Summary
Här beskriver vi ett protokoll för effektiv kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) av Brun fettvävnad (BAT) isolerad från en mus. Detta protokoll är lämplig för både kartläggning Histon ändringar och utreda genome-wide lokalisering av icke-histonglykoprotein proteiner av intresse i vivo.
Abstract
Den cellulära processer regleras av transkriptionell modulering av specifik gen program. Sådan modulering uppnås genom de kombinerade åtgärderna av ett brett utbud av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer medla transkriptionell aktivering eller förtryck via förändringar i kromatinstrukturen. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en användbar molekylärbiologi metod för mappning Histon ändringar och profilering transkription faktorer/kofaktorer bindning till DNA, vilket ger en ögonblicksbild av de dynamiska nukleära ändringar som inträffar under olika biologiska processer.
För att studera Transkriptionsreglering i fettvävnad, prover från in vitro- cellkulturer av förevigade eller primär cell linjer ofta gynnas i ChIP analyser på grund av överflödet av utgångsmaterial och reducerade biologiska variationen. Dessa modeller utgör dock en begränsad ögonblicksbild av tillståndet faktiska kromatin i levande organismer. Således finns det ett kritiskt behov för optimerade protokoll att utföra ChIP på fettvävnad prover från djurmodeller.
Här beskriver vi ett protokoll för effektiv ChIP-seq både Histon ändringar och icke-histonglykoprotein proteiner i Brun fettvävnad (BAT) isolerad från en mus. Protokollet är optimerad för att utreda genome-wide lokalisering av proteiner av intresse och epigenetiska markörer i BAT, som är ett morfologiskt och fysiologiskt olika vävnad bland fett depåer.
Introduction
Medan vit fettväv (WAT) är specialiserad för energilagring, avleder Brun fettvävnad (BAT) energi i form av värme på grund av dess förmåga att omvandla kolhydrater och lipider till värmeenergi via mitokondriell uncoupling1. På grund av denna specialiserade funktion krävs BAT depån för underhåll av kroppstemperatur i fysiologiska förhållanden och i svar på kalla exponering. Medan gen uttryck förändringar under BAT differentiering och vid termogena stress har studerats in vivo och in vitro-, har de molekylära mekanismerna bakom dessa förändringar varit mestadels dissekeras i förevigade cellinjer och primära före adipocyter, med undantag för flera studier i2,3,4,5.
Reglering av specifik gen uttryck program via Transkriptionsreglering uppnås genom samordnade förändringar i kromatin struktur via olika transkription faktorer och samtidig faktorer åtgärder. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en värdefull molekylärbiologi tillvägagångssätt för att undersöka rekrytering av dessa faktorer till DNA och för profilering de tillhörande ändringarna i kromatin landskap. Nyckelfaktorer för framgång för ChIP experiment inkluderar optimeringar av crosslinking villkor och kromatin klippning konsekvens i hela olika prover, tillgången på lämpliga utgångsmaterial och, framför allt, kvalitet av antikroppar. När du utför ChIP från hela vävnader, det är också viktigt att överväga heterogenitet av proverna och optimera protokollet för att förbättra effektiviteten av atomkärnor isolering, med den senare är ett särskilt känsliga steg när du arbetar med fettvävnad på grund den förhöjda fetthalten. I själva verket molekylär isolering tekniker från hela fett depåer försvåras av närvaron av höga nivåer av triglycerider och protokoll måste vara optimerad för att öka mängden av kromatin isolering. Slutligen, när hög genomströmning sekvensering utförs efter ChIP-DNA isolering, sekvensering djupet är avgörande för att fastställa antalet toppar som upptäcks tryggt.
Här hänvisar vi till arbetsstandarder och allmänna riktlinjer för ChIP-seq experiment rekommenderas av koda och modENCODE konsortier6 för bästa praxis, och vi fokuserar på en stegvis beskrivning av ett protokoll som optimerats för ChIP-seq från BAT. Protokollet beskrivs möjliggör effektiv isolering av kromatin från fettvävnad att utföra genome-wide sekvensering av DNA-bindande faktorer med väldefinierade toppar samt Histon märken med mer diffusa signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurhantering stegen i protokollet har godkänts av Boston universitetets institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC).
1. dag 1: Dissection och utarbetande av BAT för kromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- Euthanize möss använder en koldioxid (CO2) kammare och utföra dissektion omedelbart efteråt. Spray mus päls med 70% etanol innan snittet. Placera musen med ryggen uppåt, sedan skar upp huden längs halsen. Leta upp BAT direkt under huden mellan skulderbladen (interscapular, det verkar som två lober, butterfly-formade, med ett tunt lager av vitt fett som måste vara noggrant bort7).
Obs: Efter en 3 månader gammal C57BL/6J mus som matas en regelbunden chow kost (Musens vikt på detta åldersintervall mellan 27 och 30 g), är varje BAT-LOB ca 1 cm lång. Den totala vikten av BAT depån är ca 0,15 g i såväl kvinnliga som manliga möss. - Använd 1 BAT pad för 3 marker. Flera BAT kuddar kan bearbetas samtidigt tills ultraljudsbehandling.
- Crosslink varje BAT pad i 10 mL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% formaldehyd i 15 min roterande på 150 rpm vid rumstemperatur (RT).
- Släcka crosslinking genom att lägga till 2,5 M glycin till en slutlig koncentration på 125 mM för 5 min, roterande på 150 rpm på RT.
- Överför den BAT pad till 500 µL hypoton lyseringsbuffert (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) och tillsätt 2 rostfritt stål pärlor (storlek: 3,2 mm diameter, se Tabell för material) för varje BAT pad. Använda en pärla-baserade vävnad Homogenisatorer (se Tabell för material) för att strimla vävnaden.
- Börja med 5 min vid max effekt. Vid behov förlänga tiden tills vävnaden är homogeniserad och enstaka celler separeras. Över proverna till ett nytt rör och centrifugera vid 4 ° C vid 16 000 x g under 10 minuter.
- Efter centrifugering, överför supernatanten till en ny tub och hålla cellpelleten på is. Centrifugera supernatanten vid 4 ° C vid 16 000 x g i 10 min för att förhindra förlust av flytande celler. Avlägsna slutliga supernatanten och återsuspendera båda cell pellets tillsammans i 300 µL SDS lyseringsbuffert (SDS 1%; EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) med 1 x proteashämmare (se Tabell för material). Inkubera på is i 10 min.
- Sonikera i lysates för att generera DNA fragment 200 – 500 baspar lång. Efter ultraljudsbehandling, ta bort skräp genom centrifugering för 10 min vid 16 000 x g vid 4 ° C och kontrollera framgången av ultraljudsbehandling via DNA elektrofores på en 1% agarosgel. För en medelstor gel, kör vid 120 V; en god separation uppnås efter 45 min.
Obs: Ultraljudsbehandling optimering kan krävas för att uppnå rätt storlek av fragment. Med den valda någon sonikator (se Tabell för material), detta kräver 2 gånger på 320 W uteffekt och 20 KHz frekvens för 10 min, med cykler av 30 s på/30 s off. - Späd den supernatant bråkdel 10-faldig (slutlig volym är 3 mL för varje BAT pad) i ChIP förtunningsbuffert (SDS 0,01%. Triton 1,1%; EDTA 1,2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) med 1 x proteashämmare. Hålla undan 1% av denna kromatin lösning (motsvarar 30 µL för 3 mL) som ChIP ingång. Hålla ingångarna över natten vid 4 ° C (tills steg 2,4).
Obs: Ovanstående fraktionen kommer att ge ingående referensen för relativ kvantifiering av immunoprecipitated material jämfört med mängden DNA i varje prov före immunoprecipitation. - Lägg till ChIP antikroppen (se Tabell av material för de antikroppar som används här som ett exempel) 1 ml av kromatin lösning och inkubera över natten vid 4 ° C med rotation. Utföra parallella immunoprecipitation med motsvarande före immun IgG, om tillgängligt, eller normala IgG av samma art (t.ex., regelbunden kanin IgG om antikroppen produceras i en kanin). Alternativt kan du spara 1 mL kromatin lösning för en no-antikropp-kontroll.
Obs: Den optimala mängden antikroppar bör bestämmas experimentellt för varje ny antikropp, om antikroppkoncentrationen inte är känd. Annars är 2 – 5 µg av antikropp en rimlig utgångspunkt att använda. Använd ChIP-grade antikroppar när så är möjligt, eller antikroppar som har validerats för immunoprecipitation.
2. dag 2: Samling av immunkomplex
- Tillsätt 50 µL av Protein A agaros 50% flytgödsel till immunkomplex och inkubera i 1 h vid 4 ° C med rotation 150 rpm.
-
Pellet pärlorna genom centrifugering för 1 min vid 100 x g vid 4 ° C. Utföra sekventiella tvättar av pärlor med buffertar öka stringens.
- Tvätta först, med låg salthalt tvättbuffert (150 mM NaCl. Tris-HCl pH 8, 20 mM. EDTA 2 mM; Triton-X 1%. SDS 0,1%), därefter med hög salthalt tvättbuffert (500 mM NaCl. Tris-HCl pH 8, 20 mM. EDTA 2 mM, Triton-X1%; SDS 0,1%), därefter med LiCl wash (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%. deoxicholate 1%), och slutligen med 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- Utföra alla tvättar på 0,45 µm PVDF centrifugal filtrera kolumner (Tabell för material) med första överföra pärlorna i kolumnerna använder 500 µL låg salthalt tvättbuffert. Pellet pärlorna i kolumnerna för 3 min vid 2 500 x g. Kassera genomströmmande och upprepa 1 gång för alla tvätta buffertar som anges i steg 2.2.1.
- Efter tvättarna är slutförda, eluera immunkomplex genom att lägga till 300 µL av eluering buffert 1% SDS, 0.1 M NaHCO3) till pelleterat pärlorna i kolumnerna. Inkubera vid RT i 30 min på en shaker vid 400 rpm. Samla eluatet genom spinning kolumnvis i 3 min vid 2 500 x g i en färsk tub.
- Vända antipyridinantikropp genom ruvning i eluatet och insatsvaror som samlats in i steg 1,9 vid 65 ° C under natten.
3. dag 3: Återvinning av DNA med fenol/kloroform utvinning
- Tillsätt 300 µL av fenol: kloroform: IAA, 1:1 till eluatet och ingångar. Virvel för 10 s.
- Snurra vid 4 ° C i 15 min på 21 000 x g. Överför supernatanten till en frisk slang. Tillsätt 3 µL av glykogen, 30 µL 3 M natriumacetat och 750 µL kallt 100% etanol. Vortex 10 s. Store vid-80 ° C i 2 h.
- Snurra ner vid 21 000 x g vid 4 ° C i 20 min, hålla pelleten och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 1 mL kall 70% EtOH och sedan varva ner vid 21 000 x g vid 4 ° C i 5 min. avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten.
- Återsuspendera pelleten i 70 µL av DNAS-gratis vatten.
- Fortsätt till steg 4 för att testa kromatin beläggning på specifika genomisk regioner genom kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) eller till steg 5 att förbereda prover för sekvensering.
4. analys av ChIP med qPCR (Single/Multiple gener avläsning)
- Späd input DNA från steg 3,4 att generera en standard referenskurva. Seriespädningar av 1/10, 1/100, 1/1000 är vanligen tillräckligt för att fånga det linjära området och ytterligare utspädningar kan behövas för mer koncentrerad prover.
- För varje primer par (här, vi har använt primers inriktning NDUFV1 och TOMM20 initiativtagare), förbereda två uppsättningar av qPCR reaktioner: en med de utspädda input proverna från steg 4.1, och en andra med de DNA-prover som isolerats av immunoprecipitation från steg 3,4. Utför varje reaktion i tre exemplar.
Obs: Reaktioner kan inrättas parallellt för flera gener med 96 - eller 384 brunnar. - Ställa in en reaktionsvolym av 10 μl per brunn med 5 μL av 2 x PCR mix (Tabell för material), blanda 1 μL av primer (1 μM framåt primer och 1 μM reverse primer), och 4 μL av DNA från ChIP (eller ingående kontroll).
- Kort snurra ner plattan.
- Kör qPCR reaktionerna på en realtids PCR-system med hjälp av protokollet som rekommenderas av tillverkaren för reagens upptäckt (Tabell för material). Här har vi använt följande villkor: 1) 1s vid 95 ° C i 1 cykel; (2) 1 s vid 95 ° C följt av 20 s vid 60 ° C för 45 cykler; (3) 15 s vid 95 ° C följt av 60 s vid 60 ° C följt av 15 s vid 95 ° C i 1 cykel.
Obs: Kolla kurvan dissociation: närvaron av en topp i termisk dissociation tomten föreslår en enda amplikon genereras av PCR-reaktionen. Om mer än en peak är visualiseras, är detta potentiellt vägledande av flera, icke-specifik amplikoner; i så fall rekommenderar vi utformningen av alternativa primer par. - Avgöra den linjära fasen av exponentiell förstärkning av PCR-reaktionen för varje primer som beräkning av standardkurvan med serien av utspädda genomiskt DNA i steg 4.1. enligt värdet Ct (cykel tröskel).
- Om Ct värdet av DNA från ChIP och Inspelningsvolym är inom det linjära utbud av Ct-värdet, beräkna anrikningen av DNA från ChIP i förhållande till input, enligt utspädningsfaktorn för DNA från ChIP och inmatningskontroll i steg 4.1.
5. amplifiering av DNA från ChIP för High-throughput sekvensering (Genome-wide avläsning)
Obs: Detta steg kan outsourcas till en akademisk core eller kommersiella sekvensering företaget när sekvensering funktioner inte är tillgängliga internt.
- Förbereda ett DNA-bibliotek från den extraherade DNA med en rätt ChIP bibliotek förberedelse kit (se Tabell för material) efter tillverkarens anvisningar.
- Sekvens i biblioteket på en hög genomströmning sekvensering system, med 50 bp single-end som avläsning (se Tabell för material).
Obs: Enligt ChIP-seq riktlinjer föreslås av koda6, rekommenderas ett minimum av 10 miljoner läser för däggdjur genomen.
6. rådata analys
- Utföra kvalitetskontroll på raw sekvensering läsningar med FastQC8.
Obs: Gemensamma sekvensering kvalitet mått inkluderar per bas sekvens kvalitet, per bas sekvens innehåll, per sekvens GC innehåll, sekvens längd och sekvens dubbelarbete nivåer. I allmänhet en Läs kvalitet poäng av Q > 30 över varje spelcentrum är tecken på hög kvalitet sekvensering resultat. Distribution av GC innehåll över alla läsningar bör grovt likna en normal distribution, med en topp centrerad kring artens faktiska genomisk GC innehåll procentandelen. - Ta bort eventuella sekvensering adapter kontaminering och låg kvalitet läser igenom Läs trimning verktyg Trimmomatic9.
Obs: Genomförda standardparametrar ange avlägsnande av plattform beroende adaptrar, borttagning av inledande och avslutande låg kvalitet baser, och användning av en 4-base bred skjutfönstret att trim läser när den genomsnittliga kvaliteten per bas sjunker under ett angivet tröskelvärde. - Anpassa bearbetade läsningar till mus MM10 referens genomet10 Bowtie2 aligner11 standardparametrar.
- Filtrera justerad läser genom att ta bort dem med en Bowtie2 mappning kvalitet poäng (MAPQ) av mindre än 10 använder Samtools12.
- Bestämma olika efter justering kvalitet mätvärden såsom procent läser mappas, strand cross-korrelation, kumulativa Läs täckning och prov replikera reproducerbarhet.
Obs: Olika paket inklusive SPP13, ChIPqc14, och Deeptools15 finns att beräkna dessa kvalitet mätvärden. - Utföra peak anropande analys med en ingående kontroll eller lämpliga KO prov med hjälp av Mac-algoritm (MACS2)16 med standardparametrar.
- Ta bort eventuella kallas toppar som överlappar med kända svartlistade regioner17 från mm10 anteckningen med Bedtools18.
Obs: Svartlistade regioner är områden i genomet som har visat sig ha hög signal eller Läs räknas oberoende av cellinje eller sekvensering teknik. Dessa regioner Visa konstlat höga artefakt signaler i vissa regioner i genomet som kan filtreras ur funktionell genomisk sekvensering experiment. Alla replikat bör behandlas självständigt genom rörledningen och kan sedan användas för irreproducibility discovery rate (IDR). IDR är anställd att mäta reproducerbarheten för resultaten mellan replikat genom metoden som beskrivs av Li, Brown, Huang och Bickel19,20. Metoden IDR kvantitativt bedömer överensstämmelsen mellan replikat och rekommenderas av koda och modENCODE som en del av deras ChIP-seq riktlinjer. - Använda statistiskt signifikant toppar för olika nedströms analyser såsom gene ontology21,22, anrikning eller motiv analys23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: ChIP validering av qPCR. ChIP-qPCR-analys av representant GPS2 rikta gener NDUFV1 (vänster) och TOMM20 (höger) i BAT WT och GPS2-AKO möss, visar relativa förändringar i nivån på H3K9 metylering och GPS2 och Pol2 bindande. Stolpdiagram representerar medelvärdet av 3 replikat med * p < 0,05 och ** p < 0,01 beräknat med Students t-test. Denna siffra är modifierad från Cardamone et al.2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Exempel av ChIP-qPCR med BAT isolerade från WT eller GPS2-AKO möss visas i figur 12. Efter att ha konstaterat att GPS2 krävdes för uttrycket av kärn-kodade mitochondrial gener i olika cell linjer2, testade vi rekrytering av GPS2 på två specifika kärn-kodade mitochondrial gener, NDUFV1 och TOMM20, i BAT från möss som ett exempel på en vävnad höganrikat i mitokondrier. Vi jämförde först GPS2 arrangören beläggning i GPS2-AKO möss och vildtyp littermates, observerar en förväntad minskning GPS2 bindande för selektiv målgener i BAT från GPS2-AKO möss. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, in vi också ökad bindning av RNA-polymeras 2 (Pol2) och varumärket repressiva Histon H3K9me3 BAT från GPS2-AKO möss jämfört med vildtyp littermates. För alla antikroppar var bindningen betydande jämfört med den bakgrund signal observerats i stickprovet som IgG. Dessa resultat bekräfta rekrytering av GPS2 på valda kärn-kodade mitochondrial gener och visa att GPS2 är krävs för att förhindra ansamling av H3K9me3, och därmed krävs för den stannat av Pol2 transkriptionell aktivitet på target initiativtagare. Se Tabell för material för mer detaljer om antikropparna och den ursprungliga publikationen för ytterligare data och mer övergripande diskussion av dessa resultat2.
Figur 2: tomt på kvalitet noter från raw sekvensering läsningar isolerade från BAT. (A) kvalitetsresultat återspeglar en förutsägelse av sannolikheten för ett fel under base-ringer. Det uttrycks vanligen som ett heltal, Q = - 10log10(P), i vilken P är sannolikheten att ett fel i base-kallelse. Visas ovan är en per bas sekvens kvalitet tomt som genereras av FastQC baserat på rå, obearbetade sekvensering läsningar genereras från BAT. (B), GC innehåll distribution av läser efter adapter avlägsnande och Läs trimning från BAT prover. GC innehåll bör grovt likna en normalfördelning med en topp centrerad kring artens faktiska bråkdel av GC genomisk innehåll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2, sekvensering kvalitet noter visas på en per bas nivå, och läser får vidarebehandlas genom trimning någon kvarstående adapter kontaminering och ta bort läser om genomsnittliga kvalitetsresultatet över en skjutfönstret sjunker under en angivna tröskelvärdet. Också visat är GC innehållsdistributionen över läser efter adapter avlägsnande och Läs trimning. Sekvens kvalitet och GC innehåll distribution är två allmänt brukade mätvärden utvärdera nästa generations sekvensering data innan computational analyser utförs. Dessa resultat visar att protokollet ger en tillräcklig mängd högkvalitativa kromatin isolerade från BAT som är kompatibel med nedströms nästa generations sekvensering teknik.
Figur 3: normaliserade pamp-filer som genereras från ChIP-seq data från BAT WT och GPS2-AKO möss. Denna figur visar normaliserade Läs täckning längs den Slc25a25 genen locus med en betydligt kallas topp i regionen arrangören. GPS2 visades att reglera uttrycket av kärn-kodade mitochondrial gener genom att ändra tillståndet kromatin i målet gen promotorer. Dessa resultat visar visualisering av en betydligt kallas topp på en representativ kärn-kodade mitokondriella genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Visas i figur 3 är pamp spår av WT och GPS2-AKO anpassade BAM filer normaliserade till 1 x djup (läsningar per genomet täckning) som genomförts i deepTools. Visas är förekomsten av en statistiskt signifikant topp ligger i regionen arrangören av mitokondriella genen Slc25a25. Normaliserade spåren tillåta visualisering av berikning av läsningar motsvarar kallas topp och minskningen av läser på den här platsen i BAT GPS2-AKO möss i förhållande till vildtyp littermates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här representerar ett värdefullt verktyg för att utföra ChIP från murina vävnader, särskilt optimerat för Brun fettvävnad. En av de största utmaningarna i utföra ChIP från vävnad återhämtar sig ett tillräckligt antal celler under provberedning. Klippning BAT med en vävnad Homogenisatorer mixer tillsammans med rostfritt stål pärlor istället för en kanonisk glas mortelstöt avsevärt minskar antalet celler som förloras på grund av obruten vävnad. Dessutom hjälper homogenisering vävnaden direkt i en hypoton buffert frisläppandet av lipider som sedan lätt kan separeras och bort från atomkärnor via höghastighets centrifugering.
Ordentlig ultraljudsbehandling är också kritisk för att utföra konsekvent och reproducerbart ChIP analyser. Användning av ett vatten bad ultra-någon sonikator möjliggör samtidig bearbetning av flera prover, därmed förbättra reproducerbarheten av kromatin klippning och minskar risken för korskontaminering av provet. Dessutom minskar användningen av tempererad ultraljudsbehandling system överhettning av proven, som bör undvikas för att förhindra prov försämringen och förlusten av epitop erkännande av antikroppen (se Tabell av material för detaljer).
En annan utmanande steg är återvinning av immunoprecipitated komplex. Magnetiska pärlor är ofta att föredra för det här steget eftersom de möjliggör snabbare och effektivare tvättar när den används tillsammans med en magnetisk rack. De har dock en lägre frekvens av DNA återhämtning jämfört med Protein A agaros, vilket kan vara en allvarlig begränsning när du arbetar med liten mängd utgångsmaterial. Vi tycker att kombinationen av Protein A agaros flytgödsel med PVDF 0,45 µm centrifugal filtrera kolumner är en bra lösning för att uppnå maximal DNA avkastning med minimal tvätt tid och högre reproducerbarhet.
Angående DNA isolering, gott om kolumner-baserade DNA isolering Kit kan användas. Vår erfarenhet är en begränsning med denna metod kolumnerna förmåga att ha en effekt på avkastningen av DNA återhämtning. För att lösa problemet, föredrar vi att använda en mer traditionell metod som fenol/kloroform för DNA-extraktion.
Rörledningen börsnoterade ChIP-seq innehåller ett antal allmänt accepterade verktyg och hjälpmedel för nästa generations sekvensering experiment. Kortfattat, läser utsätts för grundläggande kvalitetskontroll med hjälp av FastQC och Trimmomatic, då anpassas till mus MM10 genomet med Bowtie2. Överlevande läsningar filtreras genom att kartlägga kvalitet innan de används för peak samtal genom den MACS2 algoritmen. Det bör dock noteras att andra tillgängliga och validerade verktyg kan också användas beroende på vilken typ av experiment och data som genereras. Användning av någon anpassade parametrar under förbehandling, justering eller peak samtal kan också vara lämpligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
