Mätningar av drogen mål engagemang är centralt för utveckling av effektiva läkemedel och kemiska sonden validering. Här, detalj vi ett protokoll för mätning av drogen-mål engagemang med hög innehåll imaging i en mikroplattan-kompatibel anpassning av cellulära termisk Skift analysen (CETSA).
Quantitating samverkan mellan små molekyler och deras avsedda protein mål är avgörande för läkemedelsutveckling, target validering och kemiska sonden validering. Metoder som mäter detta fenomen utan modifiering av protein målet eller liten molekyl är särskilt värdefulla men tekniskt utmanande. Cellulära termisk Skift analysen (CETSA) är en teknik för att övervaka mål engagemang i levande celler. Här beskriver vi en anpassning av det ursprungliga CETSA-protokollet, som möjliggör hög genomströmning mätningar bibehållen subcellulär lokalisering på enstaka cellnivå. Vi tror detta protokoll erbjuder viktiga framsteg att tillämpningen av CETSA för djupgående karakterisering av förening-target interaktion, särskilt i heterogena populationer av celler.
Vid utveckling av nya läkemedel eller kemiska sonder är det viktigt att den observerade farmakologiska effekten eller funktionella avläsning till mätningar av målet beläggning eller engagemang i levande celler1,2,3. Dessa uppgifter är nödvändiga både för att säkerställa att den lilla molekylen i själva verket når sitt önskade mål och för att validera biologiska hypotesen bakom protein mål urval4,5. Dessutom under läkemedelsutveckling används modellsystem av ökande komplexitet för att välja och bekräfta ett lead förening innan kliniska prövningar. För att bekräfta översättning av biologi över dessa prekliniska system, är metoder för spårning drog-mål engagemang och medföljande biologi i hela denna utvecklingsprocess kritisk.
Läkemedel-mål engagemang har traditionellt varit utmanande att övervaka i levande celler med unfunctionalized små molekyler och proteiner, särskilt på enskild cell nivå med rumslig upplösning6,7. En nyligen metod att observera samspelet mellan omodifierade droger och proteiner i levande celler är den cellulära termiska Skift analys (CETSA) där ligand-inducerad stabilisering av en infödd protein som svar på en värme utmaning är kvantifierade8, 9,10. Detta åstadkoms genom att kvantifiera återstående lösligt protein efter exponering för en värme utmaning. I inledande utlämnande av CETSA användes western blot för detektion. För att aktivera screening kampanjer och slå triaging av större sammansatta samlingar, har insatser för att öka genomströmningen av CETSA experiment lett till utvecklingen av flera homogen, mikroplattbaserade analyser10,11. En begränsning med dessa metoder är dock att de är för närvarande bäst lämpade till sammansatta behandling i cellsuspensioner och upptäckt kräver cellys, leder till förlust av rumslig information. CETSA kan vara tillämpas experimentellt antingen som en ligand-inducerad Skift i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enda koncentration av små molekylen eller ligand koncentrationen nödvändigt att stabilisera proteinet vid en inre temperatur. Den senare kallas isotermiska dos svar fingeravtryck (ITDRF) för att beteckna beroendet av dessa mätningar på de särskilda villkor som experimentell.
Målet med detta protokoll är att mäta målet engagemang med CETSA i vidhäftande celler genom Immunofluorescerande (om) påvisande av antikroppar med hög-innehåll mikroskopi12. Proceduren omfattar den ursprungliga CETSA plattformen som möjliggör encelliga kvantifiering av mål engagemang med bevarande av subcellulär lokalisering. Särskilt, till skillnad från många tidigare rapporter, i den här proceduren sammansatta behandlingen utförs i levande vidhäftande celler utan ytan avlossning eller tvättning innan värmen utmaningen, därmed bevara etablerade bindande equilibriumen siktar vi på att mäta13. För närvarande, metoden är validerad för ett mål protein p38α (MAPK14) i flera cellinjer, och vi hoppas att genom att dela denna procedur tekniken kan tillämpas i stort sett hela det smältande proteomet. Vi räknar med att detta protokoll kan anpassas under hela rörledningen drog utveckling från screening, hit triaging genom övervakning av mål engagemang i vivo.
Som diskuteras i resultatavsnittet, finns det flera viktiga steg till förfarandet. Först, är det viktigt att identifiera en hög affinitet reagens. Vi rekommenderar screening ett litet bibliotek av antikroppar för varje önskat mål. Efter en primär antikropp har valts, är det också viktigt att validera systemet för ett antal olika bindande platser av protein målet om lämpliga. Kampen mot screening för föreningar som stör signalen assay som visas i figur 2 c genom att utelämna …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner infrastrukturstöd från Science for Life Laboratory och Karolinska Institutet. Författarna också erkänna input och diskussioner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka och Thomas Lundbäck.
Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
Water bath | Julabo | TW12 | |
Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |