Summary
Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie soll die gesamte-Mount Immunostaining und Visualisierung Technik als eine ideale Methode für die 3D Darstellung von Fettgewebe Architektur und zellulären Komponente zeigen.
Abstract
Fettgewebe ist ein wichtiges Stoffwechselorgan mit hoher Plastizität und reagieren auf Reize aus der Umwelt und Nährstoff-Status. Als solche haben verschiedene Techniken entwickelt, um die Morphologie und Biologie des Fettgewebes zu studieren. Allerdings sind herkömmliche Visualisierungsmethoden beschränkt sich auf die Untersuchung des Gewebes in 2D-Schnitte, Nichtbeachtung die 3D Architektur des gesamten Organs zu erfassen. Hier präsentieren wir Ihnen ganze-Mount Färbung, eine immunhistochemische Methode, die intakt Fettgewebe Morphologie mit minimalen Bearbeitungsschritten bewahrt. Daher bestehen die Strukturen der Adipozyten und anderen zellulären Komponenten ohne Verzerrung, die repräsentativsten 3D-Visualisierung des Gewebes zu erreichen. Darüber hinaus ganz-Mount Färbung mit Abstammung-Tracing-Methoden zur Zelle Schicksal Entscheidungen bestimmen kombinierbar. Diese Technik hat jedoch einige Einschränkungen, die korrekte Information über tiefere Teile des Fettgewebes. Um diese Einschränkung zu umgehen, ganz-Mount Färbung weiter kombinierbar mit Gewebe clearing-Techniken, um die Undurchsichtigkeit der Gewebe zu entfernen und ermöglichen vollständige Visualisierung der gesamten Fettgewebe Anatomie mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie. Daher können eine höhere Auflösung und eine genauere Darstellung der Fettgewebe Strukturen mit der Kombination dieser Techniken erfasst werden.
Introduction
Fettgewebe ist ein wesentliches Organ zur Speicherung von Energie und zeichnet sich durch dynamische Umbau und fast unbegrenzte Erweiterung1. Neben Energie-Homöostase spielt Fettgewebe auch eine wesentliche Rolle in Hormonausschüttung von mehr als 50 Adipokine Ganzkörper-metabolische Funktion2zu modulieren. Fettgewebe hat eine vielfältige Architektur, bestehend aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Reifen Adipozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Immunzellen und Adipocyte Progenitor Zellen3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Fettleibigkeit und anderen Stoffwechselstörungen wesentlich ändern können, Fettgewebe Funktion und ihrer Mikroumgebung, die beinhaltet, aber beschränkt sich nicht auf die Erweiterung der Adipozyten, Infiltration von Entzündungszellen (z.B. Makrophagen), und vaskuläre Dysfunktion3.
Konventionelle morphologische Techniken wie Histologie und Kryoschneiden demonstrieren mehrere Einschränkungen bei der Untersuchung adipöser Biologie wie lange chemische Verarbeitungsschritte, Gewebe schrumpfen und Struktur Verzerrung3führen kann, 4. Darüber hinaus sind diese 2D Techniken nicht ausreicht, um interzelluläre Wechselwirkungen von verschiedenen Zelltypen ausgeübt zu beobachten, wie die Abschnitte bezogen auf das gesamte Gewebe3kleinere Regionen beschränkt sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Fluoreszenz-Bildgebung, ganze-Mount Färbung nicht weitere invasive Schritte, z. B. einbetten, Schnitt und Dehydrierung erfordert; so, dies vermeidet das Problem der abnehmenden Antikörperbesonderheit. Als solches ist es eine einfache und effiziente Methode zur bildgebenden Fettgewebe mit besseren Schutz der Adipocyte Morphologie und insgesamt Fettgewebe Struktur5. Daher ganz-Mount Färbung wie eine schnelle und kostengünstige Immunolabeling-Technik gegründet wurde, um Fettgewebe 3D-Architektur1,6,7,8zu erhalten.
Trotz der Erhaltung der Fettgewebe Morphologie mit Nutzung der gesamten-Mount Färbung ist diese Technik jedoch noch nicht in der Lage, innere Strukturen unter der Lipid-Oberfläche des Gewebes sichtbar zu machen. Mehrere aktuelle Studien9,10 entstanden Gewebe clearing Techniken kombiniert mit ganz-Mount Immunolabeling1,6 , um umfassende 3D Visualisierung im Fettgewebe zu ermöglichen. Insbesondere wurden Dichte neuronale und Gefäßsystem Netze in den letzten Studien9,10,11,12 mit 3D-Volumen Bildgebung visualisiert. In der Tat ist es wichtig, seine Biologie zu studieren, studieren die neuronale und vaskuläre Plastizität des Fettgewebes unter verschiedenen physiologischen Bedingungen. Immunolabeling-fähigen dreidimensionale Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO +) Gewebe Clearing ist ein Prozess, bestehend aus Methanol Vorbehandlung, Immunolabeling, und das clearing von Gewebe Undurchsichtigkeit mit organischen chemischen Reagenzien Dichlormethan (DCM ) und Dibenzyl Äther (DBE)13,14. Durch das Fettgewebe völlig transparent zu machen, erhalten Sie eine genauere Darstellung der Anatomie des Gewebes wie Blutgefäße und neuronalen Fasern9,10. IDISCO + hat Vorteile, es kompatibel mit verschiedenen Antikörpern und fluoreszierende Reporter11,14 ist, und sie Erfolg in mehreren Organen und sogar Embryoes14 hat. Die wichtigste Einschränkung ist jedoch eine lange Inkubationszeit, in der 18 bis 20 Tagen erforderlich sind, um das gesamte Experiment zu vervollständigen.
Eine weitere wichtige Anwendung der gesamten-Mount Färbung ist die Visualisierung der Zelle Schicksal in Kombination mit einer Linie-Tracing-System. Linie die Ablaufverfolgung ist die Kennzeichnung eines bestimmten Gens/Markers in eine Zelle, die an alle Tochterzellen weitergegeben werden kann und über Zeit15konserviert ist. Als solches ist es ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um das Schicksal einer Zelle Nachkommen15. Seit den 1990er Jahren das Cre-LoxP rekombinante System geworden ein leistungsfähiger Ansatz für die Linie Ablaufverfolgung in lebenden Organismen15. Wenn eine Mauslinie, die Cre, ein DNA-Enzym Rekombinase, drückt mit einer anderen Maus mit dem Ausdruck eines Reporters, der neben einer LoxP-STOP-LoxP-Sequenz ist überschritten wird, ist das Reporter-Protein ausgedrückt15.
Für das gesamte-Mount zu beflecken, eignet sich die Verwendung von fluoreszierenden multicolor Reporter für imaging von Fettgewebe, denn es minimale Störungen mit intrazellulären Aktivitäten des Adipocyte16 ermöglicht. Traditionelle Reporter Fleck jedoch in der Regel Zytoplasma, macht es schwierig, die Abstammung des weißen Adipozyten, verfolgen die zytoplasmatischen Inhalt17beschränkt haben. Um dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung von fluoreszierenden TdTomato/Membran Membrane-springen eGFP (mT/mG) Reporter Marker ein ideales Werkzeug. Membran-bezogenen TdTomato drückt sich in Cre-negativen Zellen18. Auf Cre Exzision tritt eine Umstellung auf die Expression von Membran-gezielte eGFP, eignet sich dieser Reporter für die Verfolgung der Linie Adipocyte Stammväter17,18 (Ergänzende Abbildung 1).
Dieses Papier soll vorsehen, dass ein detailliertes Protokoll vollständig-hängen Färbung und zeigen, wie es mit anderen Techniken zur Untersuchung der Entwicklung und Physiologie des Fettgewebes kombiniert werden kann. Zwei Beispiele für Anwendungen, die in diesem Protokoll beschrieben sind seine Verwendung mit 1) multicolor Reporter Mauslinien unterschiedlicher Herkunft von Adipozyten und (2) Gewebe löschen um weitere visualisieren die neuronale Arborization im weißen Fettgewebe (WAT) zu identifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentellen Tier Protokolle stimmten die Animal Care Committee des Center für Phänogenomik (TCP) nach den Standards des Canadian Council on Animal Care entsprach. Mäuse wurden auf 12 h hell/dunkel-Zyklen und mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung zur Verfügung gestellt. 7 Monat dienten alte C57BL/6J männliche Mäuse im ganzen-Mount Färbung Experiment.
Hinweis: Die Abschnitte 1 bis 2 sind in chronologischer Reihenfolge mit Abschnitt 3 wird ein optionaler Schritt direkt nach Abschnitt 1. Abschnitt 4 kann durchgeführt werden, um nach der Fertigstellung des Abschnitts 2 Adipocyte Größe und Blutgefäß Dichte analysieren.
1. Vorbereitung und Gewebe isoliert
- Bereiten Sie frische 1 % Paraformaldehyd (PFA) in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für Gewebe Fixierung verdünnt. Bereiten Sie 0,3 % nichtionische Tenside in 1 X PBS verdünnt (nachstehend PBS-0,3T) für nachfolgende Gewebe Waschschritte.
Hinweis: Für jedes Gewebe, bereiten Sie etwa 1,5 mL 1 % PFA um vollständiges Eintauchen zu gewährleisten. Fixierung-Volumen kann erhöht oder verringert je nach Gewebe Größe.
Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich, wie PFA korrosiven und toxischen. Persönliche Schutzausrüstung tragen (z. B. Nitril-Handschuhe, Kittel, Schuhe, Schutzbrille) und Griff in einer Dampfhaube. - Tiere nach einer zugelassenen Verfahren (z. B., zervikale Dislokation und/oder Kohlendioxid Erstickung) einschläfern. Ohne Verzögerung sezieren Sie die gewünschten Fettgewebe-Depots (z.B., leisten-weißen Fettgewebe oder Perigonadal weißen Fettgewebe)18.
- Mit Dissektion Schere, schneiden Sie das Gewebe auf einem 100 x 15 mm2 Petrischale in Stücke etwa 0,5 – 1 cm groß, und tauche sie ein in Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit 1 % PFA. Halten Sie auf dem Eis.
2. gesamte-Mount Färbung der weißen Fettgewebe
- Nach Dissektion abgeschlossen ist, bewegen sich die Gewebeproben in 1 % PFA aus dem Eis auf Raumtemperatur (RT) für 1 h, und übertragen Sie dann das Gewebe auf ein 12 oder 24-Well Kultur Zellplatte schneller waschen.
- Waschen Sie das Gewebe mit PBS-0,3T, 3 Mal für 5 min jeweils in RT auf einen Shaker bei 22 ° c, mit 20 – 25 kippt pro min als die Geschwindigkeit gekippt.
Hinweis: Verwenden Sie dieser Neigung und Geschwindigkeit für alle weiteren Schritte, die die Verwendung von einem Boston-Shaker.
Hinweis: Wenn eine mehrfarbige Reporter Mauslinie wie mT/mG und zusätzlichen Antikörper Färbung ist nicht notwendig, das Gewebe ist nach Schritt 2.2 bereit für die Mikroskopie. - Hinzufügen von 0,5 – 1 mL blockierende Puffer (5 % tierische Seren in PBS verdünnt-0,3T). Setzen Sie die Platte auf den Shaker und 1 h bei RT inkubieren
- Aspirieren Sie die blockierende Lösung und fügen Sie Primärantikörper in PBS verdünnt-0,3T mit 1 % tierische Seren.
- Ort der Platte auf einen Shaker bei 4 ° C über Nacht.
- Am nächsten Tag waschen das Gewebe mit PBS-0,3T 3 Mal für 5 Minuten in RT
- Verwenden Sie geeignete sekundären Antikörper in PBS verdünnt-0,3T. Hinzufügen von 0,5 – 1 mL Sekundärantikörper Lösungen in jede Vertiefung. Die Platte in Alufolie wickeln und es auf einen Shaker 1 Stunde bei RT inkubieren
Hinweis: Verdünnen der Sekundärantikörper im Dunkeln, Immunofluoreszenz zu verhindern. - Nach der Inkubation der Sekundärantikörper, waschen mit PBS-0,3T zweimal für 5 min, jeweils in RT Bild Proben, wenn ein neutrales Lipid Fleck nicht erwünscht ist. Visualisierung von Lipid-Tropfen ist erforderlich mit neutral Lipid Fleck, mit 1 X PBS (ohne nicht-ionische Tenside) zweimal, für 5 min waschen.
- Nach den Waschschritten mit den neutralen Lipid Fleck verdünnt mit 1:1500 Verdünnungsfaktor mit 1 X PBS-Puffer für 30 min in RT inkubieren Die Gewebe sind nun bereit für die Mikroskopie. Für zukünftige Aufnahmen speicherbar Gewebe in dieser Lösung bei 4 ° C.
Hinweis: Bildqualität verringert sich im Laufe der Zeit; Daher ist die beste Zeit für die Bildgebung innerhalb von 1-2 Tagen. - Mit Pinzette, legen Sie das Gewebe flach auf einem 24 x 60 mm ² Glas Deckgläschen und legen Sie es auf einem umgekehrten konfokale Laser-Mikroskop-System.
- Nach Wunsch Färbung der Kerne mit DAPI Tropfen Sie 1 – 2 Eindeckmedium mit DAPI um völlig Eintauchen des Gewebes und Austrocknen verhindert.
- Um Bilder der gesamten-Mount gefärbten Gewebe bei mehreren fokale Ebenen zu erhalten, führen Sie Z-Stapel von 100 – 150 μm eingehend mit 4 – 6 μm Schrittweite auf die gewünschte Vergrößerung.
(3) Gewebe Clearing- und Immunolabeling mit iDISCO +
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf bereits veröffentlichte Verfahren9,10,19.
- Fixierung und Methanol Vorbehandlung
- Inkubieren Sie das Gewebe in 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer bei 4° C über Nacht in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt.
Hinweis: Lassen Sie das Gewebe in den 2 mL Röhrchen für die folgenden Behandlungen bis Bildgebung. - Waschen Sie am nächsten Tag, das Gewebe in 1 X PBS dreimal, für 1 Stunde auf einem Schüttler bei RT
Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu verlassen die Probe über Nacht bei RT oder 4 ° c sein. - Entwässern Sie das Gewebe bei RT in 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol, anschließend 1 h. Entwässern in 100 % Methanol bei RT für 1 Stunde, dann übertragen Sie das Gewebe auf frische 100 % Methanol und inkubieren Sie bei 4 C für 1 h.
Hinweis: Verdünnen Sie Methanol in destilliertem Wasser. Während Methanol Inkubation gibt es keine Notwendigkeit, Proben auf einem Boston-Shaker zu setzen, solange die Gewebeproben eingetaucht sind.
Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich, da Methanol giftig ist. Es ist leicht entzündlich auf offenem Feuer. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln. Das Methanol vom Zündung und in eine brennbare Sicherheitsschrank zu speichern. - Bleichen von Geweben mit 5 % Wasserstoffperoxid (H2O2; 1 Volumen von 30 % H2O2 in 5 Bänden von 100 % Methanol verdünnt) über Nacht bei 4 ° c
Achtung: 30 % Wasserstoffperoxid ist sehr gefährlich bei Haut- und Augenkontakt. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln. - Rehydrieren Sie Gewebe bei RT 80 %, 60 %, 40 % und 20 % Methanol und 1 X PBS, anschließend für 1 Stunde.
- Waschen Sie mit 0,2 % nichtionische Tenside in 1 X PBS verdünnt zweimal für jeweils 1 h auf einem Schüttler bei RT
- Inkubieren Sie das Gewebe in 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer bei 4° C über Nacht in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt.
- Immunolabeling
Hinweis: Füllen Sie die Lösung in jedem Schritt verwendet, um Gewebe Oxidation zu verhindern, sobald Immunolabeling beginnt bis Clearing abgeschlossen ist, das Gewebe an die Spitze des Rohres mit 2 mL-Röhren.- Permeabilize der Gewebe durch Inkubation sie in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % nichtionische Tenside, 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 0,3 M Glycin bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 2 Tage.
Hinweis: Die maximale Inkubationszeit für 37 ° C Permeabilisierung Schritt beträgt 2 Tage. - Blockieren Sie das Gewebe in einer Lösung aus 1 x PBS, 0,2 % nichtionische Tenside, 10 % DMSO, 5 % Esel Serum und 1 % Fc Block bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 2 Tage.
Hinweis: Die maximale Inkubationszeit für die Blockierungsschritt beträgt 2 Tage. - Inkubieren Sie das Gewebe in primären Antikörper von Interesse in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % Polysorbat 20, 10 µg/mL Heparin, 5 % DMSO und 5 % Esel Serum bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 4 Tage.
- Waschen Sie mit 1 x PBS, 0,2 % Polysorbat 20 und 10 µg/mL Heparin auf einem Schüttler bei RT fünf Mal, jeweils für 1 h.
Hinweis: Dieser Schritt kann ein Pausenpunkt Proben über Nacht in RT verlassen sein. - Inkubieren Gewebe mit sekundären Antikörper in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % Polysorbat 20, 10 µg/mL Heparin und 5 % Esel Serum bei 37 ° C auf eine Tischplatte Orbitalschüttler für 4 Tage.
Hinweis: Ab Schritt 3.2.5 müssen alle Proben mit Alu-Folie, Immunofluoreszenz Sekundärantikörper zu verhindern gewickelt werden. - Waschen Sie Gewebe in einer Lösung aus 1 x PBS, 0,2 % Polysorbat 20 und 10 µg/mL Heparin auf einem Shaker in RT fünfmal, 2 h.
Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu Proben über Nacht bei RT verlassen sein.
- Permeabilize der Gewebe durch Inkubation sie in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % nichtionische Tenside, 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 0,3 M Glycin bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 2 Tage.
- Gewebe, die Verrechnung von weißen Fettgewebe und Volumen Bildgebung
- In 2 mL Röhrchen durch Inkubation bei 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol, danach jeweils für 1 Stunde bei RT enthaltenen Gewebe zu entwässern Dann pausiert die Proben in 100 % Methanol zweimal bei RT
Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu verlassen Ihre Proben in 100 % Methanol über Nacht bei RT sein. - Inkubieren Sie das Gewebe mit einer Mischung aus 2 Bänden von DCM zu 1 Volumen von Methanol für 3 h bei RT auf einem Boston-Shaker.
Hinweis: DCM ist flüchtig. Stellen Sie sicher, dass die Rohre dicht sind, um Verdunstung zu verhindern.
Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich. DCM ist giftig beim Einatmen. Längerer Exposition kann Verätzungen führen. Persönlichen Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Kittel, Schuhe, Schutzbrille) zu tragen. Verwenden einer Abzugshaube. - Inkubieren Sie Gewebe 100 % DCM zweimal, für 15 min auf einen Shaker bei RT
- In 100 % inkubieren DBE in RT bis Bildgebung und zur Aufbewahrung der Probe. Invertieren Sie vor Bildgebung die Röhren mehrmals um die Lösungen zu mischen.
Hinweis: Füllen Sie komplett Röhren mit DBE gegen Oxidation, die erfolglose Gewebe clearing führen kann. Schütteln Sie die Rohre nicht während der Inkubation DBE.
Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich. DBE ist giftig. Es kann Reizungen der Augen und Haut verursachen. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln. - Bild der gesamten Gewebeprobe mit einem Lichtmikroskop, der der Brechungsindex des organischen Lösungsmittel DBE übereinstimmt. Führen Sie bei einer gewünschten Vergrößerung und die Schrittweite für das ganze Gewebe Z-Stapeln.
- In 2 mL Röhrchen durch Inkubation bei 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol, danach jeweils für 1 Stunde bei RT enthaltenen Gewebe zu entwässern Dann pausiert die Proben in 100 % Methanol zweimal bei RT
4. Beispiele der Datenanalyse von ganz-Mount gefärbten Gewebe Bilder mit ImageJ
Hinweis: Siehe https://imageJ.nih.gov/ij/download.html für Download und Installation Anweisungen.
- Quantifizierung der Blutgefäß-Dichte (ergänzende Abbildung 2)
- Importieren Sie die gespeicherten Bilder nur der Kanal mit Blutgefäß Immunostaining auf ImageJ.
Hinweis: Die Bilder zur Quantifizierung sollten in Bezug auf Färbeverfahren und Bild Erwerb Zustand übereinstimmen. Identische Reagenzien sollten verwendet werden. Die Belichtungszeit sollte Intensität und Vergrößerung auch in den bildgebenden Verfahren20entsprechen. - Wandeln Sie das Bildfarbe in schwarz/weiß für Blutgefäß Dichte Quantifizierung. Wählen Sie dazu unter der Registerkarte "Bild" der Befehl "Anpassen" , dann die Option "Farbschwelle" . In die "Schwelle Color" Feld anzuzeigen, wählen Sie "Dark Background"20 und "B & W" unter "Schwellenwert Farbe".
- Um den Prozentsatz der Fläche von Blutgefäß Signal Hintergrund zu messen, die Registerkarte "Analyze" , dann den Befehl "analysieren Partikel" . Wählen Sie unter dem Display "analysiertTeilchen" die Optionen "klare Ergebnisse" und "Zusammenfassen" . Klicken Sie auf "OK".
- Kopieren Sie und fügen Sie den Wert des Bereichs Prozentsatz unter der Registerkarte "Zusammenfassung" in eine Tabellenkalkulation für die Analyse. Der Anteil der Fläche zeigt die Blutgefäß-Dichte. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.4 für jedes einzelne Bild.
- Importieren Sie die gespeicherten Bilder nur der Kanal mit Blutgefäß Immunostaining auf ImageJ.
- Quantifizierung des Adipocyte Größe21 (ergänzende Abbildung 3)
- Importieren Sie die gespeicherten Bilder von Adipozyten auf ImageJ.
- Um die Skalierung des Bildes einzustellen, Messen Sie die Länge der Skala in Pixel durch eine Linie, die Waage mit einem bekannten Abstand auf das Bild mit dem geradlinigen Auswahlwerkzeug nachzeichnen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Analyze" "Set Scale" . Die Entfernung der Linie, die vor verfolgt wurde wird automatisch in Pixel berechnet.
- Feld "Skalierung festlegen" Anzeige erscheint. Geben Sie die bekannten Abstand und Einheit der Länge. Wählen Sie "Global" zu den Maßstab für alle importierten Bilder anwenden, und klicken Sie auf "OK".
- Wählen Sie Bereich als die Methode der Messung unter der Registerkarte "Analyze" "wählen Sie " Set Messungen " . Es erscheint eine Liste verschiedener Optionen für Messungen. Wählen Sie die Option "Bereich" und klicken Sie auf "OK".
- Mit der Freihand-Auswahl-Werkzeug zeichnen Sie den Umfang der einzelnen Adipocyte von Interesse. Auf der Registerkarte "Analyze" wählen Sie den Befehl "Messen (Strg + M)" , und das Gebiet der Adipocyte erscheint. Wiederholen Sie diesen Vorgang für andere Adipozyten im Bild.
Hinweis: Um genaue Messungen zu gewährleisten, verwenden Sie mehrere Bilder für die Quantifizierung. - Kopieren Sie und fügen Sie die Flächenmaße in eine Kalkulationstabelle zur weiteren Analyse der Daten ein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aufgrund der Fragilität des Fettgewebes führt Methoden mit mehreren Verarbeitungsschritten und schneiden zu Entstellung von Fettgewebe Morphologie3 (Abbildung 1A). Jedoch kann ganze-Mount Färbung die Morphologie der Adipozyten gewährleisten genaue Interpretation der Ergebnisse (Abb. 1 b) bewahren.
Übermäßige Fixierung des Fettgewebes führt zu Fixiermittel-induzierte Autofluoreszenz. Wie in Abbildung 2Agezeigt, grünen und roten Kanäle für Tyrosin-Hydroxylase (TH) und PECAM-1 Signale, Färbung bzw. überschneiden sich in identischen Regionen des Gewebes, darauf hinweist, dass die Autofluoreszenz durch übermäßige Fixierung in PFA für 3 Tage aufgetreten sein könnten. Im Gegensatz dazu Abbildung 2 b zeigt ein repräsentatives Bild der gesamten-Mount Färbung, wenn die ordnungsgemäße Fixation durchgeführt wird, wie das Signal zum TH Beizen in verschiedenen Bereichen im Vergleich zu PECAM-1 Signal tritt, was zeigt, dass dieses Signal nicht Autofluoreszenz ist und ist in der Tat ein positives Signal.
Vollständig-hängen Färbung ist eine wichtige Visualisierungs-Tool für die Cre-LoxP-basierte Linie Ablaufverfolgung von Adipozyten15, mit mT/mG als ideale Reporter System18. Ng2, ein Marker für Adipocyte Stammvater Zellpopulation, ist ein Proteoglykan Plasmamembran. In diesem System Zellen Ng2-Cre-positiven express m-GFP, während m-Tomate in Ng2-Cre-Negative Zellen (Abbildung 3) ausgedrückt wird.
Fettgewebe ist ein unglaublich dynamisches Organ, in der Lage, erweitern und schrumpfen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen und Anforderungen20. Imaging-ganz-Mount gebeizt Fettgewebe ermöglicht eine Quantifizierung der Imorphological Änderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Vor allem ist Fettgewebe stark durchblutet, was ist wichtig bei der Vermittlung von metabolischen Homeostasis bei der raschen Veränderungen in der Energie-Ebene1. Zum Beispiel C57BL/6J Mäuse, die 24 Stunden des Fastens unterziehen Displaygröße deutlich kleiner Adipocyte (Abbildung 4), Lipolyse, angibt und ein Trend in der erhöhten Blutgefäß Dichte im Vergleich zu ständig gefüttert Mäuse (Abbildung 5). ImageJ-Software wurde eingesetzt, um die Größe der Fettzellen und Blutgefäß Dichte zu quantifizieren, wie oben beschrieben.
Clearing-Gewebe ist eine relativ neue Technik entwickelt, um die Undurchsichtigkeit des Fettgewebes ermöglicht Visualisierung tief in das Gewebe Band9,10 (Abbildung 6) entfernen. Hängen Sie vollständig-Färbung auf ungeräumten IWAT mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zeigte nur spärlich sympathische Innervation, da Nervenfasern unterhalb der Oberfläche des Gewebes nicht sichtbar gemacht werden konnte (Abb. 7A). Jedoch konnte Dichte neuronale Arborization nach Gewebe clearing und Immunolabeling mit der Verwendung von iDISCO + sowie die Verwendung von Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) (Abb. 7 b) beobachtet werden.
Abbildung 1: Vergleich von Fettgewebe Morphologie mit herkömmlichen morphologische Techniken und vollständig-hängen Färbung Technik. (A) H & E gefärbt Fettgewebe auf einem Paraffin-eingebetteten Teil (links), mit schwarzen Pfeilspitzen verzerrende Regionen der Adipozyten angibt. Lektin (Kohlenhydrat Binding Protein, weiße Pfeile) fluoreszierenden Farbstoff Einspritzung, immunofluorescent Färbung von F4/80 (Makrophagen Marker, gelbe Pfeilspitzen) und DAPI Kerne Färbung des Fettgewebes auf Cryosection (rechts). (B) weißen Fettgewebe Visualisierung mit ganz-Mount Färbung mit einer Schrittweite von 5 μm. Die Z-Stapel-Gesamttiefe erfasst ist rund 100 μm. Adipocyte Lipid Tröpfchen waren voller Flecken mit neutral Lipid Fleck (grau), und Blutgefäße waren voller Flecken mit PECAM-1. Aufnahme wurde mit Mikroskopie mit einer Schrittweite von 5 μm für Z-Stapeln (rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Visualisierung der neuronalen Fasern und Blutgefäße mit ganzen Berg gebeizt Fettgewebe. (A) repräsentative mikroskopische Aufnahmen von unerwünschten Ergebnissen aus ganzen-Mount gefärbten PWAT aufgrund übermäßigen Fixierung in PFA für 3 Tage. Überlappende Signale sind durch weiße Pfeilspitzen angezeigt. (B) repräsentative mikroskopische Aufnahmen von einem positiven Ergebnis aus ganzen-Mount gebeizt IWAT von Kontrolle Maus. Die Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Linie Ablaufverfolgung mit mT/mG-System in das Fettgewebe. Vertreter Bilder Cre-positiv (mG) und Cre-Negative (mT) Zellen in IWAT von Ng2-Cre; mT/mG-Maus. Die Bilder wurden bei 200 X Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Visualisierung und Quantifizierung des Adipocyte Größe. (A) repräsentative Bilder von Adipozyten in PWAT gefüttert und 24-Stunden gefastet C57BL/6J Mäuse mit neutral Lipid Färbung. Die Bilder wurden bei 200 X Vergrößerung aufgenommen. (B) Adipocyte Größenvergleich zwischen gefüttert und 24-h schnellsten C57BL/6J Mäuse mit ImageJ-Software. Werte werden ausgedrückt als ± SEM bedeuten; 2-tailed ungepaarten des Student t-test; p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäß Dichte. (A) repräsentative Bilder von Blutgefäßen im gefüttert und 24-Stunden gefastet C57BL/6J Mäuse mit PECAM-1 Antikörper. (B) Vergleich der Blutgefäße Dichte zwischen gefüttert und 24-Stunden gefastet C57BL/6J Mäuse mit ImageJ-Software. Werte werden ausgedrückt als ± SEM bedeuten; 2-tailed ungepaarten des Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Löschen des Fettgewebes unter Verwendung der Methode iDISCO +. Vor der Lichtung ist das Gewebe blickdicht. Das Gewebe wird am Ende des Gewebes clearing Schritte vollständig transparent.
Abbildung 7: Ganze-Mount gebeizt IWAT mit Gewebe gelöscht IWAT mit iDISCO + Methode verglichen. (A) Visualisierung der neuronalen Fasern mit TH Antikörper (1: 500) im gesamten-Mount gefärbten IWAT bei 100 X Vergrößerung mit konfokalen Mikroskopie mit einer Schrittweite von 5 μm. Die Z-Stapel-Gesamttiefe erfasst ist rund 100 μm. (B) Visualisierung der neuronalen Fasern mit TH Antikörper (1: 200) im gesamten-Mount gebeizt IWAT mit iDISCO + Protokoll bei 1,6 X Vergrößerung mit LSFM mit einer Schrittweite von 4 μm. Die Z-Stapel-Gesamttiefe erfasst ist ca. 8 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: Schematische Darstellung für mT/mG-Linie-Tracing-System. Ein duales fluoreszierende System, das Membran-gezielte eGFP und Membran-bezogenen TdTomato beschäftigt. Vor Cre Rekombination drückt sich die mT weltweit. Wenn die Zelle Cre ausdrückt, die mT-Kassette herausgeschnitten und mG wird dauerhaft ausgedrückt. pA stellt Polyadenylation Sequenzen nach dem Stopp-Codon. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung2: Anwendung von ImageJ Software zu quantifizieren Prozentbereich Blutgefäß Dichte. (A) "Bild" Registerkarte "Befehle und Optionen, um ein Bild in ein Schwarzweiß-Schwelle Farbe umwandeln. (B) Zusammenfassung Messung der Prozentbereich des Schiffes Dichte mit dem Befehl "Analysieren Partikel". Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 3: Anwendung von ImageJ Software Adipocyte Bereich quantifizieren. "Analysieren" Registerkarte ":"Set Scale"und"Messung"Befehle, um den Bereich der Adipocyte(s) zu messen. Anzeige der Messergebnisse zeigt den Bereich der einzelnen Adipocyte gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obwohl herkömmliche Techniken wie Histologie und Cryosection Vorteile für die Beobachtung von intrazellulären Struktur bieten, bietet ganz-Mount Färbung eine andere Perspektive in Fettgewebe Forschung, die 3D Visualisierung der zellulären ermöglicht Architektur der gering verarbeitete Gewebe.
Um erfolgreich durchzuführen, ganz-Mount zu beflecken, sollten folgende Hinweise berücksichtigt werden. Verschiedenen Fettgewebe-Depots können verschiedene Immunostaining Ergebnissen führen; Daher sollte die Art der Fettgewebe Depot verwendet zunächst ermittelt werden. Braunes Fettgewebe (BAT) ist beispielsweise im Vergleich zu weißen Fettgewebe (WAT) durch kleinere, multilocular Adipozyten21Dichter. Diese erhöhte Dichte der Fledermaus macht es schwierig für Antikörper durch das Gewebe durchdringen. Darüber hinaus ist die Größe des Fettgewebes auch unerlässlich für die richtige Antikörper Färbung, da zu große/dicke Gewebe auch nicht genügend Antikörper Durchdringung führen können. Daher sollte das Fettgewebe während tierische Dissektion im Rahmen der Gewährung, der distale Abschnitt des Fettgewebes Perigonadal verwendet werden, da dies die dünnste Region ist und kann für ausreichend Antikörper eindringen und konsistente Daten zulassen. Alternativ kann für dichteres Gewebe, eine fluoreszierende Reporter Mauslinie wie mT/mG, können zur besseren Visualisierung der Markierung von Interesse, da dies das Problem der unzureichenden Antikörper eindringen vermeidet. Anschließend 1 % PFA zur Fixierung des Gewebes dient zu bewahren die natürliche Verteilung von Proteinen und Gewebe Permeabilisierung und Antikörper eindringen22,23zu gewährleisten. Allerdings kann übermäßige Fixierung Antigen-Anerkennung zu verringern und Autofluoreszenz24zu produzieren. Dies ist auf die Reaktion zwischen Aldehyd-Gruppen auf PFA und anderen Aldehyd-haltigen Fixiermittel und Gewebeanteile, die fluoreszierende Verbindungen24schafft. Um die Notwendigkeit für ein Antigen-Retrieval-Schritt zu vermeiden, empfiehlt es sich, lassen Sie Gewebe in ein Fixiermittel für nur eine Stunde bei Raumtemperatur und die nächsten Schritte zu beginnen, sobald Fixierung abgeschlossenen7ist. Wie viele andere Immunolabeling Techniken ist titrieren der Antikörperkonzentration ein wesentlicher Schritt zur Problembehandlung um das gewünschte Signal zu gewährleisten.
In der Tat, es gibt mehrere Einschränkungen der gesamten-Mount Färbung trotz der oben genannten Bedeutung und Vorteile. Vollständig-hängen Färbung hat strenge Anforderungen hinsichtlich Gewebetyp und Größe, da nicht genügend Antikörper eindringen und ungleichmäßige Färbung in dickeren Geweben wie Muskeln und Leber kommen kann. Auch ist ganz-Mount Färbung nicht die genaueste Darstellung von bestimmten Antikörpern wie Tyrosin Hydroxylase (TH), ein Marker für das sympathische Nervensystem wie sein Signal oft durch dichten Fettgehalt im Fettgewebe (Abbildung 7) maskiert wird. Darüber hinaus Herausforderung die unebene Oberfläche von Fettgewebe auch eine für confocal imaging, da Signale auf verschiedenen Ebenen des Fettgewebes nicht einfach auf ein einzelnes Bild erfasst werden können. Daher ist die Quantifizierung der Signalintensität in Bilder von ganz-Mount Färbung Ertrag inkonsistente Ergebnisse für die gesamte Nervenfaser Arborization. Der distale Teil des PWAT ist in der Regel die wenigsten Lipid-Dichte; Daher erhalten Sie bessere Bilder aus diesem Bereich. Jedoch ob diese Gegend repräsentativ für das gesamte Gewebe für Immunostaining in allen Arten von Antikörpern ist sind weitere Untersuchungen erforderlich.
Ein Clearing-Verfahren reduziert indem Gewebe optisch transparent, Lichtstreuung ermöglicht die Visualisierung der Tiefenstruktur25. iDISCO + ist eine preiswerte Protokoll vor kurzem entwickelt, dass Mähdrescher vollständig-Immunolabeling mit Volumen-Bildgebung von verschiedenen großen geräumte Gewebe9hängen. Modifizierte iDISCO + Methoden mit LSFM belegen aktuelle Studien9,10 beobachtet dichten dendritischen Arborization auf WAT, die mit konventionellen Immunolabeling und konfokalen Mikroskopie gesehen werden können. Konventionelle konfokale Bildgebung verwendet einen Strahl Abbildungssystem und Lochkamera für Laserscanning. Die Scan-Geschwindigkeit und tiefe Eindringen sind Einschränkungen des Mikroskops; 3D Gewebe Dynamik sind so oft vermisst. Im Gegensatz dazu hat Licht-Blatt Mikroskopie offensichtliche Vorteile, denn es nutzt Blatt scannen und beleuchtet nur einen optischen Abschnitt zu einem Zeitpunkt, erfassen die Fluoreszenz-Moleküle innerhalb dieses Abschnitts. Darüber hinaus sind Fluorophore in anderen Abschnitten nicht aufgeregt, Foto-bleichen und phototoxische Effekte26zu verhindern. So kann die Höhe der Nerv Innervation in das Fettgewebe mit iDISCO + und LSFM genauer beurteilt werden. Trotzdem gibt es einige Einschränkungen für die Nutzung von iDISCO + und LSFM. Zum Beispiel sollten Benutzer beachten, dass nur Kanäle in der rot-dunkelrote Kanal mit iDISCO + kompatibel sind, da längere Wellenlängen des Lichts besser in der Lage sind die Probe27eindringen. Darüber hinaus ist Autofluoreszenz im blau-grünen Spektrum in große Gewebeproben, relativ hoch, so Bildgebung in der roten-dunkelrote Spektren hilft jedem Autofluoreszenz reduzieren,14. In Bezug auf transgene fluoreszierende Reporter Mäuse iDISCO + lässt sich Reporter Proteine zu visualisieren. Jedoch sollten Immunolabeling des fluoreszierenden Reporters mit einem sekundären Antikörper durchgeführt werden, da das körpereigene Signal während der clearing-Prozess14Gewebe verblassen kann. Diese Technik ist jedoch äußerst wertvoll für das Studium der Sympathikus-Fettgewebe Interaktionen und für die Untersuchung von adipösen Plastizität unter verschiedenen physiologischen und metabolischen Bedingungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) von Kanada, Pilot und Feasibility Study Grant Banting & Best Diabetes Zentrum (BBDC), der SickKids-Gründerfonds, H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen, J-r.k.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
