Summary
我们描述了一种方法来评估现有的免疫对登革热病毒感染的影响, 使用人血清, 原代人类细胞, 和感染定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量的定量。
Abstract
最近出现的黄病毒寨卡和神经并发症, 如桂林-巴雷综合征和婴儿小脑, 带来了严重的公共安全问题。在危险因素中, 抗体依赖性增强 (ade) 构成了最严重的威胁, 因为最近寨卡病毒 (zikv) 的重新出现主要发生在人群接触过的地区, 处于对其他密切相关的人群的免疫前状态病毒, 尤其是登革热病毒 (denv)。在这里, 我们描述了一个程序, 量化人类血清抗体对初级人类细胞或细胞系的 zikv 感染的影响。
Introduction
在蚊子传播的病毒性疾病中, 寨卡感染是临床上最重要的疾病之一。感染是由黄病毒 zikv 引起的, 在大多数情况下, 黄病毒使用埃及伊蚊作为其主要载体1,2。然而, 有研究报告白纹伊蚊是一些 zikv疫情3的主要媒介。虽然感染在许多情况下是无症状的, 但最常见的症状是发烧、头痛和肌肉疼痛2。没有治疗或疫苗可用于 zikv 感染, 现有的治疗方法大多是支持性的。最近在南美洲爆发的 zikv 导致了严重的病例, 并使被称为 "小脑2" 的胎儿的神经发育障碍增加了大约20倍。由于南美洲是 denv 和西尼罗河病毒等几种弓形虫病毒的特有地区, 因此调查先前对其他黄病毒的免疫力是否在 zikv 感染和疾病的严重程度中起着重要作用至关重要。
随着年龄的增长, 病毒已经进化出不同的策略, 以增加其感染的机会, 以接管宿主细胞机械, 并抑制抗病毒反应。其中最引人入胜的是利用宿主免疫前抗体的病毒, 以提高其复制与现象 ade 4.在 denv 的所有四个血清型中, ade 都得到了很好的研究和证明, 以增加病毒滴度和疾病结果5, 6,7.在先前的体外研究中, 我们已经证明了 zikv 复制的显著增强, 由于已有的 denv 免疫在原代人类免疫细胞8。我们还演示了一种相关的体外方法来量化 denv 先前存在的抗体增强初级细胞 zikv 复制的能力。
我们开发的协议使用在 tcid-50 或斑块还原中和试验 (prnt) 检测中和测试的人类血清样本, 以及在生物相关的细胞或从 zikv 可以感染的组织中提取的细胞中使用 zikv。
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Protocol
本研究中使用的血清样本来自哥伦比亚一个群体的人类参与者。项目收集工作得到了潘普洛纳大学 (南美洲哥伦比亚) 和洛斯波蒂奥斯医院8号内部审查委员会的批准。这些样本是匿名提供的, 调查人员无法获得病人信息。对血清样本进行了 denv 血清型检测。这些样本进一步证实在体外中和中和 denv 感染。为了进行控制, 使用了来自美国健康人 (hc) 的血清样本。
请注意:该协议可用于检测在任何表达 fcγ受体的人体细胞类型中的 zikv 复制的 ade。该协议由三部分组成 (图 1)。
1. 细胞播种和感染设置
请注意:在这项特殊研究中, 使用了人类原代巨噬细胞或 u937 骨髓细胞细胞系 (atcc-crl-1593.2)。细胞在 rpmi 培养基中保持在有5% 二氧化碳 (co2) 的37°c 孵化器中, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs).所有这些步骤都是在无菌条件下的生物安全2级生物安全柜中采取的。
- 种子 3 x 10 4 细胞每个井在一个无菌的平底96孔板连同100μl 的培养基, 并将它们放置在37°c 孵化器与 5% co 2.
- 播种细胞后, 在室温下解冻血清样本, 并通过将样品混合在无血清介质中进行10倍的连续稀释 (即, 半、半、1/10、1/10)。将稀释液稀释成一个无菌的96孔板。使用没有血清的病毒作为额外的控制。
- 在水浴中在37°c 下解冻 zikv 库存 1-2分钟, 并迅速将其转移到冰上供将来使用。
- 在血清等价物中加入0.1 多样性的感染 (moi), 使其具有相当于 mr766 株的感染。
请注意:确保稀释因子保持不变, 总体积约为 200μl;这足以满足每种治疗方法的分类。保持三口井不受感染, 作为下游分析的负控制。 - 在使用 5% co2 的37°c 孵化器中用添加的病毒孵育血清稀释剂 1小时, 以便 denv 抗体与寨卡病毒形成复合物 (以下简称 "免疫复合物").
- 从平底96孔板中播种的细胞中吸收培养基。用无菌的1x 磷酸盐缓冲盐水 (1x pbs) 清洗细胞。
- 将50μl 的免疫复合物加入每口井, 并在具有 5% co2 的37°c 孵化器中孵育 2小时。
- 孵育2小时后, 用多通道移液器从细胞中吸入含有免疫复合物的培养基, 并用 1x pbs 清洗细胞 2x, 完全去除免疫复合物和任何未附着的病毒。
- 加入100μl 的新鲜完整培养基, 再加上10% 的 fbs, 在每口井中孵育37°c 孵化器中的细胞, 用5% 的 co2 孵育48小时。
2. rna 提取
- 从孵化器中取出96孔板, 并将其转移到生物安全柜。
- 吸收培养基, 用 1x pbs 清洗细胞 2倍, 然后进行 rna 提取。
请注意:rna 可以通过任何选择的方法提取 (请参阅材料表)。 - 加入250μl 细胞裂解缓冲液, 每口10% 的β-硫醇。将缓冲器上下至少 5倍, 同时用移液器尖端划伤细胞, 以加快裂解过程。
- 将细胞裂解物转移到新的、有标签的、无菌的 1.5 ml 管。
- 加入同等数量的70% 乙醇 (250μl)。上下移液器 4倍-5倍, 直到混合物明确。
- 将混合物 (~ 500μl) 转移到2毫升集料管中标记的硅基柱和 15, 000 x克的离心机中, 以 15, 000 x 克为 30s. 将水流丢弃, 并将该柱保持在同一收集管中。
- 在每根柱子上加入700微米的洗涤缓冲液 1, 在 15, 000 x克的离心机上添加 30μl. 丢弃流经的流, 并将这些洗涤缓冲液保持在同一收集管中。
- 在每根柱上加入500μl 的洗涤缓冲液 2, 在 15, 000 x克的离心机上添加 30s. 丢弃上清液。重复此步骤2x。
- 将色谱柱转移到新的2毫升收集管和离心机, 以 15, 000 x克的速度, 待 2分钟. 确保硅基柱完全干燥, 洗涤缓冲液2不再留下乙醇。
- 丢弃2毫升管, 并将色谱柱放入新的无菌、标记的 1.5 ml 回收管中。
- 在每根柱的中心加入预热 (42°c) 30μl 的无 rnase 水, 并在 15, 000 x g 处加入离心机, 每次1分钟。
- 恢复洗脱的 rna, 并量化样品, 使用分光光度计在260纳米波长。
请注意:理想情况下, 通过计算260纳米和280纳米的吸收值之间的比率来确定 rna 的纯度。纯化 rna 的26/280 比理想的是 1.8-2.0 之间。
3. 定量实时聚合酶链反应
请注意:定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 可以通过使用任何 sybr 绿色混合, 通常由 sybr 绿色 i 染料, taq dna 聚合酶, 脱氧核苷酸三磷酸盐 (dntp), 和无源染料。任何能够检测 sybr 绿色的 qpcr 机器都可以用来进行反应和获取数据。在这个实验中, 使用了一步 rt-pcr 试剂盒, 它具有 sybr 绿色 i、rox 染料、taq dna 聚合酶、dntp 和逆转录酶的额外混合物 (参见材料表)的混合物.针对包络区域设计并在本研究中用于量化 zikv 基因组水平的引物是用于 zikv-qf 的 ccgctgccccacacacacaag 和用于 ZIKV-qF 的 ccactacttttgccat。作为对照, 测定了人β-2-微球蛋白 (b2m), 并将其用于使 zikv (家政基因) 的表达正常化。本研究中使用的 b2m 基因表达的引物序列是用于 b2m-qf 的 ctcctgtgtgttttgtgggggg 和用于 b2m-qr 的 ttaggggggggggcct。确保为每个样本的 zikv 和 b2m 基因放置三个技术副本。下面简要介绍了 rt-pcr 的设置。
-
rt-pcr 设置
- 每个样本使用100纳克。
- 为每个反应从特定基因的正向和反向引物的10μm 库存中加入1μl。
- 在每个样品中加入0.25μl 的逆转录酶混合物。
- 对于每个单独的反应, 加入12.2μl 的 sybr 绿色混合物。
- 最多添加25μl 的水。除 rna 外, 所有上述试剂的主混合, 在96孔 pcr 板中加入, 最后加入 rna。
- 用透明胶带密封板。
- 以 1, 000 x克的速度离心板, 以1分钟的速度混合试剂。
- 将板材放入 qpcr 机器中。
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rt-pcr 配置文件
请注意:使用表 1所示的 rt-pcr 配置文件。- 在50°c 下培养样品 10分钟, 以确保互补 dna (cdna) 的合成。
- cdna 合成后, 在95°c 下激活 taq dna 聚合酶5分钟。
- 在95°c 下进行40次变性, 在60°c 下进行40次退火和延长30秒。
- 最后将附加熔体曲线步骤 (65°C) 放在最后。
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数据分析
- 通过单击用于运行 qpcr 机器的程序中的熔体曲线选项卡来监视熔体曲线, 理想情况下, 该选项卡在特定基因的所有样本中显示一个峰值, 以确认只有一个放大器, 如果为 algori, 则放大值超过1。6thm 认为2为100% 放大值 (放大值根据 qpcr 机器使用的算法而变化)。确保在熔体曲线协议中使用0.5°c 的步骤和10秒的最小保持时间之间的温度增量, 以获得最佳结果。
- 在确保有一个放大器和良好的放大值之后, 首先单击量化数据选项卡以获取每个示例的定量周期 (ct/cq 值), 然后导出到 microsoft excel。
- 使用电子表格, 使用 ct 值计算每个样本的平均值。接下来, 在公式中单击并选择平均值。每个样本 (复制) 的平均 ct 值用于进一步分析。
- 接下来, 使用公式计算 ct 使用的公式 ct = 目标基因的平均 ct-控制基因的平均 ct (在这种情况下, ct = zikv 基因的平均 ct-b2m 基因的平均 ct)。
- 计算 ct 对数据进行规范化 (在这种情况下,
- 通过为每一个 ct 归一化值键入公式 2 ^-(ct) 来计算折数增加基因表达。进行统计测试的折叠增加的结果可以得到, 如早期研究9、10 所述。
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Representative Results
在图 1中, 有一个逐步的图表, 说明了执行 ade 协议所涉及的所有步骤。这是一个示意图, 显示了整个过程的 zikv 由于预先存在的对 denv 的免疫力。图 2显示了人类血清样本如何分为三组: denv 感染确认样本被称为 denv 感染组, denv 抗体确认样本被称为 denv 暴露组, 健康没有 denv 中和抗体或 rna 的个体血清称为健康控制 (hc) 组。(图 2)。
所有血清样本均可与 zikv 复合物制成, 然后用于感染巨噬细胞。感染48小时后, rna 被提取并接受 qrt-pcr。图 3中的代表性实验表明, 大多数含有 denv 血清型1至4抗体的血清能够在不同级别增强 zikv 复制。与血清型1和3相比, 含有 denv 血清型2和4抗体的巨噬细胞中, zikv 滴度的增加最大, 后者对 zikv 的诱导相对较少。
图 1: ade 协议的图表说明.分步示例显示了整个协议中涉及的所有步骤。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 实验程序示意图.用寨卡病毒孵化了三种类型的血清。第一组由 denv-rna 阳性 (denv 感染) 样本组成。第二组由 denv 抗体阳性 (denv 暴露) 样本组成。第三组由没有 denv rna 或抗体 (健康对照) 的样本组成。将病毒血清混合物添加到人类巨噬细胞中, 并对感染进行量化。这一数字已从 londo-renteria 等人的 "8" 中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: denv 免疫血清增强了人类初级巨噬细胞的 zikv 感染.人体血清中含有 denv 抗体 (denv1-4 是血清型证实, col 是血清型未知) 或从健康对照稀释1:10 至 1:10000, 并用 zikv 孵育。sera 在表 1中进行了描述。主要被隔绝的人巨噬细胞被传染了或者单独与 zikv 或与 zikv-sera 混合物。(a) denv1 含有抗体的血清。(b) 含有 denv2 抗体的血清。(c) 含有 denv3 抗体的血清。(d) 含有抗体的 denv4 血清。(e) 哥伦比亚个人1的 denv 抗体血清。(f) 哥伦比亚个人2的 denv 抗体血清。在感染后48小时进行 qrt-pcr 分析, 对感染进行了测量。技术和生物复制是一式三份。数据被池化, 误差线表示标准偏差。采用学生t检验和方差分析进行统计分析。* p < 0.001。这一数字已从 londo-renteria 等人的 "8" 中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1: qrt-pcr 的热剖面。
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Discussion
denv 抗体的交叉反应导致其他 denv 血清型的 ade 阻碍了有效疫苗的开发11。zikv 属于同一家族, flaviviridae, 与其他黄病毒, 特别是 denv12有相当多的同源性。zikv 和 denv 中和抗体的主要目标是包络蛋白, 它在这两种病毒13、14、15之间共享一个非常高的结构和四元序列同源。已经证明, 前免疫要么 denv 或 zikv 可以增强感染的其他病毒 8,16。
在 ade 实验中, 有许多不同的方法可以量化病毒的传染性, 从斑块检测17、使用与荧光染料结合的抗体进行细胞内病毒抗原染色和流式细胞术18 ,19。这些检测既耗时又不容易适应多个样品的高吞吐量。重要的是, 大多数研究使用 denv 特异性单克隆抗体来检查其对 zikv 的影响, 并只检查了细胞系中的 ade 20,21。在这个协议中, 我们描述了一个简单而有效的方法, 我们使用人类免疫前血清样本, 具有中和能力对 denv, 以及初级人类免疫细胞, 检查病人血清对 zikv 复制的影响, 使用qrt-pcr。该方法具有鲁棒性、相关性, 可在三天内完成。尽管本手稿的代表性显示了它在 zikv 中的应用, 但该协议可以很容易地修改并用于其他黄病毒, 如黄热病病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒。需要考虑的一个重要因素是, 该协议在区分成熟和不成熟病毒 rna 方面存在局限性。
在协议过程中, 在执行 rna 提取时, 必须仔细考虑, 确保在所有 rna 处理步骤中的环境不含 rnis。此外, 病毒库存应在37°c 的水浴中解冻 1-2分钟, 并立即放在冰上。然而, 这种病毒不应该长期保存在冰上, 那么, 它就会失去其传染性。
以往的研究结果表明, 该协议非常方便, 适应处理大量的样本, 可以在相对较少的时间内完成。该协议有可能被用作未来 ade 研究的有用分析。
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Disclosures
提交人没有什么可申报的。
Acknowledgments
这项工作得到了 1R21AI129881-01 (对 t. m. c.)、国家新兴传染病实验室和波士顿大学医学院启动资金的慷慨支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | Model No. CFX96 Optics Module |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit | Qiagen | 204154 | Used for 1 step RT-qPCR |
| RNeasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74106 | Used for RNA extraction |
| RPMI-medium | Gibco | 11875093 |
References
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