इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आणविक जीव विज्ञान, जैव रसायन, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई, और प्राथमिक इन विट्रो का उपयोग करता है (जैसे, क्लोनोजेनिक) जैसे बहाव अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से epidermal keratincytes को अलग करने के लिए है केराटिनोसाइट्स)।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क मादा चूहों से प्राथमिक केराटिनसाइट्स कटाई की एक विश्वसनीय विधि है (54 – 2 दिन पुराने) लगभग 30 x 106 माउस प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं उपज. प्राथमिक वयस्क माउस keratincytes मादा चूहों के पृष्ठीय त्वचा से काटा जाता है. पुरुष चूहों ($6 सप्ताह पुराने) प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर keratincyte कटाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Euthanized चूहों मुंडा और povidone आयोडीन और इथेनॉल समाधान (70% शराब) में सीरियल washes के साथ बाँझ कर रहे हैं. चूहों को कीटाणुरहित करने के बाद, पृष्ठीय त्वचा को हटा दिया जाता है और चमड़े के नीचे की वसा और मांसपेशियों को स्कैल्पल के साथ हटा दिया जाता है और खारिज कर दिया जाता है। खाल छोटे टुकड़ों में काट रहे हैं और एक हल्के, कम तापमान trypsinization के साथ इलाज के लिए epidermis से कम dermis अलग. खुरचनी epidermises कम गति पर हलचल कर रहे हैं, बालों को दूर करने के लिए फ़िल्टर, गिना, और संस्कृति के माध्यम में फिर से निलंबित. इस विधि कई downstream अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक कृषि योग्य कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट एकल सेल निलंबन प्रदान करता है.
Mammalian त्वचा पूरे शरीर को शामिल किया गया है और कार्यों की एक भीड़ में कार्य करता है (उदा. एक प्राथमिक शारीरिक बाधा, तापमान विनियमन, और नमी प्रतिधारण). पिछले पांच दशकों में, माउस त्वचा पर बुनियादी अनुसंधान संरचना और त्वचा के समारोह पर नई जानकारी मिली है. माउस त्वचा मॉडल बहुत रासायनिक या पराबैंगनी विकिरण प्रेरित carcinogenesis के जटिल आणविक तंत्र के पीछे बुनियादी जीव विज्ञान की समझ में मदद मिली है. इन माउस त्वचा मॉडल मानव त्वचा रोगों और उनके शमन की समझ की दिशा में एक महत्वपूर्ण योगदान प्रदान की. बाल कूप विकासात्मक जीव विज्ञान, स्टेम सेल अनुसंधान, कार्सिनोजेनेसिस, और बाह्य त्वचा की आनुवंशिक अन्वेषण में प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के आगे आणविक विच्छेदन का पता लगाने के लिए, यह अक्सर अलग करने के लिए वांछनीय है और संस्कृति प्राथमिक उपकला चूहों त्वचा से keratinocytes विवो प्रयोगों में के साथ समानांतर में उपयोग करने के लिए. इस विधि को विकसित करने में प्रेरक कारक क्लोनोजेनिक एपिडरमल और बाल कूप स्टेम कोशिकाओं1,2के लिए इन विट्रो परख की आवश्यकता थी . क्लोनेजेनिक परख3, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई, और प्रवाह साइटोमेट्री3,4के लिए उपयुक्त एपिडर्मल कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन की भी तत्काल आवश्यकता थी. इस विधि के लाभ एक मजबूत फसल अन्य तरीकों से अधिक परिमाण के एक आदेश में वृद्धि कर रहे हैं5,6, बाल follicles के उपकला भाग के शामिल किए जाने, और काटा कोशिकाओं के उच्च culturability. 1980 के दशक में, वहाँ कोई ज्ञात तरीके है कि इन आवश्यकताओं को पूरा कर सकता था. बाद के वर्षों में, इस विधि को सेल उपज बढ़ाने के लिए परिष्कृत किया गया था। इस विधि की मुख्य सीमा कुछ ट्रिप्सिन संवेदनशील एंटीबॉडी का मास्किंग होगी जो इम्यूनोरेसक्रियता6से समझौता करेगी .
चूहों विशिष्ट रोगजन नि: शुल्क दिशा निर्देशों के अनुसार पशुपालन प्राप्त किया. एक से पांच मादा चूहों 54 – 2 दिन की उम्र प्राप्त की गई. पुराने चूहों में, बाल चक्र के एनेजेन चरण (वृद्धि) के कारण केराटिनसाइट्स की व्यवहार्यता कम हो जाएगी। इसके अलावा, trypsinization की प्रक्रिया युवा चूहों की तुलना में अधिक कठिन है. कटाई प्रक्रिया सफलतापूर्वक पुरुष की तुलना में मादा चूहों की पतली त्वचा के लिए अनुकूलित किया गया है. पुरुष चूहों आम तौर पर keratincyte फसल के लिए उपयोग नहीं कर रहे हैं के रूप में वे आवास के दौरान एक दूसरे के साथ लड़ने की प्रवृत्ति है और इसलिए खरोंच या त्वचा पर घाव छोड़ सकते हैं.
यहाँ वर्णित केराटिनसाइट कटाई विधि वयस्क मादा चूहों के पीछे से अत्यधिक कृषि योग्य प्राथमिक एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स की उच्च पैदावार का उत्पादन करने के लिए विकसित किया गया था। ये केरातिनोसाइट्स प्रवाह साइटोमेट्री, आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोग, और प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें क्लोनोजेनिक परख भी शामिल है। यह केराटिनसाइट हार्वेस्टिंग विधि त्वचीय रासायनिक कैंसरजनन और ट्यूमर संवर्धन1,13के डाउनस्ट्रीम पहलुओं का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी रही है .
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, कठोरता और प्रजननीयता के लिए, 54 साल की उम्र की मादा चूहों – 2 दिन का इस्तेमाल किया गया. इससे हमें चूहों के अनेक प्रकारों से संवेदनशील और मात्रात्मक उपनिवेश परख प्राप्त करने और संपर्क विश्लेषण में उन्हें एक फीनोटाइप के रूप में प्रयोग करने में सहायता मिली है जिससे कम से कम एक नए स्टेम सेल विनियामक जीन की पहचान10,11. दूसरा, यह छोटे टुकड़ों में खाल में कटौती करने के लिए उपयोगी है, के रूप में trypsinization त्वचा पूरे रखने की कोशिश कर रहा से अधिक प्रभावी है. तीसरा, समय और trypsin फ्लोटेशन के तापमान के बाद संस्कृति के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, एक करने के लिए की जरूरत है “बहुत” संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ने के लिए फिल्टर पर शेष बाल पर. यह चरण कोशिकाओं की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इनक्यूबेटर का 32 डिग्री सेल्सियस तापमान वयस्क चूहों से केराटिनोसाइट्स की लंबी अवधि की खेती के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, इस प्रोटोकॉल में, इन विट्रो और विवोप्रयोगों 1 के समानांतर readouts प्राथमिक संस्कृतियों के बजाय subcultures या सेल लाइनों पर आधारित हैं. विशेष रूप से, यदि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहली बार प्राथमिक केराटिनोसाइट्स की कटाई करें, तो हिस्टोपैथोलॉजिकल अवलोकन द्वारा बाह्य त्वचा के साथ बालों के रोम के पूर्ण हटाने की पुष्टि करने के लिए स्क्रैप करने के बाद शेष डर्मिस रखें।
वयस्क माउस keratincytes कटाई के लिए इस प्रोटोकॉल की मुख्य ताकत यह है कि यह कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं कि कृषि योग्य कोशिकाओं की उच्च पैदावार पैदा करता है. मुख्य सीमा यह है कि कुछ सेल सतह epitopes trypsinization के प्रति संवेदनशील हो सकता है कि प्रतिरक्षा समझौता किया जा सकता है. इसलिए, जब एक नई सेल सतह एंटीबॉडी का परीक्षण, यह तुलना के लिए कटाई के लिए एक dispase6 या thermolysin5 आधारित विधि का उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल का महत्व यह है कि इसे कड़ाई से परीक्षण किया गया है, मात्रा निर्धारित की गई है, और क्लोनोजेनिक स्टेम कोशिकाओं के लिए परख के रूप में इस तरह के विविध अनुप्रयोगों के लिए लागू किया गयाहै 1,9,10,11, बड़े पैमाने पर संस्कृतियों के लिए जैव रसायन8में , स्टेम सेल विश्लेषण 3 में FACS छँटाई के लिए3,4, आणविक जीव विज्ञान के लिए3,12,और चल रहे आरएनए और डीएनए अनुक्रमण के लिए .
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की कोई रसीद नहीं है।
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |