Summary

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Published: November 29, 2018
doi:

Summary

Målinger av narkotika mål engasjement er sentrale effektiv narkotika utvikling og kjemiske sonde validering. Her, detalj vi måle narkotika mål engasjement med høy innhold imaging i en microplate-kompatibelt tilpasning av mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en protokoll.

Abstract

Quantitating samspillet av små molekyler med sine tiltenkte protein målet er avgjørende for narkotika utvikling, målet validering og kjemiske sonde validering. Metoder som måler dette fenomenet uten endring av protein målet eller små molekyl er spesielt verdifull om teknisk utfordrende. Mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en teknikk for å overvåke målet engasjement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning av den opprinnelige CETSA-protokollen, som tillater for høy gjennomstrømning mål samtidig beholde subcellular lokalisering på enkeltcelle nivå. Vi tror denne protokollen gir viktige fremskritt til anvendelsen av CETSA for detaljert karakterisering av sammensatte mål interaksjon, spesielt i heterogene populasjoner av celler.

Introduction

Ved utvikling av nye medisiner eller kjemiske sonder er det viktig å par observert farmakologisk effekt eller funksjonelle avlesning mål mål personer eller engasjement i lever celler1,2,3. Disse dataene er både å sikre at de små molekylet faktisk når ønsket målet og validere biologiske hypotesen bak protein mål utvalg4,5. Videre under narkotika utvikling brukes modellsystemer økende kompleksitet til å velge og bekrefte et kundeemne sammensatte før kliniske studier. For å bekrefte oversettelse av biologi over disse prekliniske systemer, er metoder for sporing narkotika-mål engasjement og tilhørende biologi utvikling prosessen avgjørende.

Narkotika-mål engasjement har tradisjonelt vært utfordrende overvåke lever celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, særlig på encellede nivå med romlig oppløsning6,7. En nyere metode å observere samspillet mellom uendret narkotika og proteiner i levende celler er mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) der ligand-indusert stabilisering av en innfødt protein som svar på en varme utfordring er kvantifisert8, 9,10. Dette oppnås ved å kvantifisere gjenværende løselig protein etter eksponering for en varme utfordring. I første fremlegging av CETSA, ble western blot brukt for påvisning. For å aktivere screening kampanjer og traff triaging større sammensatte samlinger, har arbeidet med å øke gjennomstrømmingen CETSA eksperimenter ført til utviklingen av flere homogen, microplate-baserte analyser10,11. Imidlertid er en begrensning med disse at de er for tiden best egnet til sammensatte behandling i cellen suspensjoner og gjenkjenning krever celle lysis, fører til tap av romlig informasjon. CETSA kan være brukt eksperimentelt enten som en ligand-indusert endring i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enkelt konsentrasjon av små molekyl eller ligand konsentrasjon nødvendig å stabilisere protein på en enkelt temperatur. Sistnevnte kalles isotermiske dose svar fingeravtrykk (ITDRF) for å markere avhengighet av disse målene på bestemte eksperimentelle forhold.

Målet med denne protokollen er å måle mål engasjement ved hjelp av CETSA i tilhenger celler ved immunofluorescent (hvis) antistoff oppdagelsen med høyt innhold mikroskopi12. Denne prosedyren utvider den opprinnelige CETSA plattformen å tillate encellede kvantifisering av mål engasjement med bevaring av subcellular lokalisering. Spesielt, i motsetning til mange tidligere rapporter, i denne prosedyren sammensatte behandling utføres i live tilhenger celler uten overflaten avdeling eller vask før varme utfordringen, dermed bevare etablerte bindende likevekt mål å måle13. Foreløpig metoden er godkjent for ett mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håper at ved å dele denne prosedyren teknikken kan brukes bredt på den smeltende proteom. Vi forventer at denne protokollen kan tilpasses gjennom rørledningen narkotika utvikling fra screening, traff triaging gjennom overvåking av målet engasjement i vivo.

Protocol

1. såing av celler Merk: Se figur 1for en generell oversikt over arbeidsflyten. En detaljert liste over materialer og reagenser finnes i Tabellen for materiale. Før Såing av cellene, bore hull med en standard drill i rammen av svart 384-og bildebehandling analysen plater å unngå luftbobler blir fanget under platen senere under oppvarming trinnet. Unngå plast partikler inn brønnene i dette trinnet og opprettholde s…

Representative Results

Protokollen i figur 1 beskriver den grunnleggende arbeidsflyten for å kjøre CETSA analyser på tilhenger celler med oppdagelsen av gjenværende løselig protein av høy innhold tenkelig. Denne arbeidsflyten kan lett tilpasses alle stadier av analysen utvikling ved å endre oppsettet plate forbindelser eller reagenser14. Vi detalj forventede resultater for flere forventet brukstilfeller nedenfor. <p class="jove_content" fo:keep-to…

Discussion

Som beskrevet under resultater, finnes det flere viktige trinn i prosedyren. Først er det viktig å identifisere en høykvalitets affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lite bibliotek av antistoffer for hvert ønsket mål. Etter en primær antistoff er valgt, er det også viktig å validere systemet for en rekke forskjellige bindende områder av protein målet eventuelt. Mot screening for forbindelser som forstyrrer analysen signalet som vist i figur 2C ved å utelate varme utfordring…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter infrastrukturstøtte fra vitenskap for livet laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne bekrefter også inngang og diskusjoner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.

Materials

Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. a. r. l. y. Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual [Internet]. , (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

Play Video

Cite This Article
Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

View Video