Summary
Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.
Abstract
Yağ dokusu yüksek plastisite ile önemli bir metabolik organ ve çevresel uyaranlara ve besin durum duyarlı. Bu nedenle, Morfoloji ve yağ dokusu biyoloji çalışmaya çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri 3D Mimarlık bütün organ yakalamak başarısız doku, 2D bölümlerde eğitim için sınırlıdır. Burada bütün-mount mevcut boyama, en az işlem adımları ile olduğu gibi yağ dokusu morfoloji korur bir immünhistokimya yöntemi. Bu nedenle, adipositler ve diğer hücresel bileşenleri yapılar dokusunun en iyi temsil eden 3 boyutlu görselleştirme elde bozulma korunur. Buna ek olarak, Bütün Dağı boyama hücre kader kararlar belirlemek için soy izleme yöntemleri ile birleştirilebilir. Ancak, bu teknik daha derin bölgelerinde yağ dokusu ile ilgili doğru bilgi sağlayan bazı sınırlamalar vardır. Bu sınırlamayı aşmak için bütün Dağı boyama daha fazla doku doku solukluk kaldırmak ve tüm yağ dokusu anatomi ışık sayfalık floresan mikroskopisi kullanılarak tam görselleştirme için izin vermek için teknikleri temizlenmesi ile kombine edilebilir. Bu nedenle, bir daha yüksek çözünürlük ve yağ dokusu yapıları daha doğru bir şekilde temsil bu tekniklerin birleşimi ile yakalanabilir.
Introduction
Yağ dokusu enerji depolama için önemli bir organdır ve dinamik remodeling ve neredeyse sınırsız genişleme1ile karakterizedir. Enerji homeostazı yanı sıra yağ dokusu da tüm vücut metabolik fonksiyon2modüle için 50'den fazla adipokines hormon salgısı önemli bir rol oynar. Yağ dokusundan oluşan çeşitli mimari olgun adipositler, fibroblastlar, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve adipocyte progenitör hücrelerin3de dahil olmak üzere hücre türleri vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda obezite ve diğer metabolik fonksiyon bozukluğu önemli ölçüde yağ dokusu işlev ve hangi içerir ancak adipositler, iltihabi hücre infiltrasyonu genişleme için sınırlı değildir onun microenvironment değiştirebilirsiniz göstermiştir (Örneğin, makrofajlar) ve vasküler disfonksiyon3.
Histoloji ve cryosectioning gibi geleneksel morfolojik teknikleri gibi doku büzülme ve yapısı bozulma3' eyol açabilir uzun kimyasal işleme adımlarını adipose biyoloji okuyan bazı sınırlamaları göstermek, 4. Ayrıca, bu 2D teknikler elde edilen bölümler tüm doku3daha küçük bölgelere sınırlı olarak hücreler arası etkileşimler tarafından farklı hücre tipleri, sarf gözlemlemek yetersizdir. Floresan görüntüleme kıyasla geleneksel yöntemleri, Bütün Dağı boyama katıştırma, kesit ve su kaybı gibi ek invaziv adımları gerektirmez; Böylece, bu antikor özgüllük azalan sorunu önler. Bu nedenle, adipocyte Morfoloji ve genel yağ doku yapısı5daha iyi korunması ile görüntüleme yağ dokusu için basit ve etkili bir yöntem olduğunu. Bu nedenle, bütün bir hızlı ve ucuz immunolabeling Teknik yağ dokusu 3D Mimarlık1,6,7,8korumak için belirlenen boyama monteli.
Ancak, Bütün Dağı boyama kullanımı ile yağ dokusu morfoloji korunması rağmen bu teknik dokusunun lipid yüzeyin altında iç yapıları görselleştirmek hala değiştiremiyor. Birkaç son çalışmalar9,10 yağ dokusu içinde kapsamlı 3D görüntüleme için izin vermek için bütün-mount immunolabeling1,6 ile birlikte teknikleri takas doku kurduk. Özellikle, yoğun nöral ve damarlara ağları son çalışmalar9,10,11,12 ile 3B cilt görüntüleme görüntülenir. Nitekim, Yağ dokusundan farklı fizyolojik koşullar altında sinir ve damar plastisite eğitim onun biyoloji çalışma için gerekli olduğunu. Immunolabeling etkin üç boyutlu görüntüleme solvent temizlenmiş organlar (iDISCO +) doku Temizleme metanol öncesi tedavisi, immunolabeling, oluşan ve organik kimyasal reaktifler diklorometan (DCM ile doku solukluk, takas bir süreçtir ) ve dibenzyl eter (DBE)13,14. Yağ dokusu tamamen saydam yaparak, kan damarları ve sinir lifleri gibi doku içinde anatomi daha doğru bir temsil9,10elde edilebilir. IDISCO + çeşitli antikor ve floresan gazetecilere11,14ile uyumlu ve birden fazla organ ve hatta embryoes14başarı göstermiş olduğu avantajları vardır. Ancak, onun ana sınırlama 18-20 gün tüm deney tamamlamak için gerekli olan bir uzun bir kuluçka zamanı geldi.
Bütün Dağı boyama başka bir önemli hücre kaderi bir soy izleme sistemi ile birlikte görselleştirme bir uygulamadır. Soy izleme tüm kızı hücrelere geçişini sağlamak ve zaman15korunmuş bir hücreye belirli bir gen/işaretleyici etiketleme olduğunu. Bu nedenle, bu bir hücrenin Döl15kaderini belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır. 1990'lardan beri Cre-LoxP rekombinant sistem soy izleme yaşam için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir organizmalar15. Ne zaman bir loxP-STOP-loxP dizisine bitişik bir muhabir ifade başka bir fare çizgi ile Cre, bir DNA recombinase enzim ifade eden fare haddini aştı, ifade15muhabir proteindir.
Bütün Dağı boyama için floresan çok renkli gazetecilere kullanımı adipocyte16hücre içi faaliyetleri ile minimal girişim için izin verdiği için yağ dokusunun görüntüleme için uygundur. Ancak, geleneksel gazeteciler genellikle sitoplazmik içerik17sınırlı beyaz adiposit soyundan izini zorlaştırır sitoplazma, leke. Bu sorunu çözmek için floresan tdTomato membran/membran bağlı eGFP (mT/mG) muhabir işaret kullanımını ideal bir araçtır. TdTomato membran hedefli Cre-negatif hücreleri18' ifade edilir. CRE eksizyon membran hedefli eGFP ifade için bir geçiş oluşur, bu muhabir adipocyte ataları17,18 (Ek şekil 1) soy izleme için uygun yapma.
Bütün Dağı boyama için detaylı bir protokol sağlar ve geliştirme ve yağ dokusu fizyolojisi çalışmaya diğer teknikleri ile birleştirilmesi göstermek için bu kağıt amacı budur. İki uygulamalar bu iletişim kuralında tanımlanan kullanımı adiposit ve 2) doku daha fazla beyaz Yağ dokusundan (WAT) sinir arborization görselleştirmek için takas çeşitli kökenleri tanımlamak için 1) çok renkli muhabir fare çizgili örnekleridir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Phenogenomics (TCP) Hayvan Bakımı Kanada Konseyi standartlarına standartlarla uyumlu için tüm deneysel hayvan iletişim kuralları Center hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi. Fare 12-h açık/koyu döngüleri muhafaza ve ücretsiz erişim su ve yemek için sağladı. 7 ay bütün Dağı boyama deneyde eski C57BL/6J erkek fareler kullanıldı.
Not: Bölüm 1-2 Bölüm şu Bölüm 1 sonra isteğe bağlı bir adım olmanın 3 ile kronolojik sırayla vardır. Bölüm 4 bölümü 2 tamamlanmasından sonra adipocyte boyut ve damar yoğunluğu çözümlenecek gerçekleştirilebilir.
1. malzeme hazırlama ve doku yalıtım
- 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) doku fiksasyon için x seyreltilmiş taze %1 paraformaldehyde (PFA) hazırlayın. 1 x PBS içinde seyreltilmiş % 0,3 Nonyonik yüzey aktif hazırlamak (bundan sonra PBS anılacaktır-0.3T) sonraki doku adımları yıkama için.
Not: her doku için yaklaşık 1,5 mL % 1'lik hazırlamak PFA komple daldırma emin olmak için. Fiksasyon birim artırılması veya doku boyutuna bağlı olarak azaltılması.
Dikkat: PFA aşındırıcı ve zehirli olduğu gibi bu adım, zararlıdır. Aşınma kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, Ayakkabı, koruyucu gözlük) ve tanıtıcı bir duman Hood. - Hayvanlar (Örneğin, servikal çıkık ve/veya karbon dioksit boğulma) onaylı bir yordam göre ötenazi. Gecikme olmadan istenen yağ dokusu depoları (Örneğin, kasık beyaz yağ dokusu veya perigonadal beyaz yağ dokusu)18incelemek.
- Diseksiyon makasla doku parçaları yaklaşık 0,5-1 cm boyutunda bir 100 x 15 mm2 Petri kabına oyulmuş ve onları %1 ile dolu microcentrifuge tüpler bırakın PFA. Buz üstünde tutun.
2. bütün monte beyaz yağ dokusunun boyama
- Diseksiyon tamamlandıktan sonra doku örnekleri % 1'hareket sıcaklık (RT) 1 h için oda ve 12 veya 24 iyi hücre kültür plaka daha hızlı yıkama için belgili tanımlık doku aktarmak için İngiltere'de yılın buz.
- PBS kurcalayarak yıkama-5 dk her bir shaker üzerinde RT 20 – 25 Eğer min hızı olarak başı ile 22 ° eğik için 3 kez 0.3T.
Not: Bu Full tilt ve hız bir shaker kullanımını içeren tüm izleyen adımları için kullanın.
Not: Eğer bir çok renkli muhabir fare çizgi gibi mT/mG ve ek kullanarak antikor boyama gerekli değildir, doku-den sonra adım 2.2 Mikroskopi için hazırdır. - 0.5-1 ekleyin mL engelleme arabellek (%5 hayvan serum PBS içinde seyreltilmiş-0.3T). Shaker üzerinde plaka koymak ve RT. 1 h için kuluçkaya
- Engelleme çözüm Aspire edin ve birincil antikorlar PBS içinde seyreltilmiş eklemek-% 1 hayvan serum ile 0.3T.
- Yer plaka üzerinde bir shaker 4 ° C'de bir gecede.
- Ertesi gün, PBS kurcalayarak yıkama-0.3T 3 kez için 5 dakika her RT.
- PBS içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar kullanın-0.3T. Eklemek 0.5-1 mL ikincil antikor çözümler her şey için. Alüminyum folyo plaka sarın ve RT. 1 saat bir shaker üzerinde kuluçkaya
Not: photobleaching önlemek için karanlıkta ikincil antikor sulandırmak. - İkincil antikor kuluçka sonra PBS ile yıkama-0.3T 5 dk, her dik için iki kez resim örnekleri tarafsız lipid leke değil isterseniz. Görselleştirme lipid damlacıkları ise tarafsız lipid kullanarak leke, 1 x PBS (olmadan iyonik olmayan yüzey aktif) ile iki kez, 5 min her yıkayın.
- Çamaşır adımları sonra 1:1500 seyreltme faktörü 1 x PBS için 30 dk içinde RT. ile seyreltilmiş tarafsız lipid leke ile kuluçkaya Dokular Mikroskopi için hazırsınız. Gelecekte görüntüleme için belgili tanımlık doku 4 ° c Bu çözümde saklanabilir
Not: kalite Imaging zaman içinde azalır; Bu nedenle, en iyi görüntüleme için 1 veya 2 gün içinde zamanı. - Forseps kullanarak, doku düz bir 24 x 60 mm ² cam coverslip yatıyordu ve bir ters confocal lazer mikroskop sistemde yerleştirin.
- Çekirdeği ile DAPI, boyama isterseniz, DAPI tamamen doku daldırın ve kurumasını önlemek için içeren montaj orta 1-2 damla ekleyin.
- Bütün Dağı dokuları birden çok odak düzlem, lekeli görüntüler elde etmek için Z-100-150 mikron yığınları ile 4-6 mikron adım-büyüklük istenen büyütmede derinlemesine gerçekleştirin.
3. doku takas ve Immunolabeling kullanarak iDISCO +
Not: Bu protokolü daha önce yayımlanmış yordamlar9,10,19tarihinde dayanır.
- Fiksasyon ve metanol ön arıtma
- %4 1 x PBS gecede 2 mL microcentrifuge tüpler içinde 4 ° C'de PFA seyreltilmiş dokularda kuluçkaya.
Not: belgili tanımlık doku 2 mL tüpler aşağıdaki tedaviler için görüntüleme kadar bırakın. - Ertesi gün, 1 x PBS dokularda için 1 saat her bir shaker RT., üç kez, yıkama
Not: Bu adımı örneği RT veya 4 ° c'gecede bırakmak duraklatma bir noktası olabilir - % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol, RT, dokularda daha sonra 1 h her kurutmak. RT, % 100 metanol içinde 1 saattir kurutmak sonra dokular için taze % 100 metanol aktarmak ve 4 c 1 h için kuluçkaya.
Not: metanol distile su oranında seyreltin. Metanol kuluçka sırasında doku örnekleri daldırılır sürece bir shaker örnekleri koymak gerek yoktur.
Dikkat: metanol zehirli olduğu gibi bu adım, zararlıdır. Açık alevler çok kolay alevlenebilir. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu. Metanol ateşleme mesafede ve yanıcı bir emanet dolabında saklayın. - %5 hidrojen peroksit (H2O2; %5 100 metanol cilt olarak seyreltilmiş % 30 H2O2 1 hacmi) kurcalayarak gecede 4 ° C'de çamaşır suyu
Dikkat: %30 hidrojen peroksit cilt ve göz teması çok tehlikeli. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu. - %80, % 60, % 40 ve % 20 metanol ve 1 x PBS, RT, dokularda daha sonra her biri 1 saat için suyla temasa.
- 1 x PBS içinde iki kez, 1 h her bir shaker RT. adlı için seyreltilmiş % 0,2 Nonyonik yüzey aktif yıkayın
- %4 1 x PBS gecede 2 mL microcentrifuge tüpler içinde 4 ° C'de PFA seyreltilmiş dokularda kuluçkaya.
- Immunolabeling
Not: takas tamamlanıncaya kadar immunolabeling başlar başlamaz doku oksidasyonu önlemek için her adımda kullanılan solüsyon ile doku tüpün üst içeren 2 mL tüpler doldurmak.- Dokuları onları 1 x PBS, % 0,2 Nonyonik yüzey aktif, % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ve 0,3 M glisin inkübe bir masa üstü orbital çalkalayıcı olarak 37 ° C'de bir çözümde iki gündür kuluçka tarafından permeabilize.
Not: 2 gün 37 ° C permeabilization adımın maksimum kuluçka zamanı geldi. - Bir çözüm 1 x PBS, % 0,2 Nonyonik yüzey aktif, % 10 DMSO, % 5 eşek serum ve % 1 Fc blok üzerinde bir inkübe masa üstü orbital çalkalayıcı 37 ° C'de ve dokularda 2 gündür engelleyin.
Not: Maksimum kuluçka engelleme adım 2 gün zamanı. - 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20, bir çözümde ilgi birincil antikorlar dokularda kuluçkaya 10 µg/mL heparin, %5 DMSO ve 4 gün boyunca inkübe masa üstü orbital çalkalayıcı olarak 37 ° C'de % 5 eşek serum.
- 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20 ve 10 µg/mL heparin vermeye bir shaker RT beş kez, her biri için 1 h, yıkayın.
Not: Bu adım bir duraklama noktası örnekleri gece RT. içinde bırakın olabilir - 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20, bir çözümde ikincil antikor kurcalayarak kuluçkaya 10 µg/mL heparin ve 4 gün için bir masa üstü orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de % 5 eşek serum.
Not: 3.2.5 adımından tüm örnekleri ikincil antikor photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış olması gerekiyor. - Bir çözüm 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20 ve 10 µg/mL heparin vermeye bir shaker RT dokularda 2 h her beş kere yıkayın.
Not: Bu adımı örnekleri gece RT. bırakın için duraklatma bir noktası olabilir
- Dokuları onları 1 x PBS, % 0,2 Nonyonik yüzey aktif, % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ve 0,3 M glisin inkübe bir masa üstü orbital çalkalayıcı olarak 37 ° C'de bir çözümde iki gündür kuluçka tarafından permeabilize.
- Doku takas beyaz yağ dokusu ve birim görüntüleme
- % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol, daha sonra her 1 saatte RT. için kuluçka tarafından 2 mL tüpler içinde bulunan doku kurutmak O zaman, % 100 metanol RT. adlı iki kez örneklerinde kurutmak
Not: Bu adım'da % 100 metanol RT. adlı gecede örneklerinizi ayrılmasına izin duraklatma bir noktası olabilir - DCM 2 Cilt 1 metanol RT bir shaker tarih itibariyle 3 h için hacmiyle karışımı kurcalayarak kuluçkaya.
Not: DCM kırılgandır. Tüpler buharlaşma önlemek için sıkı kapalı emin olun.
Dikkat: Bu tehlikeli adımdır. DCM inhalasyon zehirlidir. Uzun süre maruz potansiyel olarak kimyasal yanıklara neden. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, Ayakkabı, koruyucu gözlük) giymek. Bir duman başlığı kullan. - % 100 DCM ve dokularda iki kez 15 dakika her bir shaker RT., üzerinde kuluçkaya.
- % 100 kuluçkaya DBE RT kadar görüntüleme ve örnek depolama için. Görüntüleme önce tüpler çözümleri karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin.
Not: Tüpler DBE temizlenmesi başarısız dokusunda neden olabilir oksidasyonu önlemek için ile eksiksiz doldurunuz. Tüpler DBE kuluçka sırasında sallama.
Dikkat: Bu tehlikeli adımdır. DBE zehirlidir. Gözleri ve cildi tahrişe neden olabilir. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu. - Bütün doku örneği organik çözücü DBE kırılma indisini eşleşen ışık mikroskopla görüntü. Z-istifleme istediğiniz büyütme ve adım-boyu bütün doku için gerçekleştirin.
- % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol, daha sonra her 1 saatte RT. için kuluçka tarafından 2 mL tüpler içinde bulunan doku kurutmak O zaman, % 100 metanol RT. adlı iki kez örneklerinde kurutmak
4. bütün-mount gelen veri analizi örnekleri ImageJ kullanarak doku görüntüleri lekeli
Not: https://imageJ.nih.gov/ij/download.html indirme ve yükleme yönergeleri için bkz.
- Miktar damar yoğunluğu (ek Şekil 2)
- Sadece kanal ile damar immunostaining ImageJ üzerine kaydedilmiş görüntüleri içe.
Not: Miktar görüntülerde boyama prosedürü ve görüntü alma durumu açısından tutarlı olması gerekir. Aynı reaktifler kullanılmalıdır. Pozlama süresi, şiddeti ve büyütme da görüntüleme işlemi20dakikaya eşdeğer olmalıdır. - Resmin rengini siyah-beyaz kan damarı yoğunluğu miktar için dönüştürün. "Görüntü" sekmesi altında bunun için "Ayarlama" komutu, sonra "renk eşiği" seçeneğini seçin. İçinde "eşik renk" kutusunu görüntülemek, "Koyu arka plan"20 ve "Siyah-beyaz" altında "eşik renk"seçebilirsiniz.
- Kan damarı sinyal alanı yüzdesini arka planı ölçmek için "Çözümlemek" etiket, o zaman "parçacıklar analiz" komutunu seçin. Parçacıkların "analiz"görüntüle'nin altında "net sonuçlar" ve "Özetleme" seçeneklerini seçin. "Tamam"düğmesini tıklatın.
- Kopyalayabilir ve Özet sekmesinin altındaki yüzde alan değerini analiz için bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. Damar yoğunluğu alanı yüzdesini belirtir. Adımları 4.3.1–4.3.4 bireysel her görüntü için tekrarlayın.
- Sadece kanal ile damar immunostaining ImageJ üzerine kaydedilmiş görüntüleri içe.
- Miktar adipocyte boyutu21 (ek Şekil 3)
- Adiposit ImageJ üzerine kaydedilmiş görüntüleri içe.
- Görüntü ölçeğini ayarlamak için normal amortisman seçim aracıyla görüntüde bilinen uzaktan ölçeğiyle hattına izini sürerek ölçeğin piksel cinsinden uzunluğunu ölçmek. "Analiz" sekmesinde, "Ölçeği Ayarla" komutunu seçin. Daha önce takip ettiler satırı mesafesi otomatik olarak piksel cinsinden hesaplanır.
- "Ölçeği Ayarla" ekran kutu-ecek gözükmek. Bilinen uzaklık ve uzunluk birimi girin. Ölçeğin tüm içe aktarılan görüntüler için ayarlama uygulamak ve tıkırtı "OK"için "Global" seçin.
- "Analiz" sekmesi altında ölçüm yöntemi olarak alan seçmek için "ayarla ölçümleri" komutunu seçin. Ölçümler için farklı seçenekler listesi görüntülenir. "Alan" seçeneğini seçin ve "Tamam"ı tıklatın.
- Serbest seçim aracını kullanarak, her adipocyte ilgi çevre izleme. "Analiz" sekmesi altında "Ölçü (Ctrl + M)" komutunu seçin ve adipocyte alanında görüntülenecek. Resimdeki diğer adiposit için bu yordamı yineleyin.
Not: doğru ölçümler sağlamak için miktar için birden çok görüntüyü kullanın. - Kopyalayın ve alan ölçüleri daha fazla veri analiz için bir elektronik tabloya yapıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yağ dokusu kırılganlık nedeniyle, birden çok işlem adımları içeren ve kesit yöntemleri yağ dokusu morfoloji3 (resim 1A) şekil bozukluğu için yol açabilir. Ancak, Bütün Dağı boyama sonuçları (Şekil 1B) doğru yorumlanması sağlanması adipositler, morfoloji koruyabilirsiniz.
Aşırı yağ dokusu fiksasyonu sabitleştirici kaynaklı autofluorescence yol açar. Şekil 2Agösterildiği gibi yeşil ve kırmızı Kanalları Tirozin hidroksilaz (TH) ve PECAM-1 sinyalleri, boyama dokusunun o autofluorescence 3 gün boyunca İngiltere'de yılın aşırı fiksasyonu nedeniyle oluşmuş olabilir belirten aynı bölgelerde sırasıyla, üst üste. Buna ek olarak, Şekil 2B bütün-mount PECAM-1 sinyal göre farklı alanlarda TH boyama için sinyal gerçekleştiği sırada uygun fiksasyon gerçekleştirildiğinde, boyama, bu sinyal autofluorescence olmadığını gösteren temsili bir görüntüsünü gösterir ve Aslında olumlu sinyaldir.
Bütün Dağı boyama bir adiposit15, mT/mG ideal muhabir sistem18varlık ile Cre-loxP-esaslı soy izleme için önemli görselleştirme aracıdır. Ng2, adipocyte progenitör hücre nüfus için bir işaretleyici bir plazma zarı proteoglikan var. M-domates Ng2 Cre negatif hücreleri (Şekil 3) ifade edilir, ancak bu sistem, hızlı m-GFP, Ng2 Cre pozitif hücreleri.
Yağ doku genişletme ve daraltma farklı fizyolojik koşullar ve taleplerini20altında yeteneğine sahip son derece dinamik bir organdır. Bütün Dağı yağ dokusu lekeli Imaging miktar imorphological değişiklikleri çeşitli deneysel koşullarda sağlar. Özellikle, yağ dokusu yüksek, enerji seviyesi1hızlı değişiklikler üzerine metabolik homeostazı arabuluculuk önemli olan skarların. Örneğin, lipoliz, gösteren önemli ölçüde daha küçük adipocyte boyutu (Şekil 4), oruç 24 saat geçmesi C57BL/6J fareler görüntülemek ve fareler (Şekil 5) yükseltilmiş damar yoğunluğu sürekli olarak karşılaştırıldığında bir trend beslenir. ImageJ yazılım adiposit ve damar yoğunluğu, boyutunu ölçmek için yukarıda açıklandığı gibi kullanılmıştır.
Takas doku görselleştirme derin doku cilt9,10 içinde (Şekil 6) izin vermek için yağ dokusu solukluk kaldırmak için geliştirilmiş nispeten yeni bir tekniktir. Bütün-mount confocal mikroskobu (Şekil 7A) sinir lifleri doku yüzeyinin altında değil görüntülenmeyecektir bu yana sadece seyrek sempatik innervasyon, gösterdi kullanarak temizlenmemiş IWAT üzerinde boyama. Ancak, yoğun nöral arborization takas doku ve iDISCO + kullanımı yanı sıra ışık sayfalık Floresan Mikroskobu (LSFM) (Şekil 7B) kullanımı ile immunolabeling sonra görülmektedir.
Şekil 1: yağ dokusu morfoloji geleneksel morfolojik teknikleri ve bütün Dağı boyama tekniği ile karşılaştırılması. (A) H & E lekeli Yağ dokusundan (solda), siyah ok uçları adiposit bozuk bölgeleri gösteren bir parafin gömülü bölümünde. Lektin (karbonhidrat bağlayıcı protein, beyaz okları) Floresan enjeksiyon, immünfloresan F4/80 (makrofaj marker, sarı ok uçları) boyama ve cryosection (sağda) üzerinde yağ dokusunun çekirdeği DAPI boyama boya. (B) beyaz yağ dokusu görselleştirme bütün-mount bir adım-boyutu ile 5 mikron boyama kullanarak. Yakalanan toplam Z-yığın derinliği yaklaşık 100 mikron olduğunu. Adipocyte lipid damlacıkları tarafsız lipid leke (gri) ile lekeli ve kan damarları PECAM-1 ile lekeli. Görüntü yakalandı 5 mikron büyüklüğünde adım mikroskobu ile Z-istifleme için (kırmızı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sinir lifleri ve kan damarları bütün dağı kullanarak görselleştirme lekeli Yağ dokusundan. (A)temsilcisi mikroskobik görüntülerini bütün-dağ lekeli PWAT 3 gün boyunca İngiltere'de yılın aşırı fiksasyonu nedeniyle istenmeyen sonuçlar. Üst üste gelen sinyalleri tarafından beyaz ok uçları gösterilir. Bütün-mount gelen olumlu bir sonuç (B) temsilcisi mikroskobik görüntülerini kontrol fare IWAT lekeli. Görüntü 100 X büyütme oranında ele geçirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: MT/mG sistemiyle yağ dokusu soy izleme. Temsilcisi Cre-pozitif (mG) ve Ng2 Cre IWAT hücrelerde Cre-negatif (mT) görüntüler; mT/mG fare. Görüntüleri 200 X büyütme oranında ele geçirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: görselleştirme ve miktar adipocyte boyuttaki. (A)PWAT farelerin tarafsız lipid boyama kullanarak beslenen ve 24 saatlik oruç C57BL/6J adiposit temsilcisi görüntülerini. Görüntüleri 200 x büyütme oranında ele geçirildi. (B) Adipocyte boyutu ImageJ yazılımını kullanarak beslenen ve 24-h oruç C57BL/6J fareler arasında karşılaştırma. Değerleri ± SEM demek olarak ifade edilir; 2-kuyruklu unpaired bir öğrenci t-test; p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: görselleştirme ve miktar damar yoğunluğu. (A)farelerde PECAM-1 antikor kullanarak beslenen ve 24 saatlik oruç C57BL/6J kan damarlarının temsilcisi görüntüler. (B) karşılaştırma damar yoğunluğu arasında beslenen ve 24 saatlik ImageJ yazılımını kullanarak C57BL/6J fareler oruç tuttum. Değerleri ± SEM demek olarak ifade edilir; 2-kuyruklu unpaired bir öğrenci t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: iDISCO + yöntemiyle yağ dokusunun takas. Takas önce doku opaktır. Doku adımları Temizleme doku sonunda tamamen saydam olur.
Şekil 7: Bütün-dağ lekeli iDISCO + yöntemini kullanarak IWAT doku temizlenir kıyaslandığında IWAT. (A)görselleştirme sinir liflerinin bütün-dağ lekeli IWAT 5 mikron adım boyu ile confocal mikroskobu ile 100 x büyütme, TH antikor (1:500) kullanarak. Yakalanan toplam Z-yığın derinliği yaklaşık 100 mikron. olduğunu (B) görselleştirme bütün-bağla'TH antikor (1: 200) kullanarak sinir liflerinin lekeli IWAT iDISCO + iletişim kuralıyla 1.6 X büyütme LSFM kullanarak bir adım-boyutu ile 4 mikron. Yakalanan toplam Z-yığın derinliği yaklaşık 8 mm. olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: mT/mG soy izleme sistemi için Şematik diyagramı. EGFP membran hedefli ve tdTomato membran hedefli istihdam çift floresan sistemi. CRE rekombinasyon önce mT genel olarak ifade edilir. Hücre Cre ifade eder, mT kaset varlığına ve mG kalıcı olarak ifade edilir. pA kodonu sonra Poliadenilasyon sıraları temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2: damar yoğunluğu yüzde alanı ölçmek için ImageJ uygulama yazılım. (A) "Resim" sekmesini komutlar ve seçenekler bir siyah-beyaz eşik renk olarak görüntüyü dönüştürmek için. (B) yüzde alan gemi yoğunluğu "Parçacıklar analiz" komutunu kullanarak özet ölçümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek şekil 3: adipocyte alanı ölçmek için ImageJ uygulama yazılım. "Analiz" sekmesi: adipocyte(s) alanı ölçmek için "Ölçeği Ayarla" ve "Ölçü" komutları. Sonuçları görüntüleme ölçülen her adipocyte alanını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histoloji ve cryosection gibi geleneksel teknikleri hücre içi yapısı gözlemlemek için avantajlar, Bütün Dağı boyama cep 3D görselleştirme sağlar yağ dokusu araştırma farklı bir bakış açısı sağlar minimal işlenmiş doku mimarisi.
Bütün Dağı boyama başarıyla gerçekleştirmek için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. Farklı yağ dokusu depoları çeşitli immunostaining sonuçlar olabilir; Bu nedenle, kullanılan yağ dokusu depo türünü ilk tespit edilmelidir. Örneğin, kahverengi yağ dokusundan (BAT) beyaz Yağ dokusundan (WAT) daha küçük, multilocular adiposit21nedeniyle göre daha yoğun olduğunu. BAT bu artan yoğunluğu doku ile nüfuz antikorlar güçleştirir. Çok büyük/kalın doku da yeterli antikor penetrasyonu neden olabilir olduğundan Ayrıca, yağ doku boyutunu da uygun antikor boyama için şarttır. Bu en ince bölge ve yeterli antikor penetrasyon ve tutarlı veriler için izin verebilirsiniz beri dolayısıyla, yağ dokusu hayvan diseksiyon sırasında edinirken, perigonadal yağ dokusu distal kısmını, kullanılmalıdır. Alternatif olarak, bu yeterli antikor penetrasyon sayısında önler beri daha yoğun doku için işaretçiyi ilgi, daha iyi görselleştirme için mT/mG gibi bir floresan muhabir fare çizgi kullanılmasına izin. Daha sonra %1 PFA proteinlerin doğal dağıtım korumak ve doku permeabilization ve antikor penetrasyon22,23sağlamak için doku fiksasyon için kullanılır. Ancak, aşırı fiksasyon antijen tanıma azaltın ve autofluorescence24üretmek. Floresan bileşikleri24oluşturan tepki nedeniyle PFA aldehit gruplarını ve diğer aldehid içeren sabitleştirici ve doku parçaları, arasında bu. Bir antijen-alma adım ihtiyacını önlemek için sadece bir saat oda sıcaklığında bir sabitleştirici doku terk etmek ve fiksasyon tamamlanan7olduğunda sonraki adımlara başlamadan önerilir. Birçok immunolabeling teknik gibi antikor konsantrasyon titrating istenen sinyal sağlamak için önemli bir sorun giderme adımı olduğunu.
Gerçekten de, Bütün-Mount ve söz konusu önem artışına karşın boyama bazı sınırlamaları vardır. Yeterli antikor penetrasyon ve düzensiz boyama kas ve karaciğer gibi kalın dokularda ortaya çıkabileceğinden bütün Dağı boyama doku türü ve boyutu ile ilgili sıkı gereksinimleri vardır. Onun sinyal kez Yağ dokusundan (Şekil 7) içeriğinde yoğun lipid tarafından maskeli gibi Ayrıca, Bütün Dağı boyama belirli antikor tirozin hidroksilaz (TH), sempatik sinir sistemi için bir işaretleyici gibi en doğru bir şekilde temsil değildir. Ayrıca, yağ dokusu pürüzlü yüzeyi Yağ dokusundan farklı katmanları bulunan sinyalleri kolayca tek bir görüntüyü yakalanamayan bu yana confocal, görüntüleme için bir sorun oluşturuyordu. Bu nedenle, miktar sinyal yoğunluk bütün sinir lifi arborization için bütün Dağı boyama verim tutarsız sonuçlar elde edilen görüntüler. Distal PWAT genellikle az lipid-yoğun bir bölümüdür; Bu nedenle, daha iyi görüntü bu alandan elde edilebilir. Ancak, bu bölge temsilcisi immunostaining antikorlar türleri için tüm doku olup daha fazla araştırma gereken.
Doku optik saydam yaparak, bir takas yöntemi ışık saçılma, görselleştirme derin yapı25etkinleştirme azaltır. iDISCO + ucuz bir protokol son zamanlarda birleştiren bütün immunolabeling çeşitli büyük temizlenen doku9birim görüntüleme ile montaj olduğunu geliştirilen olduğunu. Değiştirilmiş iDISCO + son çalışmalar9,10 tarafından gösterdi LSFM yöntemleriyle geleneksel immunolabeling ve confocal mikroskobu ile görülemez WAT üzerinde yoğun dendritik arborization görülmektedir. Geleneksel confocal görüntüleme bir görüntüleme kiriş sistemi ve iğne deliği lazer taramak için kullanır. Tarama hızı ve derinlik derinlemesine mikroskop sınırlamaları vardır; Böylece, 3D doku dynamics kez özledim. Buna ek olarak, Bu sayfa tarama kullanır ve yalnızca bir optik bölüm bu bölümünde tüm floresans molekülleri yakalama teker teker aydınlatan ışık sayfalık mikroskobu belirgin avantajları vardır. Ayrıca, diğer bölümlerde fluorophores, fotoğraf ağartma ve Fototoksik etkileri26önlenmesi için heyecanlı mısın değil. Böylece, yağ dokusu içinde sinir innervasyon miktarı daha doğru bir şekilde iDISCO + ve LSFM ile tespit edilebilir. Buna rağmen iDISCO + ve LSFM kullanımı için bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, kullanıcıların sadece çünkü daha uzun dalga boylarında ışık daha iyi kanalları kırmızı ve far-red kanal iDISCO + ile uyumlu olan bu örnek27nüfuz dikkat etmelisiniz. Ayrıca, autofluorescence mavi-yeşil spektrumunda büyük doku örnekleri, oldukça yüksek bu yüzden kırmızı ve far-red spectra görüntülemede14oluşur herhangi bir autofluorescence azaltmaya yardımcı olacak. Transgenik floresan muhabir fareler açısından iDISCO + muhabir proteinler görselleştirmek için kullanılabilir. Endojen sinyal işlem14takas doku sırasında fade gibi ancak, ikincil bir antikor ile floresan muhabiri immunolabeling yapılmalıdır. Yine de, bu teknik son derece sempatik sinir sistemi-yağ doku etkileşimleri çalışmak için ve farklı fizyolojik ve metabolik koşullar altında yağ plastisite soruşturma için değerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, Pilot ve fizibilite çalışması Grant Banting & H-K. SickKids başlangıç Fonu'na en iyi diyabet Merkezi (BBDC) tarafından finanse edildi S., tıbbi araştırma merkezi programı (2015R1A5A2009124) aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama için J-yazar tarafından finanse edilen NMG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
