Summary
本研究的重点是展示全安装免疫染色和可视化技术作为一种理想的方法, 为脂肪组织结构和细胞成分的三维成像。
Abstract
脂肪组织是一种重要的代谢器官, 具有较高的可塑性, 对环境刺激和营养状态有反应。因此, 研究脂肪组织的形态和生物学的各种技术已经发展起来。然而, 传统的可视化方法仅限于研究二维切片中的组织, 无法捕获整个器官的3d 结构。在这里, 我们提出了全贴染色, 一种免疫组织化学方法, 保持完整的脂肪组织形态学与最小的处理步骤。因此, 脂肪细胞和其他细胞成分的结构保持没有扭曲, 实现了最具代表性的三维可视化组织。此外, 整个染色可以与血统追踪方法相结合, 以确定细胞的命运决定。然而, 这种技术有一些限制, 以提供有关脂肪组织的较深层次的准确部分的准确信息。为了克服这一限制, 可以进一步结合组织清除技术, 消除组织的不透明, 并允许使用光片荧光显微镜对整个脂肪组织解剖进行完整的可视化。因此, 结合这些技术可以获得更高的分辨率和更准确的脂肪组织结构表示。
Introduction
脂肪组织是储能的重要器官, 其特点是动态重塑和几乎无限的膨胀1。除了能量稳态外, 脂肪组织在50多只脂肪因子的激素分泌中也起着至关重要的作用, 以调节全身代谢功能2。脂肪组织有一个多样化的结构, 包括各种细胞类型, 包括成熟的脂肪细胞, 成纤维细胞, 内皮细胞, 免疫细胞, 和脂肪细胞祖细胞 3。最近的研究表明, 肥胖和其他代谢功能障碍可以显著改变脂肪组织功能和微环境, 其中包括但不限于脂肪细胞的扩大, 炎症细胞的浸润 (例如,巨噬细胞) 和血管功能障碍3。
传统的形态学技术, 如组织学和冷冻合成, 证明了在研究脂肪生物学的几个局限性, 如冗长的化学处理步骤, 这可能导致组织收缩和结构变形3, 4. 我的工作是什么？此外, 这些二维技术不足以观察不同细胞类型所施加的细胞间相互作用, 因为所获得的切片仅限于整个组织3的较小区域。与传统的荧光成像方法相比, 全贴染色不需要额外的侵入性步骤, 如嵌入、切片和脱水;因此, 这避免了抗体特异性降低的问题。因此, 它是一种简单有效的脂肪组织成像方法, 具有较好的脂肪细胞形态和整体脂肪组织结构5。因此, 建立了一种快速、廉价的免疫标记技术, 以保存脂肪组织三维结构1,6,7, 8.
然而, 尽管使用全贴染色保存脂肪组织形态, 但这项技术仍然无法想象组织脂质表面下的内部结构。最近的几项研究9,10 已建立组织清除技术结合全身安装免疫标记 1,6, 允许在脂肪组织中进行全面的三维可视化。特别是, 在最近的研究中, 密集的神经网络和血管网络被成像9,10,11,12与三维体积成像。事实上, 研究脂肪组织在不同生理条件下的神经和血管可塑性是研究其生物学的关键。溶剂清除器官 (isico +) 组织清除的免疫标签三维成像是一个由甲醇预处理、免疫标记和用有机化学试剂清除组织不透明组成的过程 (dcm)) 和二苯醚 (dbe)13,14。通过使脂肪组织完全透明, 可以获得更准确的解剖表示组织内, 如血管和神经纤维可以获得9,10.idisco + 的优点在于它与各种抗体和荧光记者11、14兼容, 并已在多个器官甚至胚胎14中证明了成功.然而, 它的主要局限性是潜伏期长, 完成整个实验需要 1 8 到 2 0天。
全装染色的另一个重要应用是结合谱系追踪系统对细胞命运的可视化。谱系追踪是细胞中特定基因标记的标记, 可传递给所有子细胞, 并随着时间的推移而守变15。因此, 它是一个强大的工具, 可以用来确定细胞后代的命运.自20世纪90年代以来, Cre-LoxP 重组系统已成为生物中追踪谱系的有力方法.当表达 cre 的小鼠线, dna 重组酶, 与另一小鼠线交叉表示一个记者, 是相邻的 loxp-stop-loxp 序列, 记者蛋白表示 15.
对于全装染色, 使用荧光多色记者是适用于脂肪组织的成像, 因为它允许最小的干扰细胞内活动的脂肪细胞 16.然而, 传统的记者通常染色细胞质, 使其难以追踪白脂肪细胞的谱系,其中细胞质含量有限17。为克服这一问题, 使用膜结合荧光 ttomatich-fp (mt/mg) 记者标记是一个理想的工具。膜靶向番茄在 Cre-negative 细胞18中表达。切除后, 会发生向膜靶向 egfp 表达的开关, 使本报记者适合追踪脂肪细胞祖细胞的血统 17,18 (补充图 1)。
本文的目的是提供一个详细的协议, 整个安装染色, 并说明如何将其与其他技术相结合, 研究脂肪组织的发展和生理。本协议中描述的两个应用示例是它与 1) 多色记者小鼠行一起识别脂肪细胞的各种来源, 2) 组织清除, 以进一步显示白色脂肪组织 (wat) 中的神经乔木化。
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Protocol
所有实验动物规程都得到了苯基因组学中心 (tcp) 动物护理委员会的批准, 符合加拿大动物护理委员会的标准。老鼠保持在12小时的光/黑暗循环中, 并免费获得水和食物。采用7个月大的 c57bl/6j 雄性小鼠进行全装染色试验。
注: 第1至第2节按时间顺序排列, 第3节是第1节之后的一个可选步骤。第4节可在第2部分完成后进行脂肪细胞大小和血管密度分析。
1. 材料制备和组织分离
- 准备新鲜的1% 聚甲醛 (pfa) 稀释在1x 磷酸盐缓冲盐 (pbs) 组织固定。准备0.3% 的非离子表面活性剂, 在 1x pbs (以下简称 pbs-0.3 t) 中稀释, 用于后续的组织清洗步骤。
注: 对于每个组织, 准备大约 1.5 ml 的 1% pfa, 以确保完全浸入。固定体积可能会增加或减少, 这取决于组织的大小。
注意: 此步骤是危险的, 因为 pfa 具有腐蚀性和毒性。佩戴个人防护设备 (如丁腈手套、实验室外套、鞋类、安全护目镜), 并在通风罩中手柄。 - 按照批准的程序对动物进行安乐死 (例如, 宫颈脱位和二氧化碳窒息)。立即解剖所需的脂肪组织库 (例如, 腹股沟白色脂肪组织或腹膜白色脂肪组织)18。
- 用解剖剪刀, 将组织切割成大约 0.5-1 厘米大小的 100 x 15 毫米2培养皿, 并将其浸入填充 1% pfa 的微离心管中。继续冰上。
2. 白色脂肪组织的全贴染色
- 解剖完成后, 将 1% pfa 中的组织样本从冰层移动到室温 (rt) 1小时, 然后将组织转移到12、24孔或24孔细胞培养板, 以便更快地清洗。
- 用 pbs-0.3 t 清洗组织, 在倾斜22°的振动台上, 在 rt 中每次 3次, 每次 5分钟, 以每分钟20-25 度倾斜作为速度。
注: 对于涉及使用振动台的所有后续步骤, 请使用此倾斜和速度。
注: 如果不需要使用多色记者小鼠行 (如 mtmg 和额外的抗体染色), 则该组织在步骤2.2 之后就可以进行显微镜检查了。 - 加入 0.5–1 ml 阻滞剂 (5% 的动物血清在 pbs-0.3 t 中稀释)。将盘子放在振动台上, 在 rt 中孵育1小时。
- 吸入阻滞液, 用1% 的动物血清加入在 pbs-0.3 t 中稀释的原代抗体。
- 将板材放置在振动台上, 温度为4°c。
- 第二天, 用 pbs-0.3 t 3次清洗纸巾, 每次5分钟。
- 使用适当的二级抗体稀释在 pbs-0.3 t。在每口井加入 0.5–1 ml 二级抗体溶液。用铝箔包裹板材, 并在振动台上孵育1小时。
注: 在黑暗中稀释二级抗体, 以防止光漂白。 - 二次抗体培养后, 用 pbs-0.3 t 清洗两次 5分钟, 每次在 rt 中, 如果不需要中性脂质染色, 则在 rt 中对样本进行清洗。如果需要使用中性脂质染色进行脂滴可视化, 请使用 1x pbs (不含非离子表面活性剂) 清洗两次, 每次5分钟。
- 洗涤步骤后, 用1:1500 稀释因子稀释的中性脂质染色在 1 x pbs 中孵育30分钟。这些组织现在已经准备好进行显微镜检查。对于未来的成像, 组织可以存储在此溶液在4°c。
注: 成像质量会随着时间的推移而降低;因此, 成像的最佳时间是在1或2天内。 - 使用钳子, 将组织平放在 24 x 60 mm²玻璃覆盖片上, 并将其放置在倒置的共聚焦激光显微镜系统上。
- 如果需要用 dapi 染色细胞核, 添加1-2 滴含有 dapi 的安装介质, 使组织完全淹没, 防止其干燥。
- 要在多个焦距平面上获得全安装染色组织的图像, 请执行深度为100–150微米的 z 堆栈, 在所需的放大倍率下执行4-6 微米步长。
3. 使用 isdisco + 进行组织清理和免疫标记
注: 本协议基于以前发布的程序9、10、19.
- 固定和甲醇预处理
- 在4°C 的情况下, 在2毫升的微离心管中, 用 1x pbs 将组织中的 4% pfa 中稀释。
注: 将组织留在2毫升管中进行以下所有治疗, 直至成像。 - 第二天, 用 1x pbs 清洗组织三次, 在 rt 的振动台上每次洗1小时。
注: 此步骤可以是暂停点, 使样品在 rt 或4°c 过夜。 - 脱水在 rt 的组织在 20%, 40%, 60% 和80% 甲醇, 随后, 每个1小时。在 rt 中脱水100% 甲醇 1小时, 然后将组织转移到新鲜的100% 甲醇中, 在4°c 孵育1小时。
注: 在蒸馏水中稀释甲醇。在甲醇孵育过程中, 只要组织样品浸入床, 就无需将样品放在振动台上。
注意: 这一步是危险的, 因为甲醇是有毒的。它在明火时高度易燃。佩戴个人防护设备 (例如, 丁腈手套、实验室外套、安全护目镜), 并在通风罩中手柄。将甲醇存放在远离点火的地方, 并存放在易燃的安全柜中。 - 用5% 的过氧化氢 (h2o2;130% h2o2 的体积在4°c 下隔夜稀释 5 卷100% 甲醇).
注意: 30% 的过氧化氢对皮肤和眼睛接触非常危险。佩戴个人防护设备 (例如, 丁腈手套、实验室外套、安全护目镜), 并在通风罩中手柄。 - 将 rt 的组织在80%、60%、40%、20% 甲醇和 1x pbs 中补充, 然后各补充1小时。
- 用0.2% 的非离子表面活性剂在 1 x pbs 中稀释两次, 在 rt 的振动台上每次1小时。
- 在4°C 的情况下, 在2毫升的微离心管中, 用 1x pbs 将组织中的 4% pfa 中稀释。
- 免疫标记
注: 在免疫标记开始后, 在清除完成之前, 用每个步骤中使用的溶液将含有组织的2毫升管填充到管顶部, 以防止组织氧化。- 在孵育的桌面轨道振动台上, 在 1x pbs、0.2% 非离子表面活性剂、20% 二甲基亚硫酸 (dmso) 和 0.3 m 甘氨酸的溶液中对组织进行渗透, 使其具有渗透性。
注: 37°c 渗透层的最大孵化时间为2天。 - 在孵育的桌面轨道振动台上, 在13°c 下阻断 1x pbs、0.2% 非离子表面活性剂、10% dmso、5% 驴血清和 1% fc 块的溶液中的组织2天。
注: 阻塞步骤的最大孵化时间为2天。 - 在孵育的桌面轨道振动台上, 在13°c 的情况下, 将所感兴趣的一级抗体中的组织孵育 1年, 在130°c 时, 将其培养出。
- 用 1x pbs、0.2% 聚山梨酸酯20和10μgml 肝素在 x 光床上清洗 5次, 每次1小时。
注: 此步骤可以是一个暂停点, 以便在 rt 中过夜保留示例。 - 在桌面轨道振动台上的液中培养具有二级抗体的组织 4天, 溶液中含有 1x pbs、0.2% 聚山梨酸盐20、10μgml 肝素和 5% 驴血清。
注: 从步骤 3.2.5, 所有样品都需要用铝箔包裹, 以防止二次抗体的光漂白。 - 在 rt 振动台上的振动台上清洗 1x pbs、0.2% 聚山梨酸盐20和10μgml 肝素溶液中的组织 5次, 每次2小时。
注: 此步骤可以是一个暂停点, 将样品留在 rt 过夜。
- 在孵育的桌面轨道振动台上, 在 1x pbs、0.2% 非离子表面活性剂、20% 二甲基亚硫酸 (dmso) 和 0.3 m 甘氨酸的溶液中对组织进行渗透, 使其具有渗透性。
- 白色脂肪组织的组织清理与体积成像
- 通过在20%、40%、60% 和80% 的甲醇中孵育2毫升管中的组织, 然后在 rt 中各脱水1小时。然后, 在 rt 将样品脱水两次, 在100% 甲醇中脱水。
注: 此步骤可以是一个暂停点, 让您的样品在 rt 过夜的100% 甲醇。 - 在振动台上用2卷 dcm 至1体积甲醇的混合物在振动筛上的 rt 上培养3小时的组织。
注: dcm 是易失的。确保管子密封紧密, 以防止蒸发。
注意: 此步骤是危险的。dcm 吸入时是有毒的。长期接触有可能导致化学烧伤。穿戴个人防护设备 (例如, 丁腈手套、实验室外套、鞋类、安全护目镜)。使用通风罩。 - 在 rt 的振动台上, 用 100% dcm 对组织进行两次, 每次15分钟。
- 在 rt 中100% 的 dbe 中进行培养, 直到成像和样品存储。在成像之前, 将管道倒置几次, 以混合溶液。
注: 用 dbe 完全填充管道, 以防止氧化, 这可能会导致组织清除失败。在 dbe 孵育过程中, 不要晃动输卵管。
注意: 此步骤是危险的。dbe 是有毒的。它可以对眼睛和皮肤造成刺激。佩戴个人防护设备 (例如, 丁腈手套、实验室外套、安全护目镜), 并在通风罩中手柄。 - 用与有机溶剂 dbe 折射率相匹配的光学显微镜对整个组织样品进行成像。以所需的放大倍率和步长对整个组织进行 z 堆叠。
- 通过在20%、40%、60% 和80% 的甲醇中孵育2毫升管中的组织, 然后在 rt 中各脱水1小时。然后, 在 rt 将样品脱水两次, 在100% 甲醇中脱水。
4. 利用 imagej 从全安装染色组织图像中进行数据分析的实例
注: 有关下载和安装说明, 请参阅 https://imageJ.nih.gov/ij/download.html。
- 血管密度的定量 (补充图 2)
- 将只保存的通道图像与血管免疫染色导入到 imagej。
注: 用于量化的图像在染色程序和图像采集条件方面应一致。应使用相同的试剂。在成像过程中, 曝光时间、强度和放大倍率也应该是等效的。 - 将图像颜色转换为黑白, 以进行血管密度定量。为此,请在 "图像"选项卡下, 选择"调整" 命令,然后选择"颜色阈值"选项。在 "阈值颜色" 显示框中, 选择 "深色背景"20 , 然后在"阈值颜色"下选择"b & amp; w "。
- 要根据背景测量血管信号面积的百分比, 请选择"分析"选项卡, 然后选择"分析粒子"命令。在"分析的粒子"的显示下, 选择"清除结果"和"汇总"选项。点击"确定"。
- 将摘要选项卡下的百分比区域的值复制并粘贴到电子表格中进行分析。面积的百分比将表示血管密度。对每个图像重复4.3.1 的步骤–4.3.4。
- 将只保存的通道图像与血管免疫染色导入到 imagej。
- 脂肪细胞大小21的定量 (补充图 3)
- 将保存的脂肪细胞图像导入到 imagej。
- 若要设置图像的比例, 请使用直线选择工具将线条跟踪到图像上具有已知距离的比例, 以像素为单位测量比例的长度。在"分析"选项卡下, 选择"设置比例"命令。之前跟踪的行的距离将以像素为单位自动计算。
- 将出现"设置比例" 显示框。输入已知的距离和长度单位。选择"全局"以应用所有导入图像的比例设置, 然后单击"确定"。
- 要选择区域作为测量方法, 请在"分析"选项卡下选择"设置测量"命令。将显示不同测量选项的列表。选择"区域"选项, 然后单击"确定"。
- 使用徒手选择工具, 追踪每个感兴趣的脂肪细胞的周长。在"分析"选项卡下, 选择"测量 (ctrl + m)"命令, 并将显示脂肪细胞的区域。对图像中的其他脂肪细胞重复此过程。
注: 为确保准确测量, 请使用多个图像进行量化。 - 将区域测量值复制并粘贴到电子表格中, 以便进行进一步的数据分析。
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Representative Results
由于脂肪组织的脆弱性, 涉及多个处理步骤和切片的方法可能导致脂肪组织形态的毁容 3 (图 1a)。然而, 全贴染色可以保持脂肪细胞的形态, 确保准确解释结果 (图 1b)。
脂肪组织的过度固定会导致固定性的自体荧光。如图 2 a所示, 分别对酪氨酸羟化酶 (th) 和 pecam-1 信号进行绿色和红色通道染色, 在组织的相同区域重叠, 这表明由于 pfa 中过度固定 3天, 可能发生了自体荧光。相反,图 2b显示了在进行适当固定时的全装染色的代表性图像, 因为 th 染色的信号发生在相对于 pecam-1 信号的不同区域, 表明该信号不是自荧光的,实际上是一个积极的信号。
全贴染色是基于 cre-loxp 的脂肪细胞15谱系追踪的重要可视化工具, 其中mt/mg 是理想的报告系统18。ng2 是脂肪细胞祖细胞群的标记, 是一种质膜蛋白聚糖。在这个系统中, ng2-cre-cre-cre-gefp 表达 m-gfp, 而 m-GFP 则在 ng2-cre-cre-阴性细胞中表达 (图 3)。
脂肪组织是一个令人难以置信的动态器官, 能够在不同的生理条件下膨胀和收缩, 并要求20。成像全贴染色脂肪组织允许在不同的实验条件下定量的非孤儿学变化。特别是脂肪组织是高度血管化, 这是重要的调解代谢稳态后, 迅速变化的能量水平 1.例如, 经过24小时禁食的 c57bl/6j 小鼠的脂肪细胞大小明显较小 (图 4), 表明与连续喂养的小鼠相比, 脂肪溶解和血管密度升高的趋势 (图 5)。影像学软件被用来量化脂肪细胞的大小和血管密度, 如上所述。
组织清理是一种相对较新的技术, 旨在去除脂肪组织的不透明, 以便在组织体积 9、10 的深处进行可视化 (图 6)。使用共聚焦显微镜在未清除的 iwat 上进行全贴染色, 仅显示稀疏的交感神经支配, 因为组织表面下的神经纤维无法可视化 (图 7a)。然而, 使用 isico + 以及使用荧光显微镜 (lsfm), 在组织清除和免疫标记后可以观察到致密的神经碳化 (图 7b)。
图 1: 脂肪组织形态与常规形态学技术和全贴装染色技术的比较.(a) 石蜡嵌入部分 (左) 上的 h & amp; e 染色脂肪组织 (左), 黑色箭头显示脂肪细胞的扭曲区域。凝集素 (碳水化合物结合蛋白, 白色箭头) 荧光染料注射, fn 80 免疫荧光染色 (巨噬细胞标记, 黄色箭头), 并 dapi 细胞核染色脂肪组织的冷冻 (右)。(b) 使用步长为5μm 的全安装染色进行白色脂肪组织可视化。捕获的 z 堆栈深度约为100μm。用中性脂质染色 (灰色) 染色脂肪细胞脂滴 (灰色), 用 pecam-1 染色血管。用显微镜拍摄图像, z 堆叠 (红色) 的步长为5μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用全身染色脂肪组织可视化神经纤维和血管。(a) 代表性的显微镜图像的不良结果, 由于过度固定在 pfa 3天的全安装染色 pwat。重叠信号由白色箭头表示。(b) 具有代表性的微观图像, 从控制鼠标的全安装染色 iwat 的积极结果。这些图像是以100x 放大倍率拍摄的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:在脂肪组织中使用 mt/mg 系统进行谱系追踪.ng2-cree 的 iwat 中的代表性图像 cre-gn (mg) 和 cre-ner-负 (mG) 细胞;鼠标。这些图像是以200x 的放大倍率拍摄的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 脂肪细胞大小的可视化和定量.(a) 使用中性脂质染色的24小时禁食 C57BL/6J 小鼠 pwat 中脂肪细胞的代表性图像。这些图像是以200x 的放大倍率拍摄的。(b) 使用 imagej 软件对喂食和24小时禁食的 c57bl/6j 小鼠的脂肪细胞大小进行比较。值表示为均值±sem;2尾未配对学生的t测试;p & lt; 0.001。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 血管密度的可视化和定量.(a) 使用 pecam-1 抗体的24小时禁食 C57BL/6J 小鼠血管的代表性图像。(b) 利用 imagej 软件比较喂食和24小时禁食的 C57BL/6J 小鼠的血管密度。值表示为均值±sem;2尾未配对学生的t考试。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 使用 isico + 方法清除脂肪组织.在清除之前, 组织是不透明的。组织在组织清除步骤的末端变得完全透明。
图 7:与使用 isdisco + 方法进行组织清除的 iDISCO 相比, 全装染色 iDISCO.(a) 使用 th 抗体 (1:500) 在100x 放大倍率下显示神经纤维, 共聚焦显微镜, 步长为5μm。捕获的 z 堆栈深度约为 100μm.(b) 使用 th 抗体 (1:200) 在全安装染色 iDISCO 中可视化神经纤维, 使用步长为4μm 的 lsfm, 采用1.6x 放大倍率的 idisco + 协议。捕获的 z 堆栈深度总数约为8毫米,请点击此处查看此图的较大版本.
补充图 1: mt/mg 沿袭追踪系统示意图.一种双荧光系统, 采用膜靶向 egfp 和膜靶向 tdTomato。在 cre 重组之前, mt 是全球表示的。当细胞表示 cre 时, mt 盒被切除, mg 被永久表达。pa 表示停止密码子后的多腺苷酸化序列。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 2: imagej 软件用于量化血管密度的百分比面积。(a) "图像" 选项卡命令和选项, 用于将图像转换为黑白阈值颜色。(b) 使用 "分析粒子" 命令对容器密度百分比面积进行简要测量。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 3: imagej 软件在脂肪细胞面积量化中的应用."分析" 选项卡: "设置比例" 和 "测量" 命令, 以测量脂肪细胞的面积。结果显示了测量到的每个脂肪细胞的面积。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
尽管传统的组织学和冷冻技术为观察细胞内结构提供了好处, 但全贴染色为脂肪组织研究提供了不同的视角, 从而实现了细胞的三维可视化最小处理组织的结构。
为了成功地进行整体染色, 应考虑以下建议。不同的脂肪组织库可以产生不同的免疫染色效果;因此, 应首先确定所使用的脂肪组织仓库的类型。例如, 棕色脂肪组织 (bat) 相对于白色脂肪组织 (wat) 密度较高, 原因是较小的多室脂肪细胞 21.这种 bat 密度的增加使得抗体难以渗透到组织中。此外, 脂肪组织的大小也是必要的适当的抗体染色, 因为太大/厚的组织也可能导致抗体渗透不足。因此, 当获得脂肪组织在动物解剖过程中, 应使用周围脂肪组织的远端部分, 因为这是最薄的区域, 可以允许足够的抗体渗透和一致的数据。或者, 对于密度较高的组织, 使用荧光记者鼠标线, 如 mt/mg, 可以让感兴趣的标记更好地可视化, 因为这样可以避免抗体渗透不足的问题。随后, 1% pfa 用于组织固定, 以保持蛋白质的自然分布, 并确保组织渗透性和抗体渗透 22,23。然而, 过度固定会降低抗原识别, 产生自体荧光24。这是由于 pfa 上的醛基团与其他含有醛的固化剂和组织成分之间的反应, 从而产生荧光化合物24。为了防止需要抗原检索步骤, 建议在室温下只将组织留在固定装置中一个小时, 并在固定完成后立即开始下一步.与许多其他免疫标记技术一样, 滴定抗体浓度是确保所需信号的重要故障排除步骤。
事实上, 尽管有上述的意义和优势, 但全装染色还是有几个局限性的。全贴染色对组织类型和大小有严格的要求, 因为抗体渗透不足和染色不均匀可能发生在较厚的组织, 如肌肉和肝脏。此外, 全装染色并不是某些抗体的最准确的表示, 例如交感神经系统的标记酪氨酸羟化酶 (th), 因为它的信号通常被脂肪组织中密集的脂质含量所掩盖 (图 7)。此外, 脂肪组织表面的不均匀也对共聚焦成像提出了挑战, 因为位于脂肪组织不同层的信号不可能在一张图像上轻易捕获。因此, 对全装染色获得的图像中的信号强度进行量化, 可以获得全神经纤维树根化不一致的结果。pwat 的远端部分通常是最不脂密集的;因此, 可以从这一区域获得更好的图像。然而, 这个区域是否代表整个组织在所有类型的抗体中进行免疫染色, 还需要进一步研究。
通过使组织在光学上透明, 一种清除方法减少了光散射, 从而实现了深层结构25的可视化。isico + 是最近开发的一种廉价协议, 它将整体安装免疫标记与各种大型清除组织的体积成像结合起来。最近的研究 9,10在 wat上观察到常规免疫标记和共聚焦显微镜无法看到的密集树突状树状树状树状树状树状树状树状树状树状树状树状的修正方法。传统的共聚焦成像使用成像光束系统和针孔进行激光扫描。扫描速度和穿透深度是显微镜的局限性;因此, 3d 组织动力学经常被错过。相反, 光片显微镜有明显的优点, 因为它使用片状扫描, 一次只照亮一个光学部分, 捕获该部分内的所有荧光分子。此外, 其他部分的氟不会被激发, 从而防止光漂白和光毒性效应 26。因此, 可以使用 isico + 和 lsfm 更准确地评估脂肪组织内神经神经支配的数量。尽管如此, 使用 isico + 和 lsfm 仍有一些限制。例如, 用户应该注意, 只有红色和远红色通道中的通道与 isico + 兼容, 因为较长的波长的光能够更好地穿透样品27。此外, 蓝绿色光谱中的自体荧光在大型组织样本中相当高, 因此在红色和远红色光谱中的成像将有助于减少发生14的任何自体荧光。对于转基因荧光记者小鼠, isico + 可用于显示记者蛋白。然而, 荧光记者的免疫标记与二级抗体应进行, 因为内源性信号可能会在组织清除过程中消失14。然而, 该技术对于研究交感神经系统脂肪组织相互作用和研究不同生理和代谢条件下的脂肪可塑性具有十分重要的价值。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的资金来自加拿大自然科学和工程研究理事会 (nserc)、班廷和最佳糖尿病中心 (bbdc) 的试点和可行性研究赠款、给 h-k 的病童启动基金。s. 医学研究中心计划 (2015r1aa2009124), 通过由科学、信息和通信技术和信息通信技术部资助的韩国国家研究基金会 (nrf) 向 j-r. k。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
