Summary

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Published: November 29, 2018
doi:

Summary

Mätningar av drogen mål engagemang är centralt för utveckling av effektiva läkemedel och kemiska sonden validering. Här, detalj vi ett protokoll för mätning av drogen-mål engagemang med hög innehåll imaging i en mikroplattan-kompatibel anpassning av cellulära termisk Skift analysen (CETSA).

Abstract

Quantitating samverkan mellan små molekyler och deras avsedda protein mål är avgörande för läkemedelsutveckling, target validering och kemiska sonden validering. Metoder som mäter detta fenomen utan modifiering av protein målet eller liten molekyl är särskilt värdefulla men tekniskt utmanande. Cellulära termisk Skift analysen (CETSA) är en teknik för att övervaka mål engagemang i levande celler. Här beskriver vi en anpassning av det ursprungliga CETSA-protokollet, som möjliggör hög genomströmning mätningar bibehållen subcellulär lokalisering på enstaka cellnivå. Vi tror detta protokoll erbjuder viktiga framsteg att tillämpningen av CETSA för djupgående karakterisering av förening-target interaktion, särskilt i heterogena populationer av celler.

Introduction

Vid utveckling av nya läkemedel eller kemiska sonder är det viktigt att den observerade farmakologiska effekten eller funktionella avläsning till mätningar av målet beläggning eller engagemang i levande celler1,2,3. Dessa uppgifter är nödvändiga både för att säkerställa att den lilla molekylen i själva verket når sitt önskade mål och för att validera biologiska hypotesen bakom protein mål urval4,5. Dessutom under läkemedelsutveckling används modellsystem av ökande komplexitet för att välja och bekräfta ett lead förening innan kliniska prövningar. För att bekräfta översättning av biologi över dessa prekliniska system, är metoder för spårning drog-mål engagemang och medföljande biologi i hela denna utvecklingsprocess kritisk.

Läkemedel-mål engagemang har traditionellt varit utmanande att övervaka i levande celler med unfunctionalized små molekyler och proteiner, särskilt på enskild cell nivå med rumslig upplösning6,7. En nyligen metod att observera samspelet mellan omodifierade droger och proteiner i levande celler är den cellulära termiska Skift analys (CETSA) där ligand-inducerad stabilisering av en infödd protein som svar på en värme utmaning är kvantifierade8, 9,10. Detta åstadkoms genom att kvantifiera återstående lösligt protein efter exponering för en värme utmaning. I inledande utlämnande av CETSA användes western blot för detektion. För att aktivera screening kampanjer och slå triaging av större sammansatta samlingar, har insatser för att öka genomströmningen av CETSA experiment lett till utvecklingen av flera homogen, mikroplattbaserade analyser10,11. En begränsning med dessa metoder är dock att de är för närvarande bäst lämpade till sammansatta behandling i cellsuspensioner och upptäckt kräver cellys, leder till förlust av rumslig information. CETSA kan vara tillämpas experimentellt antingen som en ligand-inducerad Skift i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enda koncentration av små molekylen eller ligand koncentrationen nödvändigt att stabilisera proteinet vid en inre temperatur. Den senare kallas isotermiska dos svar fingeravtryck (ITDRF) för att beteckna beroendet av dessa mätningar på de särskilda villkor som experimentell.

Målet med detta protokoll är att mäta målet engagemang med CETSA i vidhäftande celler genom Immunofluorescerande (om) påvisande av antikroppar med hög-innehåll mikroskopi12. Proceduren omfattar den ursprungliga CETSA plattformen som möjliggör encelliga kvantifiering av mål engagemang med bevarande av subcellulär lokalisering. Särskilt, till skillnad från många tidigare rapporter, i den här proceduren sammansatta behandlingen utförs i levande vidhäftande celler utan ytan avlossning eller tvättning innan värmen utmaningen, därmed bevara etablerade bindande equilibriumen siktar vi på att mäta13. För närvarande, metoden är validerad för ett mål protein p38α (MAPK14) i flera cellinjer, och vi hoppas att genom att dela denna procedur tekniken kan tillämpas i stort sett hela det smältande proteomet. Vi räknar med att detta protokoll kan anpassas under hela rörledningen drog utveckling från screening, hit triaging genom övervakning av mål engagemang i vivo.

Protocol

1. sådd av celler Obs: Se figur 1för en allmän översikt över arbetsflödet. En detaljerad lista över material och reagenser finns i Tabell för material. Före sådd av cellerna, borra hål med en standardborr inom ramen för svart 384-väl tänkbar assay plattor att undvika luftbubblor att bli instängd under plattan senare under värme steg. Att undvika plast partiklar in brunnarna under detta steg och för att u…

Representative Results

Protokollet beskrivs i figur 1 beskriver det grundläggande arbetsflödet för att köra CETSA analyser på vidhäftande celler med påvisande av återstående lösligt protein av högt innehåll imaging. Arbetsflödet kan enkelt anpassas till alla stadier av assay utveckling genom att ändra layouten plattan av reagens eller föreningar14. Vi detalj förväntade resultat för flera förväntade användningsfall nedan. <p class="jo…

Discussion

Som diskuteras i resultatavsnittet, finns det flera viktiga steg till förfarandet. Först, är det viktigt att identifiera en hög affinitet reagens. Vi rekommenderar screening ett litet bibliotek av antikroppar för varje önskat mål. Efter en primär antikropp har valts, är det också viktigt att validera systemet för ett antal olika bindande platser av protein målet om lämpliga. Kampen mot screening för föreningar som stör signalen assay som visas i figur 2 c genom att utelämna …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner infrastrukturstöd från Science for Life Laboratory och Karolinska Institutet. Författarna också erkänna input och diskussioner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka och Thomas Lundbäck.

Materials

Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

Play Video

Cite This Article
Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

View Video