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Biology

3 डी सफेद वसा ऊतक संरचना के दृश्य का उपयोग कर पूरे माउंट धुंधला

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58683
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 3, 4, 1,2,5
1Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Neurosciences & Mental Health Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Smart-Aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान अध्ययन का ध्यान वसा ऊतक वास्तुकला और सेलुलर घटक के 3 डी इमेजिंग के लिए एक आदर्श विधि के रूप में पूरे माउंट immunostaining और दृश्य तकनीक का प्रदर्शन है ।

Abstract

वसा ऊतक उच्च प्लास्टिक के साथ एक महत्वपूर्ण चयापचय अंग है और पर्यावरण उत्तेजनाओं और पोषक तत्वों की स्थिति के लिए उत्तरदायी है । जैसे, विभिंन तकनीकों वसा ऊतक विज्ञान और जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । हालांकि, पारंपरिक दृश्य विधियों 2d वर्गों में ऊतक का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं, पूरे अंग के 3 डी वास्तुकला पर कब्जा करने में विफल । यहाँ हम पूरे-धुंधला माउंट, एक immunohistochemistry विधि है कि न्यूनतम प्रसंस्करण कदम के साथ बरकरार वसा ऊतक आकृति विज्ञान संरक्षित करता है उपस्थित । इसलिए, adipocytes और अंय सेलुलर घटकों की संरचनाओं विरूपण के बिना बनाए रखा, ऊतक के सबसे प्रतिनिधि 3 डी दृश्य प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, पूरे माउंट धुंधला वंश अनुरेखण तरीके सेल भाग्य निर्णय निर्धारित करने के साथ जोड़ा जा सकता है । हालांकि, इस तकनीक वसा ऊतक के गहरे भागों के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करने के लिए कुछ सीमाएं हैं । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, पूरे-धुंधला आगे ऊतक समाशोधन तकनीक के साथ संयुक्त करने के लिए ऊतक की अपारदर्शी हटाने और पूरे वसा ऊतक शरीर रचना विज्ञान के पूर्ण दृश्य के लिए अनुमति प्रकाश-पत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकते हैं । इसलिए, एक उच्च संकल्प और वसा ऊतक संरचनाओं के अधिक सटीक प्रतिनिधित्व इन तकनीकों के संयोजन के साथ कब्जा किया जा सकता है ।

Introduction

वसा ऊतक ऊर्जा भंडारण के लिए एक आवश्यक अंग है और गतिशील पुननिर्माण और लगभग असीमित विस्तार1की विशेषता है । ऊर्जा homeostasis के अलावा, वसा ऊतक भी पूरे शरीर चयापचय समारोह2मिलाना करने के लिए ५० से अधिक adipokines के हार्मोन स्राव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । वसा ऊतक एक विविध वास्तुकला परिपक्व adipocytes, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocyte जनक कोशिकाओं3सहित विभिन्न प्रकार के सेल के शामिल है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मोटापा और अंय चयापचय रोग काफी वसा ऊतक समारोह और उसके microenvironment है, जो भी शामिल है बदल सकते हैं, लेकिन adipocytes की वृद्धि तक ही सीमित नहीं है, भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ (जैसे, मैक्रोफेज), और संवहनी रोग3.

इस तरह के प्रोटोकॉल और cryosectioning के रूप में पारंपरिक रूपात्मक तकनीक वसा जीव विज्ञान जैसे लंबा रासायनिक प्रसंस्करण कदम है, जो ऊतक संकोचन और संरचना विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अध्ययन में कई सीमाएं प्रदर्शित करता है3, 4. इसके अलावा, इन 2 डी तकनीक अलग सेल प्रकार द्वारा लागू सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए अपर्याप्त हैं, के रूप में प्राप्त वर्गों पूरे3ऊतक के छोटे क्षेत्रों तक ही सीमित हैं । फ्लोरोसेंट इमेजिंग के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, पूरे-धुंधला दाग ऐसे embedding, अनुभाग, और निर्जलीकरण के रूप में अतिरिक्त इनवेसिव कदम, की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, यह एंटीबॉडी विशिष्टता कम की समस्या से बचा जाता है । जैसे, यह इमेजिंग वसा ऊतक के लिए एक सरल और कुशल विधि है, adipocyte आकृति विज्ञान और समग्र वसा ऊतक संरचना5के बेहतर संरक्षण के साथ । इसलिए, पूरे-एक त्वरित और सस्ती immunolabeling तकनीक के रूप में धुंधला माउंट वसा ऊतक 3 डी वास्तुकला1,6,7,8के संरक्षण के लिए स्थापित किया गया था ।

हालांकि, पूरे-माउंट धुंधला के उपयोग के साथ वसा ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के बावजूद, इस तकनीक अभी भी ऊतक के लिपिड सतह के नीचे भीतरी संरचनाओं कल्पना करने में असमर्थ है । कई हाल के अध्ययन9,10 पूरे-माउंट immunolabeling1,6 वसा ऊतक के भीतर व्यापक 3 डी दृश्य के लिए अनुमति देने के साथ संयुक्त ऊतक समाशोधन तकनीक की स्थापना की है । विशेष रूप से, घने तंत्रिका और vasculature नेटवर्क हाल ही में अध्ययन में visualized थे9,10,11, 3 डी मात्रा इमेजिंग के साथ । वास्तव में, विभिंन शारीरिक स्थितियों के तहत वसा ऊतक के तंत्रिका और संवहनी प्लास्टिक का अध्ययन करने के लिए अपने जीव विज्ञान की पढ़ाई जरूरी है । Immunolabeling-सक्षम तीन आयामी विलायक-खाली अंगों की इमेजिंग (iDISCO +) ऊतक समाशोधन एक प्रक्रिया है मेथनॉल पूर्व उपचार, Immunolabeling के शामिल है, और जैविक रासायनिक रिएजेंट के साथ ऊतक अपारदर्शीता के समाशोधन dichloromethane (डीसीएम ) और dibenzyl ईथर (DBE)13,14. वसा ऊतक पूरी तरह से पारदर्शी बनाने के द्वारा, रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के रूप में ऊतक के भीतर शरीर रचना विज्ञान के एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व9,10प्राप्त किया जा सकता है । IDISCO + में है कि यह विभिंन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट11,14पत्रकारों के साथ संगत है लाभ है, और यह कई अंगों और यहां तक कि14भ्रूण में सफलता का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इसकी मुख्य सीमा एक लंबी मशीन का समय है, जिसमें 18 से 20 दिन पूरे प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक हैं ।

पूरे की एक और महत्वपूर्ण आवेदन-धुंधला माउंट एक वंश अनुरेखण प्रणाली के साथ संयोजन में सेल भाग्य का दृश्य है । वंश अनुरेखण एक विशिष्ट जीन के लेबल है कि सभी बेटी कोशिकाओं पर पारित किया जा सकता है और15समय के साथ संरक्षित है एक सेल में मार्कर/। जैसे, यह एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक कोशिका की संतान15के भाग्य का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 1990 के दशक के बाद से, Cre-LoxP रिकॉमबिनेंट प्रणाली15जीवों रहने में वंश अनुरेखण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया है । जब एक माउस लाइन कि Cre, एक डीएनए recombinase एंजाइम व्यक्त करता है, एक और माउस एक रिपोर्टर है कि एक loxP-रोक-loxP अनुक्रम के निकट है व्यक्त लाइन के साथ पार कर रहा है, रिपोर्टर प्रोटीन15व्यक्त की है ।

पूरे-धुंधला माउंट के लिए, फ्लोरोसेंट बहुरंगा पत्रकारों का उपयोग वसा ऊतक की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, क्योंकि यह adipocyte16के intracellular गतिविधियों के साथ ंयूनतम हस्तक्षेप के लिए अनुमति देता है । हालांकि, पारंपरिक संवाददाताओं आम तौर पर कोशिका द्रव्य दाग, यह मुश्किल सफेद adipocytes, जो cytoplasmic17सामग्री सीमित है की वंश का पता लगाने के लिए बना । इस समस्या को दूर करने के लिए, झिल्ली के प्रयोग से बंधे फ्लोरोसेंट tdTomato/झिल्ली eGFP (mT/मिलीग्राम) रिपोर्टर मार्कर एक आदर्श उपकरण है । झिल्ली-लक्षित tdTomato Cre-नकारात्मक कोशिकाओं18में व्यक्त की है । Cre उत्पाद पर, झिल्ली की अभिव्यक्ति के लिए एक स्विच-लक्षित eGFP होता है, इस रिपोर्टर adipocyte progenitors17,18 (अनुपूरक चित्रा 1) की वंशावली अनुरेखण के लिए उपयुक्त बना ।

इस कागज के उद्देश्य के लिए पूरे के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल-धुंधला और दिखाने के लिए यह कैसे अंय तकनीकों के साथ संयुक्त किया जा सकता है के विकास और वसा ऊतक फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए प्रदान करना है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुप्रयोगों के दो उदाहरण के साथ इसके उपयोग कर रहे है 1) बहुरंगा रिपोर्टर माउस लाइनों को adipocytes और 2 के विभिंन मूल की पहचान) ऊतक समाशोधन के लिए आगे सफेद वसा ऊतक (वाट) में तंत्रिका arborization कल्पना ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक पशु प्रोटोकॉल जानवरों की देखभाल पर कनाडा परिषद के मानकों के अनुरूप Phenogenomics (टीसीपी) के लिए केंद्र की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । चूहों 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था और पानी और भोजन के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ प्रदान की । 7 माह पुराने C57BL/6J पुरुष चूहों में प्रयोग किया गया पूरे माउंट धुंधला प्रयोग ।

नोट: अनुभाग 1 से 2 खंड 1 के बाद एक वैकल्पिक चरण ठीक किया जा रहा अनुभाग 3 के साथ, कालानुक्रमिक क्रम में हैं । धारा 4 के खंड 2 के पूरा होने के बाद adipocyte आकार और रक्त वाहिका घनत्व का विश्लेषण किया जा सकता है ।

1. सामग्री तैयारी और ऊतक अलगाव

  1. नए सिरे से तैयार 1% paraformaldehyde (पीएफए) ऊतक निर्धारण के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में पतला । तैयार ०.३% ईओण surfactant 1x पंजाब में पतला (इसके बाद पंजाब के रूप में भेजा-0.3 टी) बाद में ऊतक धोने कदम के लिए ।
    नोट: प्रत्येक ऊतक के लिए, 1% पीएफए के लगभग १.५ मिलीलीटर तैयार करने के लिए पूरा विसर्जन सुनिश्चित करते हैं । निर्धारण मात्रा बढ़ सकता है या ऊतक के आकार के आधार पर कमी आई है ।
    चेतावनी: यह कदम खतरनाक है, के रूप में पीएफए संक्षारक और विषाक्त है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें (जैसे, nitrile दस्ताने, लैब कोट, जूते, सुरक्षा चश्मे) और एक धुएं डाकू में संभाल ।
  2. Euthanize एक अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार जानवरों (जैसे, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन और/ बिना देरी, काटना वांछित वसा ऊतक डिपो (जैसे, वंक्षण सफेद वसा ऊतक या perigonadal सफेद वसा ऊतक)18.
  3. विच्छेदन कैंची के साथ, एक १०० x 15 मिमी2 पेट्री पकवान टुकड़े में लगभग 0.5-1 सेमी आकार में, और उंहें microcentrifuge ट्यूबों 1% पीएफए से भर में विसर्जित पर ऊतक काट दिया । बर्फ पर रखो ।

2. पूरे-सफेद वसा ऊतक के धुंधला माउंट

  1. विच्छेदन पूर्ण होने के बाद, 1% पीएफए में ऊतक के नमूनों को बर्फ से कमरे के तापमान (RT) के लिए 1 घंटे के लिए ले जाएँ, और फिर जल्दी धोने के लिए एक 12-या 24-well सेल कल्चर प्लेट के ऊतकों को स्थानांतरित.
  2. पंजाबियों के साथ ऊतकों धो-0.3 टी, 5 मिनट के लिए 3 बार आरटी में प्रत्येक एक शेखर पर झुका 22 °, के साथ 20-25 गति के रूप में मिनट प्रति झुकाव ।
    नोट: सभी बाद में एक शेखर के उपयोग को शामिल कदम के लिए इस झुकाव और गति का उपयोग करें ।
    नोट: यदि एक बहुरंगा रिपोर्टर माउस लाइन का उपयोग कर ऐसे मीट्रिक टन/मिलीग्राम और अतिरिक्त एंटीबॉडी दाग की जरूरत नहीं है, ऊतक माइक्रोस्कोप के लिए तैयार है के बाद कदम २.२ ।
  3. जोड़ें 0.5-1 मिलीलीटर अवरुद्ध बफर (5% पंजाब में पतला पशु सीरम-0.3 टी) । शेखर पर प्लेट रखो और आरटी में 1 ज के लिए मशीन ।
  4. महाप्राण समाधान और प्राथमिक पंजाब में पतला एंटीबॉडी-0.3 टी 1% पशु सीरम के साथ जोड़ें ।
  5. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर प्लेट रखें ।
  6. अगले दिन, पंजाबियों के ऊतकों को धो-0.3 टी 3 बार 5 मिनट के लिए आरटी में प्रत्येक ।
  7. का प्रयोग करें उपयुक्त माध्यमिक पंजाबियों में पतला एंटीबॉडी-0.3 टी । प्रत्येक अच्छी तरह से 0.5 – 1 मिलीलीटर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी में थाली लपेटें और यह आरटी पर 1 घंटे के लिए एक शेखर पर मशीन ।
    नोट: photobleaching को रोकने के लिए अंधेरे में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी गर्मी के बाद, पंजाबियों के साथ धो-0.3 टी दो बार 5 मिनट के लिए, RT. Image में प्रत्येक नमूने यदि एक तटस्थ लिपिड दाग वांछित नहीं है । यदि लिपिड बूंदों के दृश्य तटस्थ लिपिड दाग का उपयोग करने की जरूरत है, 1x पंजाबियों के साथ धो (गैर ईओण surfactant के बिना) दो बार, 5 मिनट प्रत्येक के लिए ।
  9. धोने कदम के बाद, तटस्थ लिपिड के साथ गर्मी 1x में 30 मिनट के लिए 1:1500 कमजोर पड़ने कारक के साथ पतला दाग आरटी । ऊतक अब माइक्रोस्कोप के लिए तैयार हैं । भविष्य इमेजिंग के लिए, ऊतकों 4 डिग्री सेल्सियस में इस समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है ।
    नोट: इमेजिंग गुणवत्ता समय के साथ कम हो जाती है; इसलिए, इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा समय 1 या 2 दिनों के भीतर है ।
  10. संदंश का प्रयोग, एक 24 x ६० mm ² ग्लास coverslip पर फ्लैट ऊतक रखना और यह एक औंधा फोकल लेजर माइक्रोस्कोप प्रणाली पर जगह है ।
  11. यदि DAPI के साथ नाभिक के दाग वांछित है, बढ़ते मध्यम DAPI युक्त के 1-2 बूंदें जोड़ने के लिए पूरी तरह से ऊतक विलय और इसे सुखाने से रोकने के ।
  12. की छवियों को प्राप्त करने के लिए पूरे-कई फोकल विमानों में सना हुआ ऊतकों माउंट, 100 के Z-ढेर प्रदर्शन-4 के साथ गहराई में 150 माइक्रोन-6 माइक्रोन कदम आकार वांछित आवर्धन पर ।

3. ऊतक समाशोधन और Immunolabeling का उपयोग iDISCO +

नोट: यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित कार्यविधियाँ9,10,19पर आधारित है ।

  1. निर्धारण और मेथनॉल पूर्व उपचार
    1. 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाबियों में पतला 4% पीएफए में ऊतकों को गर्मी ।
      नोट: इमेजिंग तक सभी निम्नलिखित उपचार के लिए 2 मिलीलीटर ट्यूबों में ऊतकों को छोड़ दें ।
    2. अगले दिन, 1x पंजाब में तीन बार ऊतकों को धोने, 1 घंटे के लिए आरटी पर एक शेखर पर प्रत्येक ।
      नोट: यह चरण, RT या 4 ° c पर रातोंरात नमूना छोड़ने के लिए एक रोक बिंदु हो सकता है.
    3. 20%, ४०%, ६०%, और ८०% मेथनॉल में आरटी पर ऊतकों निर्जलीकरण, बाद में, 1 एच प्रत्येक के लिए । 1 घंटे के लिए आर टी पर १००% मेथनॉल में निर्जलीकरण, तो ताजा १००% मेथनॉल और 4 सी में गर्मी के ऊतकों को स्थानांतरित 1 एच के लिए ।
      नोट: आसुत जल में मेथनॉल पतला । मेथनॉल की मशीन के दौरान, जब तक ऊतक के नमूनों में डूबे हैं, तब तक कोई भी शेखर पर नमूने डालने की जरूरत नहीं है ।
      चेतावनी: यह कदम खतरनाक है, के रूप में मेथनॉल विषाक्त है । यह खुली लपटों पर अत्यधिक ज्वलनशील है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें (जैसे, nitrile दस्ताने, लैब कोट, सुरक्षा चश्मे) और एक धुएं डाकू में संभाल । मेथनॉल दूर प्रज्वलन से और एक ज्वलनशील सुरक्षा कैबिनेट में स्टोर ।
    4. ब्लीच 5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ ऊतकों (एच2ओ2; 30% एच2ओ2 के 1 मात्रा १००% मेथनॉल के 5 संस्करणों में पतला) रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
      चेतावनी: 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड त्वचा और आँख से संपर्क पर बहुत खतरनाक है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें (जैसे, nitrile दस्ताने, लैब कोट, सुरक्षा चश्मे) और एक धुएं डाकू में संभाल ।
    5. ८०%, ६०%, ४०%, और 20% मेथनॉल और 1x पंजाबियों में आरटी पर ऊतकों rehydrat, बाद में, 1 घंटे के लिए प्रत्येक ।
    6. ०.२% ईओण surfactant 1x में दो बार पतला के साथ धो लो, 1 एच के लिए RT में एक शेखर पर प्रत्येक ।
  2. Immunolabeling
    नोट: के रूप में immunolabeling शुरू होता है के रूप में जल्द ही ऊतक ऑक्सीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक चरण में इस्तेमाल समाधान के साथ ट्यूब के शीर्ष करने के लिए ऊतक युक्त 2 मिलीलीटर ट्यूब भरें, समाशोधन पूरा हो गया है जब तक ।
    1. उंहें 1x पंजाबियों, ०.२% ईओण surfactant, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO), और ३७ ° c पर ०.३ मीटर glycine के समाधान में एक मशीन के ऊपर की ओर ऑर्बिटर शेखर पर 2 दिनों के लिए मशीन द्वारा ऊतकों Permeabilize ।
      नोट: ३७ ° c permeabilization चरण के लिए अधिकतम समय सीमा 2 दिन है ।
    2. 1x पंजाबियों के एक समाधान में ऊतकों ब्लॉक, ०.२% ईओण का surfactant, 10% DMSO, 5% गधा सीरम, और 1% ३७ डिग्री सेल्सियस पर एफसी 2 दिनों के लिए कक्षीय के लिए उपक्रमीय शेखर पर ब्लॉक ।
      नोट: ब्लॉकिंग चरण के लिए अधिकतम मशीन समय 2 दिन है ।
    3. 1x पंजाबियों, ०.२% polysorbate 20, 10 µ जी/एमएल हेपरिन, 5% DMSO, और 5% गधा ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक के लिए 4 दिनों के लिए तालिका कक्षीय के साथ शेखर पर एक समाधान में ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊतक मशीन ।
    4. 1x पंजाबियों के साथ धो, ०.२% polysorbate 20, और 10 µ जी/एमएल हेपरिन पर एक शेखर पर पांच बार, प्रत्येक के लिए 1 एच ।
      नोट: इस चरण के नमूने RT में रातोंरात छोड़ने के लिए एक ठहराव बिंदु हो सकता है ।
    5. 1x पंजाबियों, ०.२% polysorbate 20, 10 µ g/एमएल हेपरिन, और 5% गधा सीरम के एक समाधान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक की मशीन ।
      नोट: चरण 3.2.5 से, सभी नमूनों को एल्यूमीनियम पंनी के साथ लिपटे माध्यमिक एंटीबॉडी के photobleaching को रोकने की जरूरत है ।
    6. 1x पंजाबियों, ०.२% polysorbate 20, और RT में एक शेखर पर 10 µ जी/एमएल हेपरिन के एक समाधान में ऊतकों को धो पांच बार, 2 एच प्रत्येक के लिए ।
      नोट: यह चरण RT पर रातोंरात नमूने छोड़ने के लिए एक रोक बिंदु हो सकता है.
  3. सफेद वसा ऊतक और मात्रा इमेजिंग के ऊतक समाशोधन
    1. निर्जलीकरण 20%, ४०%, ६०%, और ८०% मेथनॉल, बाद में, आरटी में 1 घंटे के लिए प्रत्येक द्वारा 2 मिलीलीटर ट्यूबों में निहित ऊतकों । फिर, १००% मेथनॉल में दो बार आरटी में नमूनों निर्जलीकरण ।
      नोट: यह चरण १००% मेथनॉल में RT पर रातोंरात अपने नमूने छोड़ने के लिए एक रोक बिंदु हो सकता है ।
    2. एक शेखर पर आरटी में 3 एच के लिए मेथनॉल के 1 खंड के लिए डीसीएम के 2 संस्करणों का एक मिश्रण के साथ ऊतकों की मशीन ।
      नोट: डीसीएम अस्थिर है । सुनिश्चित करें कि ट्यूबों कसकर वाष्पीकरण को रोकने के लिए बंद कर रहे हैं ।
      चेतावनी: यह कदम खतरनाक है । डीसीएम सांस लेना पर विषाक्त है । लंबे समय तक जोखिम संभावित रासायनिक जलता कारण हो सकता है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे, nitrile दस्ताने, लैब कोट, जूते, सुरक्षा चश्मे) पहनते हैं । एक धुएं डाकू का प्रयोग करें ।
    3. १००% डीसीएम में दो बार ऊतकों की मशीन, 15 मिनट के लिए आर टी पर एक शेखर पर प्रत्येक ।
    4. आरटी में १००% DBE में मशीन इमेजिंग तक और नमूना भंडारण के लिए । इमेजिंग से पहले, पलटने ट्यूबों कई बार समाधान मिश्रण करने के लिए ।
      नोट: पूरी तरह से ऑक्सीकरण रोकने के लिए DBE के साथ ट्यूबों भरें, जो असफल ऊतक समाशोधन में परिणाम कर सकते हैं । DBE गर्मी के दौरान ट्यूबों हिला नहीं है ।
      चेतावनी: यह कदम खतरनाक है । DBE विषाक्त है । यह आंखों और त्वचा के लिए जलन पैदा कर सकता है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें (जैसे, nitrile दस्ताने, लैब कोट, सुरक्षा चश्मे) और एक धुएं डाकू में संभाल ।
    5. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ पूरे ऊतक नमूना छवि है कि कार्बनिक विलायक DBE के अपवर्तन सूचकांक से मेल खाता है । पूरे ऊतक के लिए एक वांछित बढ़ाई और कदम आकार पर Z-स्टैकिंग करते हैं ।

4. ImageJ का उपयोग कर पूरे माउंट दाग ऊतक छवियों से डेटा विश्लेषण के उदाहरण

नोट: डाउनलोड और स्थापना निर्देशों के लिए https://imageJ.nih.gov/ij/download.html देखें ।

  1. रक्त वाहिका घनत्व का ठहराव (अनुपूरक आंकड़ा 2)
    1. ImageJ पर रक्त वाहिनियों immunostaining के साथ केवल चैनल के सहेजे गए चित्रों को आयात करें ।
      नोट: ठहराव के लिए छवियों धुंधला प्रक्रिया और छवि अधिग्रहण हालत के मामले में संगत होना चाहिए । समान रिएजेंट का उपयोग किया जाना चाहिए । जोखिम समय, तीव्रता, और आवर्धन भी इमेजिंग प्रक्रिया20में समकक्ष होना चाहिए ।
    2. रक्त वाहिका घनत्व ठहराव के लिए काले और सफेद में छवि रंग परिवर्तित । ऐसा करने के लिए, "छवि" टैब के अंतर्गत, " समायोजित करें" आदेश, फिर "रंग थ्रेशोल्ड" विकल्प चुनें. "थ्रेशोल्ड रंग" प्रदर्शन बॉक्स में, "गहरी पृष्ठभूमि"20 चुनें और " थ्रेशोल्ड रंग"के अंतर्गत " B & W" का चयन करें.
    3. पृष्ठभूमि के खिलाफ रक्त वाहिका संकेत के क्षेत्र के प्रतिशत को मापने के लिए, " विश्लेषण" टैब का चयन करें, तो "विश्लेषण कणों" आदेश. " विश्लेषण कणों"के प्रदर्शन के तहत, "स्पष्ट परिणाम" और "सारांश" विकल्प का चयन करें । "ठीक"क्लिक करें ।
    4. विश्लेषण के लिए किसी स्प्रेडशीट में सारांश टैब के अंतर्गत प्रतिशत क्षेत्र का मान कॉपी और पेस्ट करें. क्षेत्र का प्रतिशत रक्त वाहिका घनत्व का संकेत होगा । दोहराएं चरण 4.3.1-प्रत्येक व्यक्ति छवि के लिए 4.3.4 ।
  2. ठहराव का adipocyte साइज21 (supplement figure 3)
    1. ImageJ पर adipocytes की सहेजी गई छवियाँ आयात करें.
    2. छवि के पैमाने पर सेट करने के लिए, सीधे लाइन चयन उपकरण का उपयोग कर छवि पर एक ज्ञात दूरी के साथ पैमाने पर एक पंक्ति अनुरेखण द्वारा पिक्सल में पैमाने की लंबाई मापने । " विश्लेषण" टैब के अंतर्गत, "सेट स्केल" आदेश का चयन करें । इससे पहले पता लगाया गया था कि रेखा की दूरी स्वचालित रूप से पिक्सेल में परिकलित की जाएगी ।
    3. "सेट स्केल" प्रदर्शन बॉक्स दिखाई देगा । ज्ञात दूरी और लंबाई की इकाई दर्ज करें । चुनें "ग्लोबल" सभी आयातित छवियों के लिए पैमाने पर सेटिंग लागू करते है और क्लिक करें "ठीक है"।
    4. माप की विधि के रूप में क्षेत्र का चयन करने के लिए, " विश्लेषण" टैब के तहत "सेट माप" आदेश का चयन करें । माप के लिए विभिन्न विकल्पों की एक सूची दिखाई देगा । चुनें " क्षेत्र" विकल्प और क्लिक करें "ठीक है"।
    5. मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग कर, ब्याज की प्रत्येक adipocyte की परिधि का पता लगाने । " विश्लेषण" टैब के अंतर्गत, "माप (Ctrl + M)" आदेश का चयन करें, और adipocyte का क्षेत्र प्रकट होगा । छवि में अंय adipocytes के लिए इस कार्यविधि को दोहराएं ।
      नोट: सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए, ठहराव के लिए एकाधिक छवियों का उपयोग करें.
    6. आगे डेटा विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट में क्षेत्र माप की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं ।

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Representative Results

वसा ऊतक की कमजोरी के कारण, कई प्रसंस्करण कदम और खंड शामिल तरीकों वसा ऊतक आकृति विज्ञान3 (आंकड़ा 1a) के विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, पूरे-माउंट धुंधला adipocytes की आकृति विज्ञान की रक्षा कर सकते हैं, परिणामों की सटीक व्याख्या सुनिश्चित करने (आंकड़ा 1b) ।

वसा ऊतक का अधिक निर्धारण-निर्धारण-प्रेरित autofluorescence की ओर जाता है । जैसा कि चित्रा 2a, हरे और लाल tyrosine hydroxylase (गु) और PECAM-1 संकेतों के लिए धुंधला चैनलों में दिखाया गया है, क्रमशः, ऊतक के समान क्षेत्रों में ओवरलैप, यह दर्शाता है कि autofluorescence के कारण हुआ हो सकता है पर पीएफए में निर्धारण 3 दिनों के लिए । इसके विपरीत, चित्रा 2 बी पूरे के एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है धुंधला जब उचित निर्धारण किया जाता है, के रूप में गु धुंधला के लिए संकेत PECAM-1 संकेत के सापेक्ष विभिंन क्षेत्रों में होता है, प्रदर्शन है कि यह संकेत autofluorescence नहीं है और वास्तव में एक सकारात्मक संकेत है ।

पूरे माउंट धुंधला Cre-loxP-adipocytes15के वंश अनुरेखण आधारित के लिए एक महत्वपूर्ण दृश्य उपकरण है, मीट्रिक टन के साथ/ Ng2, adipocyte जनक सेल जनसंख्या के लिए एक मार्कर, एक प्लाज्मा झिल्ली proteoglycan है । इस प्रणाली में, Ng2-Cre-पॉजिटिव सेल एक्सप्रेस एम-GFP, जबकि एम-टमाटर Ng2-Cre-नेगेटिव कोशिकाओं (चित्रा 3) में व्यक्त किया जाता है ।

वसा ऊतक एक अविश्वसनीय रूप से गतिशील अंग है, विस्तार और अलग शारीरिक स्थितियों और20मांगों के तहत सिकुड़ने में सक्षम । इमेजिंग पूरे-माउंट दाग वसा ऊतक विभिंन प्रायोगिक परिस्थितियों में imorphological परिवर्तन के ठहराव के लिए अनुमति देता है । विशेष रूप से, वसा ऊतक अत्यधिक संवहनी है, जो ऊर्जा के स्तर में तेजी से परिवर्तन पर चयापचय homeostasis मध्यस्थता में महत्वपूर्ण है1. उदाहरण के लिए, C57BL/6J चूहों कि उपवास के 24 ज से गुजरना काफी छोटे adipocyte आकार (चित्रा 4) प्रदर्शित, lipolysis का संकेत है, और ऊंचा रक्त वाहिका घनत्व में एक प्रवृत्ति लगातार चूहों (चित्रा 5) की तुलना में । ImageJ सॉफ्टवेयर adipocytes और रक्त वाहिका घनत्व के आकार को यों तो इस्तेमाल किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है ।

ऊतक समाशोधन एक अपेक्षाकृत नई तकनीक को वसा ऊतक की अपारदर्शी हटाने के लिए ऊतक मात्रा9,10 (चित्रा 6) के भीतर गहरी दृश्य की अनुमति विकसित की है । पूरे-अस्पष्ट IWAT पर धुंधलाना फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए केवल विरल इन्नेर्वतिओन दिखाया, ऊतक की सतह के नीचे तंत्रिका तंतुओं (चित्रा 7A) visualized नहीं किया जा सकता है के बाद से । हालांकि, घने तंत्रिका arborization ऊतक समाशोधन और iDISCO के उपयोग के साथ immunolabeling के बाद मनाया जा सकता है + के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (LSFM) (चित्रा 7B) का उपयोग करें ।

Figure 1
चित्रा 1: पारंपरिक रूपात्मक तकनीक और पूरे-माउंट धुंधला तकनीक के साथ वसा ऊतक आकृति विज्ञान की तुलना । (क) एच एंड ई एक आयल-एंबेडेड खंड पर दाग वसा ऊतक (बाएं), काले ऐरोहेड adipocytes के विकृत क्षेत्रों का संकेत के साथ । लेक्टिन (कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी प्रोटीन, सफेद तीर) फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन, immunofluorescent/80 के दाग (मैक्रोफेज मार्कर, पीला ऐरोहेड), और DAPI नाभिक वसा पर cryosection ऊतक के दाग (दाएं) । (ख) सफेद वसा ऊतक दृश्य का उपयोग कर पूरे-5 माइक्रोन के एक कदम आकार के साथ धुंधला माउंट । कुल Z-स्टैक गहराई कैप्चर की गई १०० माइक्रोन के आसपास है । Adipocyte लिपिड बूंदें तटस्थ लिपिड दाग (ग्रे) के साथ दाग रहे थे, और रक्त वाहिकाओं PECAM-1 के साथ दाग थे । छवि एक कदम के आकार के साथ माइक्रोस्कोपी के साथ कब्जा कर लिया था 5 माइक्रोन के लिए Z-stacking (लाल). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: के दृश्य तंत्रिका तंतुओं और रक्त वाहिकाओं का उपयोग कर पूरे माउंट दाग वसा ऊतक. (क) पीएफए में 3 दिनों के लिए अधिक से अधिक निर्धारण के कारण पूरे-माउंट दाग PWAT से अवांछनीय परिणाम के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों । अतिव्यापी संकेतों सफेद ऐरोहेड द्वारा संकेत कर रहे हैं । (ख) प्रतिनिधि सूक्ष्म नियंत्रण माउस से पूरी-माउंट सना हुआ IWAT से एक सकारात्मक परिणाम के चित्र । चित्र 100X आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वंश वसा ऊतक में मीट्रिक टन/एमजी प्रणाली का उपयोग कर अनुरेखण । प्रतिनिधि छवियां Cre-धनात्मक (mG) और Cre-ऋणात्मक (mT) कक्षों की IWAT में एक Ng2-Cre; mT/मिलीग्राम माउस । चित्र 200X आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: दृश्य और adipocyte आकार के ठहराव । (एक) adipocytes के प्रतिनिधि छवियों फेड के PWAT में और 24 घंटे के तेजी से C57BL/6J चूहों तटस्थ लिपिड धुंधला का उपयोग कर । चित्र 200x आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । (ख) फेड और 24 एच के बीच Adipocyte आकार तुलना तेजी से C57BL/6J चूहों ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । मान ± SEM अर्थ के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; 2-पूंछ ख़राब है छात्र टीपरीक्षण; p < ०.००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: दृश्य और रक्त वाहिका घनत्व के ठहराव । (क) फेड में रक्त वाहिकाओं के प्रतिनिधि छवियों और PECAM-1 एंटीबॉडी का उपयोग कर 24 घंटे तेजी C57BL/6J चूहों । (ख) फेड के बीच रक्त वाहिका घनत्व की तुलना और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 24 घंटे की तेजी से C57BL/6J चूहों । मान ± SEM अर्थ के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; 2-पट न बिगड़े छात्र का टी-टेस्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: iDISCO + विधि का उपयोग कर वसा ऊतक समाशोधन । समाशोधन से पहले, ऊतक अपारदर्शी है । ऊतक ऊतक समाशोधन कदम के अंत में पूरी तरह से पारदर्शी हो जाता है ।

Figure 7
चित्रा 7: पूरे माउंट IWAT ऊतक के साथ तुलना में दाग-IWAT iDISCO + विधि का उपयोग कर मंजूरी दे दी । (एक) पूरे में गु एंटीबॉडी (1:500) का उपयोग कर तंत्रिका तंतुओं का दृश्य-5 माइक्रोन के एक कदम के आकार के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ 100x आवर्धन पर सना हुआ IWAT माउंट । कुल Z-स्टैक गहराई कैप्चर की गई १०० माइक्रोन के आसपास है। (ख) तंत्रिका तंतुओं का दृश्य पूरे में गु एंटीबॉडी (1:200) का उपयोग-1.6 x आवर्धन पर iDISCO + प्रोटोकॉल के साथ सना हुआ IWAT-4 माइक्रोन के एक कदम आकार के साथ LSFM का उपयोग कर । कुल Z-स्टैक गहराई कैप्चर की गई 8 मिमी के आसपास है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्रा 1: mT/एमजी वंश अनुरेखण प्रणाली के लिए योजनाबद्ध आरेख । एक दोहरी फ्लोरोसेंट प्रणाली है कि झिल्ली को रोजगार-लक्षित eGFP और झिल्ली-लक्षित tdTomato । Cre पुनर्संयोजन से पहले, मीट्रिक टन विश्व स्तर पर व्यक्त किया है । जब सेल एक्सप्रेस Cre, मीट्रिक टन कैसेट है, और एमजी स्थाई रूप से व्यक्त की है । pA polyadenylation अनुक्रम को रोकने के बाद codon का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक आंकड़ा 2: रक्त वाहिका घनत्व के प्रतिशत क्षेत्र को ImageJ सॉफ्टवेयर के आवेदन। (a) "छवि" टैब आदेश और विकल्प एक छवि को एक काले और सफेद सीमा रंग में परिवर्तित करने के लिए । (ख) पोत घनत्व का प्रतिशत क्षेत्र का सारांश माप का उपयोग "कणों का विश्लेषण" आदेश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 3
अनुपूरक आंकड़ा 3: ImageJ सॉफ्टवेयर के आवेदन adipocyte क्षेत्र को यों तो । "विश्लेषण" टैब: "सेट स्केल" और "माप" आदेश adipocyte (ओं) के क्षेत्र को मापने के लिए । परिणाम प्रदर्शन प्रत्येक adipocyte मापा के क्षेत्र से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि ऐसे प्रोटोकॉल और cryosection intracellular संरचना, पूरे-धुंधला माउंट के लिए प्रस्ताव लाभ के रूप में पारंपरिक तकनीक वसा ऊतक अनुसंधान, जो सेलुलर के 3 डी दृश्य में सक्षम बनाता है में एक अलग परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है न्यूनतम संसाधित ऊतक के वास्तुकला ।

आदेश में सफलतापूर्वक पूरे-माउंट धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, निंनलिखित सुझावों को ध्यान में रखा जाना चाहिए । विभिंन वसा ऊतक डिपो विभिंन immunostaining परिणाम प्राप्त कर सकते हैं; इस प्रकार, वसा ऊतक इस्तेमाल किया डिपो की तरह पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, ब्राउन वसा ऊतक (बैट) छोटे, multilocular adipocytes21के कारण सफेद वसा ऊतक (वाट) के सापेक्ष सघन है । बल्ले का यह बढ़ा घनत्व यह मुश्किल एंटीबॉडी ऊतक के माध्यम से रिस करने के लिए बनाता है । इसके अलावा, वसा ऊतक के आकार भी उचित एंटीबॉडी धुंधला के लिए आवश्यक है, के बाद से बहुत बड़े/घने ऊतकों को भी अपर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश में परिणाम कर सकते हैं । इसलिए, जब पशु विच्छेदन के दौरान वसा ऊतक प्राप्त करने, perigonadal वसा ऊतक के बाहर का हिस्सा इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि यह सबसे पतला क्षेत्र है और पर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश और सुसंगत डेटा के लिए अनुमति दे सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, सघन ऊतकों के लिए, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइन का उपयोग, इस तरह के रूप में मीट्रिक टन/mG, ब्याज की मार्कर के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति दे सकता है, क्योंकि यह अपर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश के मुद्दे से बचा जाता है. इसके बाद, 1% पीएफए ऊतक निर्धारण के लिए प्रोटीन के प्राकृतिक वितरण की रक्षा और ऊतक permeabilization और एंटीबॉडी पैठ सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है22,23. हालांकि, अधिक निर्धारण प्रतिजन मान्यता कम कर सकते हैं और autofluorescence24का उत्पादन. यह पीएफए और अंय एल्डिहाइड-युक्त निर्धारण और ऊतक घटकों, जो फ्लोरोसेंट यौगिकों24बनाता है पर एल्डिहाइड समूहों के बीच प्रतिक्रिया के कारण है । एक antigen-पुनर्प्राप्ति चरण के लिए आवश्यकता को रोकने के लिए, यह कक्ष के तापमान पर केवल एक घंटे के लिए एक निर्धारण में ऊतक छोड़ने के लिए और निर्धारण7पूरा होने के रूप में ही अगले चरण शुरू करने के लिए अनुशंसित है । कई अंय immunolabeling तकनीकों की तरह, titrating एंटीबॉडी एकाग्रता एक आवश्यक समस्या निवारण कदम वांछित संकेत सुनिश्चित करने के लिए है ।

वास्तव में, वहां पूरे की कई सीमाएं है aforementioned महत्व और लाभ के बावजूद धुंधला माउंट । पूरे-धुंधला दाग ऊतक प्रकार और आकार के बारे में कड़े आवश्यकताओं है, क्योंकि अपर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश और असमान दाग ऐसे मांसपेशियों और जिगर के रूप में मोटा ऊतकों में हो सकता है । इसके अलावा, पूरे-धुंधला माउंट tyrosine hydroxylase (गु), सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के लिए एक मार्कर के रूप में कुछ एंटीबॉडी का सबसे सटीक प्रतिनिधित्व नहीं है, के रूप में अपने संकेत अक्सर वसा ऊतक में घने लिपिड सामग्री द्वारा नकाबपोश है (चित्रा 7) । इसके अलावा, वसा ऊतक की असमान सतह भी फोकल इमेजिंग के लिए एक चुनौती उत्पंन, के बाद से वसा ऊतक के विभिंन परतों पर स्थित संकेतों को आसानी से एक छवि पर कब्जा नहीं किया जा सकता है । इसलिए, पूरे-माउंट धुंधला उपज से प्राप्त छवियों में संकेत तीव्रता के ठहराव पूरे तंत्रिका फाइबर arborization के लिए असंगत परिणाम । PWAT के बाहर का हिस्सा आम तौर पर है सबसे कम लिपिड घने; इसलिए, इस क्षेत्र से बेहतर छवियां प्राप्त की जा सकती हैं । हालांकि, क्या इस क्षेत्र में एंटीबॉडी के सभी प्रकार के immunostaining के लिए पूरे ऊतक के प्रतिनिधि है आगे की जांच की आवश्यकता होगी ।

ऊतक ऑप्टिकली पारदर्शी बनाने के द्वारा, एक समाशोधन विधि प्रकाश बिखरने कम कर देता है, गहरी संरचना25के दृश्य को सक्षम करने से । iDISCO + एक सस्ती प्रोटोकॉल है कि हाल ही में विकसित की है कि पूरे-माउंट immunolabeling की मात्रा इमेजिंग के साथ विभिंन बड़े ऊतकों को मंजूरी दे दी9। संशोधित iDISCO + LSFM के साथ तरीकों हाल के अध्ययन9द्वारा प्रदर्शन किया,10 वाट पर देखा घने वृक्ष arborization कि पारंपरिक immunolabeling और फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ नहीं देखी जा सकती है । पारंपरिक फोकल इमेजिंग लेजर स्कैनिंग के लिए एक इमेजिंग बीम प्रणाली और pinhole का उपयोग करता है । स्कैनिंग गति और मर्मज्ञ गहराई माइक्रोस्कोप की सीमाएं हैं; इस प्रकार, 3 डी ऊतक गतिशीलता अक्सर याद किया जाता है । इसके विपरीत, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी में स्पष्ट लाभ है कि यह शीट स्कैनिंग का उपयोग करता है और केवल एक समय में एक ऑप्टिकल अनुभाग प्रबुद्ध, उस खंड के भीतर सभी प्रतिदीप्ति अणुओं पर कब्जा । इसके अलावा, अन्य वर्गों में fluorophores उत्तेजित नहीं कर रहे हैं, फोटो ब्लीचिंग और phototoxic प्रभाव को रोकने26. इस प्रकार, वसा ऊतक के भीतर तंत्रिका इन्नेर्वतिओन की मात्रा और अधिक सही iDISCO + और LSFM के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इस के बावजूद, iDISCO + और LSFM के उपयोग के लिए कुछ सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, उपयोगकर्ताओं को ध्यान देना चाहिए कि लाल और सुदूर लाल चैनल में केवल चैनल iDISCO + के साथ संगत कर रहे हैं, क्योंकि प्रकाश की अब तरंग दैर्ध्य बेहतर कर रहे है नमूना27घुसना । इसके अतिरिक्त, नीले-हरे रंग के स्पेक्ट्रम में autofluorescence बड़े ऊतक नमूनों में काफी अधिक है, इसलिए लाल और दूर-लाल स्पेक्ट्रा में इमेजिंग14घटित होने वाली किसी भी autofluorescence को कम करने में मदद करेगा । ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के संबंध में, iDISCO + रिपोर्टर प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के immunolabeling, अंतर्जात संकेत ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के दौरान14फीका हो सकता है के रूप में आयोजित किया जाना चाहिए । बहरहाल, इस तकनीक सहानुभूति तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए अत्यंत मूल्यवान है-वसा ऊतक बातचीत और विभिन्न शारीरिक और चयापचय की स्थिति के तहत वसा प्लास्टिक की जांच के लिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), बंटिंग एंड बेस्ट डायबिटीज सेंटर (BBDC) के पायलट और व्यवहार्यता अध्ययन अनुदान, SickKids स्टार्ट-अप फंड से एच-कश्मीर तक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस., मेडिकल रिसर्च सेंटर प्रोग्राम (2015R1A5A2009124) कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से वित्त पोषित विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना के लिए जम्मू-आर. के.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LipidTox Life Technologies H34477
PECAM-1 primary antibody Millipore MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody Millipore AB152, AB1542
DAPI stain BD Pharmingen 564907
Nikon A1R confocal microscope Nikon Confocal microscope
Ultramicroscope I LaVision BioTec Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies Jackson ImmunoResearch Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BioSciences 553141
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dibenzyl-ether Sigma-Aldrich 33630
Methanol Fisher Chemical A452-1
30% Hydrogen Peroxide BIO BASIC CANADA INC HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Glycine Sigma-Aldrich J7126
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled VECTOR LABORATORIES FLK-2100
F4/80 Bio-Rad MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI VECTOR LABORATORIES H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)

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References

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जीव विज्ञान अंक १४१ सफेद वसा ऊतक पूरे-धुंधला माउंट वसा दृश्य immunolabeling ऊतक समाशोधन immunolabeling-सक्षम तीन-आयामी इमेजिंग विलायक साफ़ अंगों (iDISCO +)
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