Summary
薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ イメージングを用いた創薬ターゲット婚約を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。
Abstract
目的の蛋白質ターゲットと小分子の相互作用を量的に表わす創、ターゲットの検証および化学プローブ検証にとって重要です。蛋白質ターゲットまたは小さい分子のままこの現象の測定方法は、技術的には難しいと思う特に貴重です。細胞熱シフト試金 (CETSA) は、細胞内のターゲットの関与を監視する技術のひとつです。ここでは、単一細胞レベルでの細胞内局在化を維持しながら高いスループット測定できますオリジナルの CETSA プロトコルの適応について述べる。このプロトコルは CETSA の化合物ターゲット相互作用、特に細胞の異種個体集団の詳細な特性評価申請に重要な進歩を提供するいますと考えています。
Introduction
開発新薬や化学プローブ ターゲット占有または生きているセル1,2,3への関与の測定と観察された薬理効果や機能的な読み出しをカップルが不可欠です。これらのデータが小分子実際に目的のターゲットに達することを確認して蛋白質ターゲット選択4、5の背後にある生物学的仮説を検証するために必要です。さらに、医薬品開発の間には複雑化のモデル システムは選択し、臨床試験の前に化合物鉛を裏付けるにされます。これらの前臨床システムの生物学の翻訳を確認するための創薬ターゲットの関与をトレースと付随するこの開発プロセス全体を通じて生物学の方法が重要です。
創薬ターゲット婚約伝統的 unfunctionalized 小分子や蛋白質、特に空間分解能6、7の単一細胞レベルで生きた細胞を監視するために挑戦されています。間の相互作用を観察する 1 つの最近の方法は、薬をそのまま、生きた細胞中のタンパク質は熱チャレンジへの応答でネイティブ蛋白質のリガンド誘導性の安定化、定量化された8、携帯電話熱シフト試金 (CETSA) 9,10。これが熱の挑戦への暴露後残りの可溶性タンパク質を定量化することでできます。CETSA の最初の開示、西部のしみの検出のため使用されました。早期発見キャンペーンを有効にし、大きい化合物コレクションのトリアージをヒット、CETSA 実験のスループットを増やすためにいくつか同種のマイクロ プレート ベースのアッセイ10,11の開発をリードしています。ただし、これらのメソッド 1 つの制限は、細胞懸濁液における化合物の治療に適しています現在最高検出セル換散、空間情報の損失につながるが必要です。CETSA がすることができます小さな分子の単一濃度または単一温度で蛋白質を安定させるために必要なリガンド濃度で実験加熱凝集温度 (Tagg) の配位子誘起シフトのいずれかとして適用します。後者は、等温線量応答指紋これら測定は特定の実験条件に依存性を示すために (ITDRF) と呼ばれます。
このプロトコルの目標は、付着細胞で CETSA を用いた高コンテンツ顕微鏡12蛍光 (IF) 抗体の検出のターゲットの関与を測定することです。この手順は、内局の保全とターゲットの関与の単一セルの定量化を可能にするのには、元の CETSA プラットフォームを拡張します。特に、多くの以前のレポートとは異なりこの手順では複合治療で実行されますライブの付着性のセル表面剥離有無により13の測定を目指して設立された結合平衡を保持熱挑戦前に洗濯。現在、メソッドは 1 つのターゲット蛋白質 p38α の検証 (MAPK14) のいくつかの細胞株、およびことこの手順を共有することによってテクニック広範に適用できる溶融プロテオームを越えてほしい。我々 は、このプロトコルはスクリーニングから医薬品開発パイプライン全体で合わせることができる、ターゲット婚約生体内での監視を通じてトリアージを見込んでいます。
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Protocol
1. 細胞の播種
注:ワークフローの一般的な概要については、図 1を参照してください。材料および試薬の詳細なリストはテーブルの材料で利用できます。
- 細胞の播種前に黒 384-well アッセイ プレート加熱ステップ中に後で皿の下敷きにされている空気の泡を避けるためにフレームに標準的なドリルで穴をあけます。このステップの間に井戸に入るプラスチック粒子を回避し、無菌状態を維持するために、粘着アルミ箔でプレートをシールまたはティッシュ文化フードの掘削前にプレートをカバーします。通常、各プレート (短辺) の側に 3.5 mm の直径の 3 つの穴で十分です。
- 層流ベンチを準備するには、70% エタノールで洗浄します。以下の標準的な無菌培養技術、セル フラスコまたは皿からメディアを削除します。5-10 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の細胞を洗浄し、フラスコに 2 mL のトリプシンを追加します。A-431 細胞を切り離すまでは、37 ° C でフラスコを孵化させなさい。Haemocytometer またはセルのカウンターを使用していずれかのセルをカウントします。50,000 セル/mL の培養液中の細胞懸濁液を準備します。
- バルク試薬ディスペンサーまたは実験の規模によって、マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートの各ウェルに細胞懸濁液 (ウェルあたり 2,000 セルの最終的な細胞密度を与える) の 40 μ L を分注します。簡単にプレートの底にセルを均等に分散する側からプレートを移動します。
- プレート エッジ効果を最小限に抑えるために層流フードの奥に室温で 20 分のアッセイ プレートの下部に解決するために細胞を許可します。次に、湿気のある大気を確保するため少し湿らせたペーパー タオルでプラスチック容器にプレートを置きます。使用前に 70% のエタノールでプラスチック容器を拭きます。
- 従来の加湿インキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 2 〜 3 日のアッセイ プレートとボックスを孵化させなさい。光顕微鏡による目視検査により評価した 50-75% まで細胞の密度を監視します。
2. 複合治療
- 実験の日、よくプレート ワッシャーを使用して各から媒体を吸引します。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。板ワッシャーが使用できない場合、切片屑トレーまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートの反転によって液体を削除できます。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。余分な液体が紙タオルで軽くたたくことにより削除されます。
- 細胞培養培地自動調剤を使用してまたは実験の規模によってマルチ チャンネル ピペットで充当の濃度に希釈して化合物の 30 μ L を追加します。各アッセイ プレート上のいくつかの井戸に負 (DMSO) と正 (知られている配位子) コントロールを追加することを確認します。これは熱シフト試金は、化合物の濃度が安定化タンパク質を観察する解離定数を超えている必要があります。したがって、化合物の濃度についての大まかな指針は 50-100 回 IC50が、ディスカッション セクションに化合物濃度のより詳細な説明があります。
注: セル行の DMSO を忍容性は、実験前にテスト必要があります。 - シール通気性のある板で化合物処理アッセイ プレート シールし、加湿のインキュベーターで CO2を 5% と 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
3. 熱チャレンジ
- まず、風呂の水を所望の温度に設定します。アッセイ プレートのウェル内に達し最終的な温度水のバスで最終の温度とは異なることに注意してください。ダミー プレートと熱電対温度計とオフセットを事前調査します。通常、所望の温度で安定するお風呂に 30 分かかります。
- 加熱ステップ中にアッセイ プレートの井戸に所望の温度が達されることを確認するためアッセイ プレートとして媒体の同じボリュームを含む封印されていないダミー プレートを準備します。
- インキュベーターからアッセイ プレートを削除します。通気性のあるシール離陸し、水浴の後の加熱時に、井戸に水が漏れないようにタイトな粘着アルミ箔複合処理細胞を含むアッセイ プレートを再シールします。プレート フレームの穴がアクセスできることを確認します。
- アッセイ プレートとダミー プレートを風呂の水でプレートの下から出て残りの空気を強制的に水面に向かって傾斜プレートの下部に配置します。
- 熱電対温度計を使用して新しいダミー プレートの井戸の中の温度を監視します。
- 熱で 3 分間湯せんアッセイ プレート。すぐに 5 分間クールダウン ルーム鍛えて水で別水槽にアッセイとダミー プレートを転送します。アッセイ プレートは、さらに処理の準備が整いました。
4. 固定
- バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートに直接 10 μ L 16% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を分配します。室温で 20 分間インキュベートします。
注: いくつかの定着剤は発がん性として分類され、機関の安全規則に従う必要があります。 - PFA ソリューションを吸引し、プレート ワッシャーを使用して 300 μ L の PBS のセルを洗ってください。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。
注: この手順は、プレートの洗濯機、液体は同時に分配され、削除のオーバーフロー プロトコルを使用して最適化されています。プレート洗浄機または同様の手順を使用できない場合洗浄のステップまたは手動で実行できます。 - プロシージャを洗浄マニュアル:井戸から液体を削除するには、廃棄物トレイまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートを反転します。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。マルチ チャンネル ピペットに 80 μ L の PBS を追加上記として再びプレートを反転、2 回洗濯の手順を繰り返します。最後の洗浄後、余分な液体を削除するきれいなペーパー タオルに対してプレートをしみ。
5. 透過
- 0.1% (v/v) NP 40 マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸の 20 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。(ステップ 4.2) 上記のように同じ手順を使用してセルを洗浄します。
- または、適切な場合、抗原検索のプロトコル、例えばに適用します。
- マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸に 1 %sds の 20 μ L を追加します。室温で 5 分間インキュベートし、(手順 4.2) 上記同じ手順に従って洗ってください。
- Ph 7.2 10 mM グリシンの 80 μ L を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。プレート ワッシャーに配置し、吸引プロトコルの選択によるプレート ワッシャー グリシン ソリューションを吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。
6 ブロック
- バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) の 15 μ L を追加します。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。
7. 一次抗体
- プレート ワッシャーに配置し吸引プロトコルを選択するプレート ワッシャーを使用してブロッキング液を吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。
- 適宜希釈した一次抗体の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸へ。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。
8. 二次抗体
- 一次抗体溶液を吸引し、(手順 4.2) 上記のように、同じ手順に従って洗浄します。
- アレクサ 488 二次抗体のに応じて希薄化後の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS で。室温で 1 時間インキュベートします。プレートは、光から保護するために粘着アルミ箔シールとシールします。
注: は、この中に光からプレートと後続の手順を保護します。
9. 核染色と細胞マスク
- マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 0.05 mg/mL に希釈して核の色素の 10 μ L を追加します。室温でさらに 10 分間インキュベートします。
- 二次抗体とヘキスト ソリューションを吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。
- 携帯マスク 200 ng/mL の PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に希薄化後の 10 μ L を追加します。室温で 30 分間インキュベートします。
- 細胞マスク液を吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。
- プレート洗浄機、バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してすべてのウェルに 60 μ L の PBS を調剤し、粘着アルミ箔でプレートをシールします。
10 画像集録および解析
- 3 蛍光チャネルを使用して高いコンテンツ撮像素子で画像をキャプチャ: DAPI (387/447)、GFP (472/520)、および TexasRed (562/624)。対物レンズ 10 倍を用いたあたり 4 枚の画像を取得します。オート フォーカス自動レーザーを使用し、集録時に合算 2 を適用します。メタデータと共に 16 ビット、グレー スケールの tiff ファイルとしてイメージを保存します。
- 利用可能なソフトウェアを使用して画像を分析します。DAPI (核) と TexasRed (細胞質) セル スコアリング アルゴリズムを使用して、セルの境界を識別します。
- さらにデータ解析のためのすべての取得した波長の平均強度を抽出します。
- アッセイの堅牢性を確保するため Z 係数を計算します。
- 計算する次の数式を使用して % 安定化: 100 * (1-(よく強度-平均よく強度ネガティブ コントロール) (平均強度肯定的な制御の平均強度ネガティブ コントロール)/)。ここで否定的な制御は DMSO と肯定的な制御の参照物質。各化合物の最大値と最小の安定強度を制御井戸の強度値の代わりに使用されることが化合物間の最大の安定化することができます異なります ITDRF 曲線の肯定的な制御より大きくなければ実際にので、.
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Representative Results
図 1で説明したプロトコルでは、残りの可溶性タンパク質の検出と付着性のセルで高いコンテンツ イメージングによる CETSA 試金を実行するための基本的なワークフローについて説明します。このワークフローは、化合物や試薬14プレート レイアウトを変更することによりアッセイ開発のすべての段階に容易に適応することができます。我々 はいくつかの予想は以下の場合を使用して期待どおりの結果を詳しく説明します。
抗体の同定と分析法の開発。成功した結果を得るのための前提条件は一次抗体または熱時に形成された集計と沈殿した蛋白の存在下で蛋白質のネイティブ形式を選択的に認識するその他の適切な親和性の試薬の同定手順 3 で挑戦します。ここで説明した CETSA イメージング測定を確立するには、52 ° C、正と負のコントロールとの間の信号のウィンドウで p38α をターゲット 9 抗体パネルで仕切った。最高の抗体を滴定し、知られている配位子 (肯定的な制御) と DMSO (マイナス コントロール) によって安定化された p38α の蛍光画像を図 2 a、B代表に示す条件に落ち着きました。抗体の認識もはリガンド結合 (図 2) が誘発されることがありますターゲット蛋白質のコンフォメーション変化によって中断されませんする必要があります。例として、BIRB796、オフ率、長いとターゲットの関与の定量化は、抗原検索ステップ (5.2; を適用することによってのみ可能でした。図 2 D)。利用可能な場合、ターゲット蛋白質の異なる結合部位をカバー知られている配位子を一次抗体の性能を検証することが重要です。抗原検索の手順と、抗体検証は好ましく行われます。
Taggと ITDRF 曲線。前述のように、2 つの異なるモード、agg曲線と ITDRF 実験 CETSA 実験を実行できます。変形は両方とも利用する同じ基本的なプロトコルとプロトコル セクション図 1に記載されています。最初のセットアップの目的は温度勾配を有する細胞に挑戦し、配位子濃度が単一の有無で Tagg曲線を比較です。Tagg曲線を実行するには、個別の刷版が温度範囲にわたって 3 分加熱します。この実験を実行すると、新しい温度に安定させるために風呂の水にかかる時間と各プレートの複合治療の長さを時間を計ることが重要です。この点では、風呂の水で熱チャレンジ ステップ実行は PCR 機でチューブを加熱するよりも時間がかかる。ITDRF 曲線を生成するため一定の温度で配位子の次の実行の濃度反応曲線が実験のパスです。一般的には、複数の化合物をテストするとき化合物添加のアッセイの準備ができているプレートを使用しております自動液体ハンドリング最も再現性のあるデータを達成するために。化合物、DMSO で連続希釈、希望濃度に細胞培養媒体に溶解されます。通常 11 ポイント 3 または 4 倍希釈、50-100 μ M から始まる一連の濃度をテストしましたが、これは配位子使用の効力に依存します。最初 Tagg曲線不在と配位子の存在の両方を確立し、曲線の間のシフトを観測できる後続等温実験のため温度を選択をお勧めします。選択した温度は、周りや Taggのすぐ上にする必要があります。両方の形式のターゲットの関与の確認を可能にするが、親和性化合物 ITDRF のランキングの実験は、しばしばより適しています。図 3 a Taggのカーブのための予想の定量化された結果を示したもの、図 3 bは、典型的な ITDRF の実験の結果を定量化します。
キャンペーンをスクリーニングします。プロトコルはターゲット蛋白質の小説のバインダーを識別するためにキャンペーンをスクリーニングに適合させることができます。この場合、特定の安定化化合物の ITDRF 実験に続いて単一濃度で化合物の数が多い等温熱課題が適用されます。我々 はアッセイ準備スクリーニング プレートを準備し、自動液体ハンドリングを使用してアッセイ プレート培地で希釈した化合物を転送します。すべての熱安定性アッセイと同様蛋白質安定化を観察する解離定数を超過する必要がある、従ってヒットの識別を容易にするために 50 μ M で小さな分子ライブラリを用いています。ランキングおよびこれらの化合物の優先順位付け、ITDRF を使用してヒットのトリアージは、後で。図 4は、スクリーニング プレートから代表的な結果を示しています。
図 1.この資料に記載されているプロトコルの概要。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.抗体の同定とアッセイ開発。A) A-431 細胞人間の p38α の検出のためのサンプル データ。陽性の代表的なイメージ (1 μ M AMG548) と負 (DMSO) コントロール。赤核ヘキスト染色、染色緑 p38α。10 X 倍率で撮影した画像白いスケール バーを表します 73 μ m。 B) 平均強度/セルとして表される数量のデータの例です。誤差範囲は、6 別板の 16 の複製の平均の標準誤差を表しています。各プレートは、湯せんの固定化細胞、透過とその後の免疫染色によって続いた 52 ° C に加熱しました。C) 蛍光信号強度測定 A-431 セルを扱う後 1 μ m BIRB796 または DMSO 前述の後直接に固定。加熱ステップのない場合は、BIRB796 信号は BIRB796 がこの抗体 p38α の検出を混乱させることを示唆している、DMSO 信号より低い。D) ITDRF 細胞CETSA曲線処理 BIRB796 (青い三角形) のいずれか (灰色の三角形) 抗原検索のプロトコルの有無。この図は、Axelssonら201812から変更されています。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.加熱凝集と ITDRF 実験します。A) 加熱凝集曲線実験細胞治療陽性 (1 μ M AMG548 オレンジ色で) 負の (灰色で DMSO) コントロールと。誤差範囲は、32 または 464 複製の平均の標準誤差を表しています。セルの 52 ° C で行われた B) ITDRFCETSA実験治療 SB203580 ブルー、グリーンの Skepinone L のシリアル希薄と赤で RWJ67657。誤差範囲は、6 の複製の平均値の標準誤差を表しています。定量化されたデータは平均強度/セルとして表される、それぞれの化合物の最高濃度に対して正規化します。この図は、Axelssonら201812から変更されています。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.10 倍の倍率でスクリーニング プレートの代表的な概要。ポジティブ コントロール (1 μ M AMG548) 2 と 24 列し、否定的なコントロール (DMSO) は、列 1 と 23。他のすべての井戸には、示されるいくつかのヒットをスクリーニングに使用ライブラリ化合物の 50 μ M が含まれています。インセットの数字では、画面の右下に白い線は、200 μ m を表します。この図は、Axelssonら201812から変更されています。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
結果のセクションで説明したように、方法は、いくつかのキー手順があります。まず、質の高い親和性の試薬を識別するために重要です。各ターゲットのための抗体の小さなライブラリをスクリーニングをお勧めします。一次抗体を選択すると、また適切な蛋白質ターゲットの異なる結合部位数のシステムを検証することが重要です。カウンター熱チャレンジを省略することによって図 2に示すように測定信号を妨害する化合物スクリーニング推奨されています。配位子の存在の減らされた信号を観測すると、抗原検索のプロトコル手順 5.2 で説明をテストできます。プレートの加熱ムラは、観測データの変動やプレートに変化を引き起こす可能性が。プレートが非定常熱チャレンジ (ステップ 3.4) 中に水浴中で部分的水中に沈むのでプレートの外側の井戸はお湯だけでなく、井戸の外側の壁からでも下部に公開されます。同じ水没時にエッジ効果をその後のプレートとプレートのウェルに高い温度があります。そのため、プレートのウェルを回避することをお勧めします。お湯と井戸の底の間の十分な接触を防止する加熱ステップ中にプレートの下の空気の泡が閉じ込められている場合、同様の効果を見てもすることができます。イメージング プレートを加熱に課題を与え、デバイスとプレート熱への露出、特に助けることができるこの方法を進めます。我々 はいくつかの細胞の使用を検討して、付着性のセルの種類熱チャレンジ後付着の変動を発見しました。私たちの研究室での実験は、Synthemax II SC やセル徳など塗膜または細胞外マトリックスの使用は細胞の剥離を最小限に抑えることが、これが技術的な課題となる半接続されたセルの種類を使用する場合にお勧めします。複合治療は生きているセルで実行される、ので小分子は細胞透過性である必要があります。膜透過性の化合物でない場合は、代替の高スループット CETSA 方法が推奨されます。いくつかの化合物は、バインドのターゲット蛋白質11代謝をアクティブ化する必要があります。このような場合は、長く治療細胞熱挑戦前に化合物の使用をお勧めします。
このプロトコルには、細胞イメージング ハイスループットス クリーニング キャンペーンを受けやすいことに播種から一枚の板が必要です。各実験のための細胞の数は西部のしみを達成することができるよりもはるかに低いまたは以前 AlphaScreen15の試金。さらに、洗濯や化合物の可用性とバインディングを変更するかもしれない、細胞剥離ステップが削除されます、熱チャレンジ ステップを通して確立された結合平衡を維持します。前のプロシージャとは異なり細胞毒性による信号の欠如、同時に染色性が核によって報告されています。最後に、イメージング細胞または細胞状態の混合集団でターゲット婚約測定を可能にする個々 の細胞の空間解像度を保持します。
本当にアプローチの適用性を評価、複数の溶解のプロテオーム手法を適用する努力が必要です。そのような実験は適切な親和性試薬、残りの存在下でネイティブ蛋白質の選択的にレポート変性、蛋白質が集計を識別する性を明らかにします。我々 は現在蛋白質の表現のレベルが信号ウィンドウを確実に測定する能力に影響を与えるを知らない。親愛の情、入手可能な抗体の選択性を反映し、低の豊富な蛋白質の蛍光アッセイで信号を高めるために使用されるテクノロジを適用と見積もってこれを見込んでいます。また、付けられた蛋白質または機能性化合物は、説明プロトコルの変更したバージョンの検出を使用できます。このプロトコルは溶けるターゲットとの相互作用の定量化可能な安定化を観察できます。たとえば、内因性リガンドは、外因性リガンドによるそれ以上の安定を防ぐことができます生きているセルの試金でタンパク質を安定化できます。ここで検討されていない、同時に複数のターゲットの研究を可能にする多重読み出しまたは下流のエフェクターをターゲットすることが可能であろうと考えています。さらなる研究その場でCETSA のこれらの側面を調査する必要です。
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Disclosures
著者があるレポートへの開示。
Acknowledgments
著者は、ライフ研究所、カロリンスカ研究所の科学からインフラストラクチャのサポートを認めます。著者には、入力、ミカエラ Vallin、マグダレナ Otrocka とトーマス ・ Lundbäck との協議も認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
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