Summary
현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.
Abstract
지방이 많은 직물은 높은 소성으로 중요 한 변화 기관 이다 이며 환경 자극 및 영양 상태에 반응. 따라서, 다양 한 기법 형태학 및 지방이 많은 직물의 생물학 연구 개발 되었습니다. 그러나, 기존의 시각화 방법을 공부 전체 기관의 3D 아키텍처를 캡처를 2D의 섹션에서 조직으로 제한 됩니다. 여기에 우리가 전체-마운트 현재 얼룩, 최소한의 처리 단계를 그대로 지방 조직 형태를 유지 하는 immunohistochemistry 메서드. 따라서, adipocytes 및 다른 세포 구성 성분의 구조는 조직의 가장 대표적인 3D 시각화를 달성 하는 왜곡 없이 유지 됩니다. 또한, 전체 마운트 얼룩 세포 운명 결정을 결정 하는 계보 추적 방법 결합할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지방이 많은 직물의 더 깊은 부분에 관한 정확한 정보를 제공 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 한계를 극복 하기 위해 전체 산 얼룩이 지 수 추가와 결합 될 조직 기법 조직의 불투명 함 제거 하 고 빛-시트 형광 현미경을 사용 하 여 전체 지방 조직 해부학의 완전 한 시각화에 대 한 허용을 삭제. 따라서, 더 높은 해상도 지방 조직 구조의 더 정확한 표현을 이러한 기술의 조합으로 캡처할 수 있습니다.
Introduction
지방 조직 에너지 저장에 대 한 필수적인 장기 이며 동적 개장 및 거의 무제한 확장1특징 이다. 에너지 항상성, 지방 조직 또한 담당 한다 필수적인 역할 50 adipokines2전체 신체 신진 대사 기능 조절 하는 호르몬 분 비에. 지방 조직 성숙 adipocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 면역 세포, 및 체형 조상 세포3를 포함 하 여 다양 한 세포 유형의 다양 한 아키텍처 구성 하고있다. 최근 연구는 비만 다른 대사 장애 크게 변경할 수 지방 조직 기능 및 그것의 microenvironment, 포함 하지만 adipocytes, 염증 세포의 침투의 확대에 국한 되지 않습니다 (예: 대 식 세포), 및 관 역 기능3.
조직학, cryosectioning 등 기존의 형태학 기법 설명 조직 수축 및 구조 왜곡3로 이어질 수 있는 긴 화학 처리 단계와 같은 많은 생물학을 공부 하 고 몇 가지 제한 4. 또한, 이러한 2D 기술을 얻은 섹션은 전체 조직을3의 작은 지역에 한정 된 다른 세포 유형에 의해 발휘 된 세포 상호 작용을 관찰 충분 하지 않습니다. 기존에 비해 형광 이미징 방법, 전체 마운트 얼룩 단계가 필요 없습니다 추가 침략, 등 포함, 단면, 탈수; 따라서,이 항 체 특이성을 감소의 문제를 방지 합니다. 이와 같이, 체형 형태 및 전반적인 지방 조직 구조5의 더 나은 보존 이미징 지방 조직에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법입니다. 따라서, 전체 마운트 얼룩으로 신속 하 고 저렴 한 immunolabeling 기법 지방 조직 3D 아키텍처1,6,,78을 유지 하기 위해 설립 되었다.
그러나, 전체 마운트 얼룩의 사용과 지방이 많은 직물 형태학의 보존에도 불구 하 고이 기술은 조직의 지질 표면 아래 내부 구조 시각화 수 아니다. 몇몇 최근 연구9,10 조직 지방 조직 내에서 포괄적인 3D 시각화 수 있도록 전체 마운트 immunolabeling1,6 와 결합 하는 기법을 삭제를 설립 했다. 특히, 조밀한 신경 및 맥 관 구조 네트워크 최근 연구9,10,,1112 3D 볼륨 영상과 시각화 했다. 실제로, 다른 생리 적인 조건 하에서 지방 조직의 신경 및 혈관 소성을 공부 하 고 그것의 생물학을 공부 필수적 이다. 솔벤트 허가 기관 (iDISCO +) 조직 비운의 3-차원 영상 Immunolabeling 사용은 비운의 유기 화학 시 약 dichloromethane (DCM와 불투명 함 조직 그리고 메탄올 전처리, immunolabeling의 구성 과정 )와 dibenzyl 에테르 (DBE)13,14. 지방 조직을 투명 하 게 함으로써, 혈관과 신경 섬유 등 조직 내의 해부학의 더 정확한 표현9,10얻을 수 있습니다. IDISCO + 장점이 그것은 다양 한 항 체와 형광 기자11,14, 그리고 여러 장기와 심지어 embryoes14에서 성공을 보여주었다. 그러나, 그것의 주요 제한은 있는 18 ~ 20 일 전체 실험을 완료 하는 데 필요한 긴 보육 시간입니다.
전체 산 얼룩의 또 다른 중요 한 응용 프로그램 계보 추적 시스템와 함께에서 셀 운명의 시각화 이다. 계보 추적 모든 딸 세포에 전달 될 수 있다 고15시간 이상 보존 하는 셀에는 특정 유전자/마커 라벨입니다. 따라서, 셀의 자손15의 운명을 결정 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 1990 년대 이후, Cre LoxP 재조합 시스템 생활의 혈통 추적에 대 한 강력한 접근 되고있다 유기 체15. Cre, DNA recombinase 효소를 표현 하는 마우스 선을 loxP-정지-loxP 시퀀스에 인접 한 기자를 표현 하는 다른 마우스 라인 넘은, 기자 단백질 표현된15입니다.
전체-마운트 얼룩에 대 한 형광 색 기자 들의 사용은 세포내 활동 체형16의 최소한의 간섭에 대 한 허용 하기 때문에 지방이 많은 직물의 이미징 적합 합니다. 그러나, 전통적인 기자는 일반적으로 제한 된 세포질 콘텐츠17흰색 adipocytes의 계보를 추적 하 고 어려운 세포질, 얼룩. 이 문제를 해결 하려면 막 도약 형광 tdTomato/막 eGFP (mT/mG) 기자 마커를 사용 하 여 이상적인 도구입니다. 막-타겟 tdTomato Cre 음수가 셀18로 표시 됩니다. Cre 절단 시 막 대상 eGFP 식 스위치,이 기자 체형 창시자17,18 (보충 그림 1)의 계보를 추적에 대 한 적당 한 만드는 발생 합니다.
이 문서의 목적은 전체 마운트 얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 결합 하 수 다른 기술을 개발 및 지방이 많은 직물의 생리학을 공부 하는 방법을 보여 것입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 응용 프로그램의 두 가지 예는 1) 멀티 컬러 기자 마우스 라인 adipocytes 2) 조직 흰색 adipose 조직 (WAT)에 신경 arborization 추가 시각화를 비운의 다양 한 출처를 식별 하는 사용.
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Protocol
Phenogenomics (TCP) 동물 관리에 캐나다 위원회의 표준 준수에 대 한 모든 실험 동물 프로토콜 센터의 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 명암 주기 12 h에 유지 하 고 물과 음식에 대 한 무료 액세스와 함께 제공 했다. 7 달 오래 된 C57BL/6J 남성 쥐 전체 마운트 착 실험에 사용 되었다.
참고: 섹션 1 ~ 2 시간 순서 대로, 섹션 3 직후에 제 1 단계는 선택적 되 고 있습니다. 제 4 섹션 2 완료 후 체형 크기와 혈관 밀도 분석을 수행할 수 있습니다.
1. 재료 준비와 조직 분리
- 신선한 1 %paraformaldehyde (PFA) 조직 고정을 위한 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에 희석을 준비 합니다. 0.3% 비 계면 활성 제 1 x PBS에 희석을 준비 (라 함 PBS-0.3T) 세척 단계 후속 조직에 대 한.
참고: 각 조직에 대 한 준비 1%의 약 1.5 mL PFA 완전 침수를 위해. 고정 볼륨 증가 또는 조직 크기에 따라 감소 될 수 있습니다.
주의:이 단계는 PFA는 부식성과 독성 유해. 착용 개인 보호 장비 (예: 니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 신발, 보안 경) 그리고 증기 두건에서 핸들. - (예를 들면, 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 질 식) 승인 된 절차에 따라 동물 안락사 지체 없이, 원하는 지방 조직 창 고 (예를 들어, 사 타 구니 백색 지방 조직 또는 perigonadal 백색 지방이 많은 직물)18를 해 부.
- 해 부가 위 잘라 조직 100 x 15 m m2 페 트리 접시에 조각 약 0.5-1 ㎝ 크기, 그리고 1% 가득 microcentrifuge 튜브에서 그들을 담가 PFA. 얼음에 계속.
2. 전체 산 백색 지방이 많은 직물의 얼룩
- 해 부 완료 되 면 1%에서 조직 샘플을 이동 PFA 얼음에서 룸 온도 (RT) 1 h를 다음 빨리 세척에 대 한 12 또는 24 잘 셀 문화 접시에 조직을 전송.
- PBS 가진 조직 세척-0.3T, 5 분 속도으로 분 당 20-25 젖 힌 채 22 °, 기우 하는 통에 RT에서 각각에 대 한 3 번.
참고: 뿌리의 사용을 포함 하는 모든 후속 단계에 대 한이 기울기 및 속도 사용 합니다.
참고: 다 색 기자 마우스 선 산/mG 및 추가 사용 하는 경우 항 체 염색 법은 필요 하지 않습니다, 조직 현미경 검사 법에 대 한 준비 단계 2.2. - 0.5-1 추가 mL 차단 버퍼 (PBS에 희석 5% 동물 혈 청-0.3T). 셰이 커에 접시를 넣고 실시간 1 시간에 대 한 품 어
- 차단 솔루션 발음 및 추가 PBS에 희석 하는 주 항 체-1% 동물 혈 청으로 0.3T.
- 장소 접시 4 ° C에서 통에 하룻밤.
- 다음 날 씻어 PBS 가진 조직-5에 대 한 3 번 0.3T 실시간에 각 분
- PBS에 희석 적절 한 2 차 항 체를 사용 하 여-0.3T. 0.5-1 추가 mL 이차 항 체 솔루션을 각 영역. 접시 알루미늄 호 일에 포장 하 고 실시간에 1 시간 동안 통에 품 어
참고: photobleaching를 방지 하기 위해 어둠 속에서 이차 항 체 희석. - 이차 항 체 외피 후 PBS로 세척-실시간에서 각각 5 분 동안 두 번 0.3T 이미지 샘플 중립 지질 얼룩이 적절 하지. 지질 작은 물방울의 경우 5 분 두 번, (비 이온 계면 활성 제) 없이 1 x PBS로 세척 얼룩 중립 지질을 사용 하 여 필요.
- 세척 단계 후 1:1500 희석 요인이 실시간에서 30 분 1 x PBS에 희석 중립 지질 얼룩으로 품 어 조직은 현미경 검사 법에 대 한 준비가 지금입니다. 미래의 영상에 대 한 조직 4 ° C에이 솔루션에 저장할 수 있습니다.
참고:; 시간이 지남에 감소 품질 이미징 따라서, 이미지에 대 한 최고의 시간 1 또는 2 일 이내입니다. - 집게를 사용 하 여 조직 24 x 60 m m ² 유리 coverslip에 평면을 거꾸로 공초점 레이저 현미경 시스템에서 그것을 배치.
- DAPI와 핵의 얼룩을 원하는 경우 DAPI 완전히 조직 잠수함 건조에서 그것을 방지를 포함 하는 설치 매체의 1-2 방울을 추가 합니다.
- 전체-마운트 얼룩진 조직에서 여러 개의 초점 비행기의 이미지를, μ m 4-6 단계-원하는 확대 크기와 깊이에 Z-100-150 μ m의 더미를 수행 합니다.
3. 조직 개간 및 Immunolabeling를 사용 하 여 iDISCO +
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 절차9,,1019에 기반.
- 고정 및 메탄올 전처리
- 4 %PFA 하룻밤 2 mL microcentrifuge 튜브에에서 4 ° C에서 1 x PBS에 희석에 티슈를 품 어.
참고: 영상까지 모든 다음 치료에 대 한 2 mL 튜브에 조직의 떠나. - 다음 날, 1 시간 각 실시간에 셰이 커에 대 한 1 x PBS에 조직 세 번 씻어
참고:이 단계 RT 또는 4 ° C에서 하룻밤 샘플을 두고 일시 중지 지점 수 있습니다. - 그 후, 1 시간에 대 한 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올, RT에서 조직을 탈수. 1 시간 동안 실시간에 100% 메탄올에서 디하이드레이션 다음 신선한 100% 메탄올을 조직 전송 및 1 h 4 C에서 품 어.
참고: 증류수에 메탄올을 희석. 메탄올 인큐베이션 기간 동안은 조직 샘플 몰입으로 샘플 통에 넣어 필요가 없습니다.
주의:이 단계는 메탄올은 독성 유해. 그것은 오픈 불길에 따라 가연성입니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리. 메탄올 점화 그리고 가연성 안전 캐비닛에 저장 합니다. - 밤새 4 ° c.에 5%의 과산화 수소 (H2O2; 1 볼륨 30% H2O2 100% 메탄올의 5 권에서 희석)와 조직 표 백제
주의: 과산화 수소 30%는 피부와 눈 접촉 시 매우 위험. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리. - 그 후, 1 시간 동안 80%, 60%, 40% 및 20% 메탄올 및 1 x PBS에 RT에서 조직을 rehydrate.
- 0.2% 비 계면 활성 제 1 h 각 실시간에 셰이 커에 대 한 두 번, 1 x PBS에 희석으로 씻
- 4 %PFA 하룻밤 2 mL microcentrifuge 튜브에에서 4 ° C에서 1 x PBS에 희석에 티슈를 품 어.
- Immunolabeling
참고: 각 단계에서 immunolabeling 시작, 개간이 완료 될 때까지 조직을 산화를 방지 하는 데 사용 하는 솔루션으로 튜브의 상단에 조직을 포함 하는 2 mL 튜브를 작성.- 2 일 동안 1 x PBS, 0.2% 비 계면 활성 제, 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 incubated 탁상 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 0.3 M 글리신의 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 permeabilize.
참고: 37 ° C permeabilization 단계에 대 한 최대 부 화 기간은 2 일입니다. - 2 일에 대 한 PBS, 0.2% 비 계면 활성 제, 10 %DMSO, 5% 당나귀 혈 청, 그리고 1 %Fc 블록 incubated 탁상 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 x 1의 해결책에 있는 직물을 차단 합니다.
참고: 블로킹 단계에 대 한 최대 부 화 시간은 2 일 이다. - 1 x PBS, 0.2% 폴 20, 솔루션의 1 차 항 체에 조직 품 어 10 µ g/mL 헤 파 린, 5 %DMSO, 그리고 4 일 동안 incubated 탁상 궤도 통에 37 ° C에서 5% 당나귀 혈 청.
- 1 x PBS, 0.2% 폴 20, 10 µ g/mL 덤플링을 RT 5 번, 각각 1 h에서 통에 씻어.
참고:이 단계 실시간에 샘플을 하룻밤 두고 일시 중지 지점 수 있습니다. - 1 x PBS, 0.2% 폴 20의 해결책에 있는 이차 항 체 조직 품 어 10 µ g/mL 헤 파 린, 그리고 4 일 탁상 궤도 통에 37 ° C에서 5% 당나귀 혈 청.
참고: 3.2.5 단계에서 모든 샘플 이차 항 체의 photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일 포장을 해야 합니다. - 2 h에 대 한 PBS, 0.2% 폴 20, 및 RT에 통에 10 µ g/mL 헤 파 린 x 1의 솔루션에는 조직 5 번을 씻어.
참고:이 단계 샘플 실시간 하룻밤 두고 일시 중지 지점 수 있습니다.
- 2 일 동안 1 x PBS, 0.2% 비 계면 활성 제, 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 incubated 탁상 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 0.3 M 글리신의 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 permeabilize.
- 조직 흰색 adipose 조직 및 볼륨 이미지는
- 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올에서 그 후, 각 실시간에서 1 시간 동안 배양 하 여 2 mL 튜브에 포함 된 조직 탈수 그런 다음 두 번 실시간에 100% 메탄올에서 샘플을 탈수
참고:이 단계 실시간 하룻밤에 100% 메탄올에 당신의 샘플을 두고 일시 중지 지점 수 있습니다. - 통에 RT에서 3 h에 대 한 메탄올의 1 볼륨을 2 양의 DCM의 혼합 조직 품 어.
참고: DCM은 휘발성 이다. 튜브는 증발을 방지 하기 위해 단단히 밀폐 된 다는 것을 확인 하십시오.
주의:이 단계는 위험. DCM은 흡입 시 독성. 장기간된 노출 화학 화상 발생 수 있습니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 신발, 안전 고글)을 착용. 사용 하 여 증기 두건. - 알을 품고 100 %DCM 조직 두 번, 각 실시간에 통에 15 분
- 100%에서 품 어 실시간 영상까지 및 샘플 저장에 DBE. 이미징, 전에 반전 튜브 여러 번 솔루션을 혼합.
참고:은 DBE 지우기 실패 조직 귀 착될 수 있다 산화를 방지 하기 위해 튜브를 완전히 채워. DBE 인큐베이션 기간 동안 튜브를 흔들 하지 마십시오.
주의:이 단계는 위험. DBE 독성이 있다. 그것은 눈과 피부에 자극을 일으킬 수 있습니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리. - 유기 용 매 DBE의 굴절률과 일치 하는 가벼운 현미경으로 전체 조직 샘플을 이미지. 원하는 확대와 단계-크기는 전체 조직에 대 한 Z 스태킹를 수행 합니다.
- 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올에서 그 후, 각 실시간에서 1 시간 동안 배양 하 여 2 mL 튜브에 포함 된 조직 탈수 그런 다음 두 번 실시간에 100% 메탄올에서 샘플을 탈수
4. 전체 산에서 데이터 분석의 예로 스테인드 ImageJ를 사용 하 여 조직 이미지
참고: 다운로드 및 설치 지침을 보려면 https://imageJ.nih.gov/ij/download.html를 참조 하십시오.
- 혈관 밀도 (보 그림 2)의 정량화
- ImageJ에 혈관 immunostaining와 채널에만 저장 된 이미지를 가져옵니다.
참고: 정량화에 대 한 이미지는 착 절차 및 이미지 수집 상태 일관 되어야 합니다. 동일한 시 약을 사용 해야 합니다. 노출 시간, 강도, 그리고 확대 되어야 이미징 과정20에 해당 합니다. - 혈관 밀도 정량화에 대 한 흑백 이미지 색 변환. 이렇게 하려면, "이미지" 탭에서 "조정" 명령을 다음 "색상 임계값" 옵션을 선택 합니다. "임계값 색" 디스플레이 상자에서 "어두운 배경"20 을 선택 하 고 "" b 조 & 승"" 아래 "임계값" 컬러 ""을선택 합니다.
- 배경 혈관 신호의 면적의 비율을 측정, "분석" 탭, "분석 입자" 명령을 다음을 선택 합니다. "분석 입자"의 표시에서 "취소 결과" 및 "요약" 옵션을 선택 합니다. "확인"을클릭 합니다.
- 복사 및 분석에 대 한 스프레드시트에 요약 탭 아래 비율 영역의 값을 붙여 넣습니다. 영역 비율 혈관 밀도를 나타냅니다. 각 개별 이미지에 대 한 4.3.1–4.3.4 단계를 반복 합니다.
- ImageJ에 혈관 immunostaining와 채널에만 저장 된 이미지를 가져옵니다.
- 체형 크기21 (보 그림 3)의 정량화
- ImageJ에 adipocytes의 저장 된 이미지를 가져옵니다.
- 이미지의 규모를 설정 하려면 직선 선택 도구를 사용 하 여 이미지에 알려진 거리 규모에 선 추적 하 여 픽셀 단위로 규모의 길이 측정 합니다. "분석" 탭에서 "비율 설정" 명령을 선택 합니다. 하기 전에 추적 했다 선의 거리 자동으로 픽셀 단위로 계산 됩니다.
- "설정 규모" 표시 상자에 표시 됩니다. 알려진된 거리 및 길이 단위를 입력 합니다. "Global" 축척 모든 가져온된 이미지에 대 한 설정을 적용 하 고 "확인"을클릭 합니다를 선택 합니다.
- 선택 영역 측정, "분석" 탭에서의 방법으로 "측정 설정" 명령을 선택 합니다. 측정을 위한 다양 한 옵션의 목록이 표시 됩니다. "영역" 옵션을 선택 하 고 "확인"을클릭 합니다.
- 자유형 선택 도구를 사용 하 여 관심의 각 체형의 경계를 추적 합니다. "분석" 탭에서 "측정 (Ctrl + M)" 명령을 선택 하 고는 체형의 영역 표시 됩니다. 다른 adipocytes 이미지에 대해이 절차를 반복 합니다.
참고: 정확한 측정을 위해, 정량화에 대 한 여러 개의 이미지를 사용 합니다. - 복사 하 고 추가 데이터 분석에 대 한 스프레드시트에 붙여 지역 측정.
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Representative Results
지방이 많은 직물의 취약성 때문 방법 여러 처리 단계를 포함 하 고 단면 지방 조직 형태3 (그림 1A)의 외관을 손상 될 수 있습니다. 그러나, 전체 마운트 얼룩 adipocytes, 결과 (그림 1B)의 정확한 해석을 보장의 형태를 보존할 수 있습니다.
지방 조직의 과잉 고정 정착 액을 이용한 autofluorescence 이끌어 낸다. 그림 2A같이 녹색과 적색 채널 티로신 hydroxylase (TH)와 PECAM-1 신호, 얼룩 각각, 그 autofluorescence PFA에 3 일 이상 고정으로 인해 발생 한 수 있습니다 나타내는 조직의 동일한 지역에 중복. 그림 2B 전체 실장 일 얼룩에 대 한 신호 PECAM-1 신호를 기준으로 서로 다른 영역에서 발생 적절 한 고정을 수행 하면 얼룩,이 신호는 autofluorescence 시연의 대표 이미지를 표시 하는 반면, 고 사실 긍정적인 신호가입니다.
전체-마운트 얼룩 adipocytes15mT/mG 이상적인 기자 시스템18되 고의 혈통 Cre loxP-기반 추적에 대 한 중요 한 시각화 도구입니다. Ng2, 체형 조상 세포 인구에 대 한 마커 플라즈마 멤브레인 proteoglycan 이다. 이 시스템에서 Ng2 Cre 양성 세포 표현 m-GFP, 반면 m-토마토 Ng2 Cre 음수가 셀 (그림 3)에 표시 됩니다.
지방 조직은 매우 동적 기관, 확대 하 고 다른 생리 적인 조건 및 요구20축소 이다. 전체-마운트 지방 조직 스테인드 이미징 imorphological 변경 다른 실험 조건에서의 정량화 할 수 있습니다. 특히, 지방이 많은 직물은 매우 나가도록, 에너지 레벨1의 빠른 변화에 따라 대사 항상성을 중재에 중요 하다. 예를 들어, 금식의 24 시간 받을 C57BL/6J 마우스 표시 나타내는 lipolysis, 훨씬 작은 체형 크기 (그림 4), 그리고 추세에 비해 지속적으로 높은 혈관 밀도 먹인 쥐 (그림 5). 위에서 설명한 대로 ImageJ 소프트웨어 adipocytes 혈관 밀도, 크기 척도를 이용 되었다.
조직 삭제 조직 볼륨9,10 (그림 6) 깊은 시각화 수 있도록 지방 조직의 불투명 함 제거 하기 위해 개발 하는 비교적 새로운 기술입니다. 전체-마운트 uncleared IWAT confocal 현미경 검사 법만 직물의 표면 아래에 신경 섬유를 시각화할 수 없습니다 이후 스파스 동 정적인 신경 분포를 보여주었다 (그림 7A)를 사용 하 여에 얼룩. 그러나, 조밀한 신경 arborization 삭제 하는 조직과 immunolabeling iDISCO +의 사용 뿐만 아니라 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) (그림 7B)의 사용 후 관찰 될 수 있었다.
그림 1: 기존의 형태학 기법 및 전체 마운트 얼룩 기법 지방이 많은 직물 형태학의 비교. (A) H & E 스테인드 (왼쪽), adipocytes의 왜곡 된 영역을 나타내는 검정색 화살표와 파라핀 포함 된 섹션에 지방 조직. Lectin (탄수화물 바인딩 단백질, 흰색 화살표) 형광 염료 주입, immunofluorescent F4/80 (대 식 세포 마커, 노란색 화살촉), 얼룩 및 DAPI 핵 cryosection (오른쪽)에 지방이 많은 직물의 얼룩. (B) 백색 지방 조직 시각화 전체 마운트 단계-5 μ m의 크기와 얼룩을 사용 하 여. 캡처된 총 스택-Z 깊이 약 100 μ m 이다. 체형 지질 작은 물방울은 중립 지질 얼룩 (회색), 물 그리고 혈관 PECAM-1 물 했다. 이미지는 Z 스태킹에 대 한 현미경 단계-5 μ m의 크기와 함께 체포 됐다 (빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 신경 섬유 및 전체-마운트를 사용 하 여 혈관의 시각화 스테인드 지방 조직. (A) 3 일 동안 PFA에 이상 고정으로 인해 전체 마운트 스테인드 PWAT에서 바람직하지 않은 결과의 대표적인 현미경 이미지. 겹치는 신호 흰색 화살촉으로 표시 됩니다. 전체 산에서 긍정적인 결과의 (B) 대표 미세한 이미지 컨트롤 마우스에서 IWAT 스테인드. 이미지는 100 배 확대에 점령 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 리니지 추적 mT/mG 시스템을 사용 하 여 지방 조직에. 대표 이미지 Cre 양성 (mG)과 Cre-네거티브 (mT) 셀 Ng2 Cre;의 IWAT에 있는 mT/mG 마우스입니다. 이미지는 200 배 확대에 점령 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시각화와 체형 크기의 정량화. (A) 먹이 24 시간 단식 C57BL/6J 쥐 중립 지질 얼룩을 사용 하 여 PWAT에 adipocytes의 대표 이미지. 이미지는 200 배 확대에 점령 했다. (B) 체형 크기 먹이 24 시간 단식된 C57BL/6J 쥐 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 비교 합니다. 값은 ± SEM; 의미 표시 2 꼬리 짝이 없는 학생의 t-테스트; p < 0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 시각화 및 혈관 밀도의 정량화. (A) 먹이 하 고 24 시간 단식된 C57BL/6J 마우스 PECAM-1 항 체를 사용 하 여 혈관의 대표 이미지. 간의 혈관 밀도의 (B) 비교 되 고 24 시간 금식 C57BL/6J 쥐 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 값은 ± SEM; 의미 표시 2 꼬리 짝이 없는 학생의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: iDISCO + 방법을 사용 하 여 지방 조직은. 이전에 개간, 조직 불투명 하다입니다. 조직 삭제 단계 조직의 끝에 완전히 투명 하 게 된다.
그림 7: 전체-마운트 IWAT iDISCO + 방법을 사용 하 여 조직 허가 IWAT에 비해 스테인드. (A) 5 μ m의 스텝 크기와 confocal 현미경 검사 법으로 100 배 확대에서 전체 마운트 스테인드 IWAT TH 항 체 (1: 500)를 사용 하 여 신경 섬유의 시각화. 캡처된 총 스택-Z 깊이 약 100 μ m. 1.6 X에서 iDISCO + 프로토콜 전체 산에 회 항 체 (1: 200)을 사용 하 여 신경 섬유의 (B) 시각화 물 IWAT LSFM를 사용 하 여 단계-4 μ m의 크기와 확대. 캡처된 총 스택-Z 깊이 약 8 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: mT/mG 혈통 추적 시스템에 대 한 회로도. 막 대상 eGFP 및 막 대상 tdTomato 사용 하는 듀얼 형광 시스템. Cre 재결합 하기 전에 mT 세계적으로 표현 된다. 셀 Cre 표현, mT 카세트 excised 고 mG 영구적으로 표현 된다. pA 정지 codon 후 polyadenylation 시퀀스를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: ImageJ의 응용 프로그램 소프트웨어 계량 혈관 밀도의 비율 영역을. (A) "이미지" 탭 명령 그리고 흑백 임계값 색상으로 이미지를 변환 하는 옵션. (B) "입자 분석" 명령을 사용 하 여 배 밀도의 비율 영역 요약 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3: ImageJ의 응용 프로그램 소프트웨어 계량 체형 지역. "분석" 탭: "설정 규모"와 "측정"는 adipocyte(s)의 면적 측정 명령. 결과 표시 측정 각 체형의 영역을 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
조직학 및 cryosection 같은 기존의 기술을 세포내 구조를 관찰에 대 한 혜택을 제공, 지방 조직 연구, 세포의 3 차원 시각화를 가능 하 게 다른 관점을 제공 합니다 전체 마운트 얼룩 최소한 처리 조직의 아키텍처입니다.
성공적으로 전체 마운트 얼룩을 수행 하기 위해 다음 제안 사항은 고려 사항으로 취해야 한다. 다른 지방 조직 창 고 수 결과가 다양 한 immunostaining; 따라서, 지방 조직 창 고 사용의 종류를 먼저 결정 한다. 예를 들어, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 때문에 작은, multilocular adipocytes21흰색 adipose 조직 (WAT) 상대 밀도 이다. 박쥐의이 증가 밀도 조직을 통해 침투 항 체에 대 한 어려운 있습니다. 또한, 지방이 많은 직물의 크기는 또한 적절 한 항 체 얼룩이 지기에 대 한 긴급 때문에 너무 큰/두꺼운 조직 부족 한 항 체 침투에 또한 발생할 수 있습니다. 따라서, 동물 해 부 동안 지방 조직을 얻을 때 perigonadal 살 찐 티슈의 원심 부분 사용 되어야 한다,이 얇은 지역 때문에 충분 한 항 체 침투 하 고 일관 된 데이터에 대 한 수 있습니다. 또는, 밀도가 높은 조직에 대 한 mT/mG, 같은 형광 기자 마우스 라인의 사용 수 있습니다 관심의 표시의 더 나은 시각화를 위한이 부족 한 항 체 침투의 문제를 피할 수 있기 때문. 그 후, 1 %PFA 조직 고정을 위한 단백질의 천연 분포를 유지 하 고 조직 permeabilization 및 항 체 침투22,23확인. 그러나, 이상의 고정 항 원 인식 감소 하 고 autofluorescence24를 생산 수 있습니다. 이것은 형광 화합물24만듭니다 PFA에 알데하이드 그룹 및 다른 알데하이드 포함 된 정착 액 및 조직 구성, 사이 반응. 항 원 복구 단계에 대 한 필요성을 방지 하기 위해, 조직에는 정착 액만 실 온에서 한 시간 동안 두고 고정 완료7은 다음 단계를 시작 하는 것이 좋습니다. 다른 많은 immunolabeling 기법 처럼 원하는 신호를 보장 하기 위해 필수적인 문제 해결 단계는 항 체 농도 titrating.
실제로, 전체 마운트 전술 의미와 장점에도 불구 하 고 얼룩의 몇 가지 제한이 있습니다. 전체 산 얼룩이 지는 조직 유형 및 크기에 관한 엄격한 요구 사항을 부족 한 항 체 침투 및 고르지 못한 얼룩 근육과 간 등 두꺼운 조직에서 발생할 수 있습니다. 또한, 전체 마운트 얼룩이 아니다 티로신 hydroxylase (TH), 교감 신 경계에 대 한 마커 등 특정 항 체의 가장 정확한 표현을 신호는 지방 조직 (그림 7)에 고밀도 지질 콘텐츠 자주 마스크. 또한, 지방이 많은 직물의 고르지 못한 표면 또한 confocal 이미징, 지방이 많은 직물의 다른 층에 있는 신호는 쉽게 하나의 이미지에 캡처할 수 없습니다 때문에 대 한 도전을 제기 했다. 따라서, 전체 신경 섬유 arborization에 대 한 전체-마운트 얼룩 수율 일관성 없는 결과에서 얻은 이미지에 신호 강도의 정량화. PWAT의 원심 부분은 일반적으로 최소한 지질 밀도; 따라서,이 지역에서 더 나은 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나,이 지역은 immunostaining 항 체의 모든 종류에서에 대 한 전체 조직의 대표 인지 필요 합니다 추가 조사.
조직 광학 투명 하 게 함으로써, 개간 방법 산란, 깊은 구조25의 시각화를 사용을 줄일 수 있습니다. iDISCO + 저렴 한 프로토콜 최근 개발 전체-마운트 볼륨 이미지의 다양 한 대형 허가 조직9와 immunolabeling을 결합 하는 것을 이다. 수정 된 iDISCO + LSFM 최근 연구9,10 에 의해 증명 방법을 기존의 immunolabeling 그리고 confocal 현미경 검사 법으로 볼 수 없는 와트에 조밀한 수지상 arborization 관찰. 전통적인 confocal 영상 이미징 빔 시스템 및 핀 홀 레이저 스캔에 대 한 사용합니다. 스캐닝 속도 깊이 관통 현미경;의 한계는 따라서, 3 차원 조직 역학은 종종 싶 었 어. 반면, 빛 시트 현미경 시트 검색 사용 하 고만 조명 한 광학 섹션 한 번에 캡처 해당 섹션 내의 모든 형광 분자에 명백한 이점이 있다. 또한, 다른 섹션에 fluorophores는 하지 흥분, 사진 표백 및 phototoxic 효과26방지. 따라서, 지방 조직 내에서 신경의 신경 분포의 크기와 iDISCO + LSFM 더 정확 하 게 평가 될 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, iDISCO +와 LSFM의 사용에 일부 제한이 있습니다. 예를 들어, 사용자가 빛의 긴 파장은 더 잘 수 있기 때문에 빨간색과 빨강 채널에서 채널 iDISCO + 호환만 샘플27침투 주의 해야 한다. 또한, 파랑-녹색 스펙트럼에 autofluorescence 이므로 꽤 큰 조직 샘플에서 높은 빨간색과 빨강 스펙트럼에서 이미징14발생 하는 모든 autofluorescence를 줄이는 데 도움이 됩니다. 유전자 변형 형광 기자 쥐에 관한 iDISCO + 사용할 수 있습니다 기자 단백질을 시각화 하기. 그러나, 이차 항 체와 형광 기자 immunolabeling 해야 될 실시, 내 생 신호 조직 과정14비운 동안 사라질 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 기술은 매우 중요 한 교감 신 경계 지방 조직 상호 작용을 공부 하 고 다른 생리 및 대사 조건 하에서 많은 소성 조사 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 캐나다, 조종사 및 타당성 연구 그랜트 밴팅 최고의 당뇨병 센터 (BBDC), H.에 SickKids 시작 기금에서 교부 금에 의해 투자 되었다 미, 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신와 J R.K. 미래 계획
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
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