्यम से स्थापित बाध्यकारी संतुलन के संरक्षण । पिछले प्रक्रियाओं के विपरीत, cytotoxicity के कारण संकेत की कमी के साथ-साथ परमाणु दाग पर सूचना दी है । अंत में, इमेजिंग व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्थानिक संकल्प को बरकरार रखता है, लक्ष्य सगाई माप के लिए कोशिकाओं या सेल राज्यों की मिश्रित आबादी में अनुमति देता है ।

वास्तव में दृष्टिकोण की प्रयोज्यता का आकलन करने के लिए, ठोस के लिए पिघलने proteome भर में तकनीक लागू प्रयासों की जरूरत है । ऐसे प्रयोग उपयुक्त अपनत्व रिएजेंट की पहचान करने में सुगमता को स्पष्ट करेंगे, जो शेष विकृत और समेकित प्रोटीन की उपस्थिति में देशी प्रोटीन पर चुनिंदा रिपोर्ट करते हैं. वर्तमान में हम कैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को मज़बूती से एक संकेत खिड़की उपाय करने की क्षमता को प्रभावित करेगा पता नहीं है । हम इस संबंध और उपलब्ध एंटीबॉडी के selectivity को प्रतिबिंबित करने की उंमीद है, और आशा है कि कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के लिए immunofluorescent परख में संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल प्रौद्योगिकियों लागू हो जाएगा । वैकल्पिक रूप से, चिह्नित प्रोटीन या कार्यात्मक यौगिकों वर्णित प्रोटोकॉल के संशोधित संस्करण में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल लक्ष्य है कि पिघल और बातचीत के लिए जहां एक quantifiable स्थिरीकरण मनाया जा सकता है के लिए सीमित है । उदाहरण के लिए, अंतर्जात लाइगैंडों जीवित कोशिका परख में एक प्रोटीन को स्थिर कर सकते हैं, जो एक exogenous ligand द्वारा आगे स्थिरीकरण रोक सकता है । यद्यपि यहां खोजबीन नहीं की गई, लेकिन हमारा मानना है कि यह मल्टीप्लेक्स readouts के लिए एक साथ कई लक्ष्यों के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए संभव होगा, या बहाव प्रभाव के साथ एक लक्ष्य । आगे के अध्ययनों में सीटू CETSA के इन पहलुओं की जांच जरूरी है.

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट को लेकर कोई खुलासे नहीं हुए हैं ।

Acknowledgments

लेखक जीवन प्रयोगशाला और कारोलिंस्का Institutet के लिए विज्ञान से बुनियादी सुविधाओं का समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी Michaela Vallin, Magdalena Otrocka और थॉमस Lundbäck के साथ इनपुट और विचार विमर्श स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

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References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
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  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
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  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
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जैव रसायन १४१ अंक सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) इमेजिंग लक्ष्य सगाई p38α उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग एकल सेल संकल्प
अनुयाई कक्षों में लक्ष्य सहभागिता के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करना
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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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