Målinger av narkotika mål engasjement er sentrale effektiv narkotika utvikling og kjemiske sonde validering. Her, detalj vi måle narkotika mål engasjement med høy innhold imaging i en microplate-kompatibelt tilpasning av mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en protokoll.
Quantitating samspillet av små molekyler med sine tiltenkte protein målet er avgjørende for narkotika utvikling, målet validering og kjemiske sonde validering. Metoder som måler dette fenomenet uten endring av protein målet eller små molekyl er spesielt verdifull om teknisk utfordrende. Mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en teknikk for å overvåke målet engasjement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning av den opprinnelige CETSA-protokollen, som tillater for høy gjennomstrømning mål samtidig beholde subcellular lokalisering på enkeltcelle nivå. Vi tror denne protokollen gir viktige fremskritt til anvendelsen av CETSA for detaljert karakterisering av sammensatte mål interaksjon, spesielt i heterogene populasjoner av celler.
Ved utvikling av nye medisiner eller kjemiske sonder er det viktig å par observert farmakologisk effekt eller funksjonelle avlesning mål mål personer eller engasjement i lever celler1,2,3. Disse dataene er både å sikre at de små molekylet faktisk når ønsket målet og validere biologiske hypotesen bak protein mål utvalg4,5. Videre under narkotika utvikling brukes modellsystemer økende kompleksitet til å velge og bekrefte et kundeemne sammensatte før kliniske studier. For å bekrefte oversettelse av biologi over disse prekliniske systemer, er metoder for sporing narkotika-mål engasjement og tilhørende biologi utvikling prosessen avgjørende.
Narkotika-mål engasjement har tradisjonelt vært utfordrende overvåke lever celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, særlig på encellede nivå med romlig oppløsning6,7. En nyere metode å observere samspillet mellom uendret narkotika og proteiner i levende celler er mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) der ligand-indusert stabilisering av en innfødt protein som svar på en varme utfordring er kvantifisert8, 9,10. Dette oppnås ved å kvantifisere gjenværende løselig protein etter eksponering for en varme utfordring. I første fremlegging av CETSA, ble western blot brukt for påvisning. For å aktivere screening kampanjer og traff triaging større sammensatte samlinger, har arbeidet med å øke gjennomstrømmingen CETSA eksperimenter ført til utviklingen av flere homogen, microplate-baserte analyser10,11. Imidlertid er en begrensning med disse at de er for tiden best egnet til sammensatte behandling i cellen suspensjoner og gjenkjenning krever celle lysis, fører til tap av romlig informasjon. CETSA kan være brukt eksperimentelt enten som en ligand-indusert endring i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enkelt konsentrasjon av små molekyl eller ligand konsentrasjon nødvendig å stabilisere protein på en enkelt temperatur. Sistnevnte kalles isotermiske dose svar fingeravtrykk (ITDRF) for å markere avhengighet av disse målene på bestemte eksperimentelle forhold.
Målet med denne protokollen er å måle mål engasjement ved hjelp av CETSA i tilhenger celler ved immunofluorescent (hvis) antistoff oppdagelsen med høyt innhold mikroskopi12. Denne prosedyren utvider den opprinnelige CETSA plattformen å tillate encellede kvantifisering av mål engasjement med bevaring av subcellular lokalisering. Spesielt, i motsetning til mange tidligere rapporter, i denne prosedyren sammensatte behandling utføres i live tilhenger celler uten overflaten avdeling eller vask før varme utfordringen, dermed bevare etablerte bindende likevekt mål å måle13. Foreløpig metoden er godkjent for ett mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håper at ved å dele denne prosedyren teknikken kan brukes bredt på den smeltende proteom. Vi forventer at denne protokollen kan tilpasses gjennom rørledningen narkotika utvikling fra screening, traff triaging gjennom overvåking av målet engasjement i vivo.
Som beskrevet under resultater, finnes det flere viktige trinn i prosedyren. Først er det viktig å identifisere en høykvalitets affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lite bibliotek av antistoffer for hvert ønsket mål. Etter en primær antistoff er valgt, er det også viktig å validere systemet for en rekke forskjellige bindende områder av protein målet eventuelt. Mot screening for forbindelser som forstyrrer analysen signalet som vist i figur 2C ved å utelate varme utfordring…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter infrastrukturstøtte fra vitenskap for livet laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne bekrefter også inngang og diskusjoner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.
Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
Water bath | Julabo | TW12 | |
Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |