Summary
이 프로토콜의 목표는 분자 생물학, 생화학, 형광 활성화 세포 선별 및 1 차 체외 용도 (예를 들어, 클로노겐성)와 같은 다양한 다운스트림 응용 을 위해 성인 마우스의 등쪽 피부로부터 표피 각질 세포를 분리하는 것입니다. 각질 세포).
Abstract
여기서 설명된 프로토콜은 성인 암컷 마우스(54±2일)로부터 1차 각질을 수확하는 신뢰할 수 있는 방법이며 마우스당 약 30 x 106개의 생존 가능한 세포를 산출한다. 1차 성인 마우스 각질세포는 암컷 마우스의 등지 피부로부터 수확된다. 수컷 마우스(~6주령)는 실험의 요건에 따라 각질세포 수확에 사용될 수 있다. 안락사 된 마우스는 포비동 요오드 및 에탄올 솔루션 (70 % 알코올)에서 직렬 세안으로 면도및 멸균됩니다. 마우스를 소독 한 후 등지 피부를 제거하고 피하 지방과 근육을 메스로 제거하고 폐기합니다. 피부는 작은 조각으로 잘라 보고 표피에서 더 낮은 진피를 분리 하는 온화 한, 낮은 온도 트립 시니화로 처리. 긁힌 표피는 낮은 속도로 교반되고, 여과되어 털을 제거하고, 계수하고, 배양 배지에서 다시 부유한다. 이 방법은 많은 다운스트림 응용 분야에서 매우 배분 가능한 셀의 우수한 단일 셀 현탁액을 제공합니다.
Introduction
포유류 피부는 몸 전체를 덮고 다양한 기능(예: 1차 물리적 장벽, 온도 조절 및 수분 유지)을 제공합니다. 지난 5년 동안 마우스 피부에 대한 기본 연구는 피부의 구조와 기능에 대한 새로운 정보를 산출했습니다. 마우스 피부 모형은 화학방사선 유도한 발암의 복잡한 분자 기계장치 의 뒤에 기본적인 생물학의 이해를 크게 도왔습니다. 이 마우스 피부 모형은 인간적인 피부 질병 및 그들의 완화의 이해로 중요한 기여를 제공했습니다. 모낭 발달 생물학, 줄기 세포 연구, 발암 및 표피의 유전 적 탐구에서 1 차 적인 각질 세포의 추가 분자 해부를 탐구하기 위해, 자주 분리하고 배양 기본 상피 생체 내 실험과 병행하여 사용하는 마우스 피부의 각질 세포. 이 방법을 개발하는 동기 부여 요인은 클로노제닉 표피 및 모낭 줄기 세포에 대한 시험관내 분석의 필요성이었다1,2. 또한 clonogenic 분석3, 형광 활성화 세포 선별 및 유세포측정3,4에적합한 표피 세포의 단세포 현탁액에 대한 긴급한 필요성이 있었다. 이 방법의 장점은 견고한 수확이 다른 방법5,6,모낭의 상피 부분의 포함, 수확 된 세포의 높은 배분성에 비해 크기의 순서를 증가시키는 것이다. 1980년대에는 이러한 요구 사항을 충족할 수 있는 알려진 방법이 없었습니다. 이후 몇 년 동안, 이 방법은 세포 수율을 증가시키기 위해 정제되었다. 이 방법의 주요 한계는 면역 반응성을 손상시킬 몇몇 트립신 과민한 항체의 마스킹일 것입니다6.
마우스는 특정 병원균 무료 지침에 따라 축산을 받았다. 1~5마리의 암컷 마우스를 54±2일 생후로 수득하였다. 오래된 마우스에서는, 각질 세포의 생존은 머리 주기의 anagen 단계 (성장)때문에 감소될 것입니다. 또한, 트립시니화 과정은 젊은 쥐에 비해 더 어렵다. 수확 절차는 성공적으로 남성에 비해 여성 마우스의 얇은 피부를 위해 최적화되었습니다. 수컷 마우스는 일반적으로 하우징 도중 서로 싸우는 경향이 있고 그러므로 피부에 상처 또는 상처를 남길 수 있기 때문에 각질 세포 수확을 위해 이용되지 않습니다.
Protocol
모든 척추동물 사용 프로토콜은 권장 NIH 및 정부 지침에 따라 미네소타 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 피더 층 초기화 및 서브배합
- 액체 질소 탱크로부터 동결된 스위스 마우스 3T3을 함유하는 1개의 세포 바이알을 37°C 수조에 1-2분 동안 1-2분 동안 넣어 서 해동한다. 바이알에 있는 세포의 수는 대략 1 x 106입니다.
- 얼음의 최종 조각이 녹으면 3T3 세포 바이알을 제거합니다. 70 % 알코올 면봉으로 튜브를 닦으십시오. 그런 다음 바이알을 생체 안전 성 캐비닛으로 옮니다.
- 세포를 T-150 플라스크로 천천히 옮기고, CGM 배지 1 mL로 3T3 바이알을 헹구는다. 미리 데운 3T3 완전 성장 배지(CGM)의 30 mL를 천천히 세포에 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 3T3 섬유아세포세포를 고르게 펴는다. 플라스크에 세포주 세부 사항, 날짜 및 통로 번호를 적절하게 레이블을 지정합니다.
- 5% CO2 및 95% 습도로 37°C에서 세포를 배양합니다.
참고: ATCC에 따르면, 스위스 마우스 3T3의 두 배 시간은 18 시간; 때 결합 (접촉 억제), 밀도는 cm2당 약 40,000 세포이다. 초기화 후 10-15개 대항 내에서 특정 3T3 선을 사용합니다. 더 빠른 성장 또는 스핀들 모양세포의 존재는 더 높은 대점에서 발생할 수 있으며 일반적으로 3T3가 성인 마우스 각질세포에 대한 피더 세포뿐만 아니라 수행되지 않을 것이라는 신호이다. 급속한 성장이 발생하는 경우, 더 낮은 통로 세포에서 새로운 라인을 시작하는 것이 좋습니다. - 24시간 후에 미디어를 변경하여 죽은 세포와 잔류 DMSO(냉동 보존제)를 제거하고, 그 후 매주 2회. 세포가 약 80% 합류증을 내고 배양 개시를 위해 T-150 플라스크를 사용하게 하십시오. 초기화 후 하위 배양에 T-225 플라스크를 사용합니다.
- 하위 배양 3T3 섬유아세포에, 세포 배양 인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고, 겐타마이신으로 차가운 멸균 PBS(1x)로 2회 세척한다. 파이펫 10 mL 의 사전 온난화 (37 °C 수조) 트립신 용액 (0.25%) 각 T-225 플라스크에 넣습니다.
- 플라스크를 3-8분 동안 온난화 플레이트에 놓습니다. 플라스크를 제거하고 손바닥을 사용하여 플라스크의 벽을 눌러 세포를 분리하고 반전된 현미경 으로 세포 분리를 확인합니다. 트립신 용액은 분리된 3T3 셀로 흐린 것처럼 보일 수 있다.
- 트립신 용액을 3-4x로 피펫하여 플라스크의 세포 성장 표면을 세척하고 트립시니화 세포를 50 mL 원추형 튜브에서 CGM의 30 mL로 옮김을 전달한다. 50 mL 원추형 튜브에서 CGM-트립신 셀 혼합물의 10 mL로 플라스크 3-5x를 재세척합니다.
참고: 2개의 플라스크 내용물의 내용물 50 mL 튜브에 첨가될 수 있다; 하나의 플라스크만 사용하는 경우, 트립신/세포 10 mL을 50 mL 튜브에 CGM 20 mL에 넣습니다. - 4°C에서 7분 동안 160 x g에서 50 mL 원원튜브를 원심분리한다.
- 이제 상류를 흡인하고 CGM 의 5 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 부드럽게 ~ 10x를 피펫팅하여 세포 펠릿을 완전히 방해합니다. CGM 의 10 mL을 추가하여 50 mL 원엽 튜브의 총 부피를 15 mL로 가져옵니다.
- 다시 ~ 10x를 혼합하고 3 개의 별도의 T-150 플라스크에 셀 현탁액의 5 mL을 놓습니다. 서브컬쳐 비율은 T-225 플라스크에서 1:3, T-150 플라스크에서 1:4입니다. 각 플라스크에 미리 데운 3T3 CGM 30mL를 추가합니다.
- 플라스크에 세포주 이름, 셀 시드 날짜 및 통로 번호로 레이블을 지정합니다.
- 하위 배양 단계에서 원심분리 후 3T3 세포를 동결하려면 원심분리기에서 50 mL 튜브를 제거하고 얼음 양동이에 놓습니다. 상월체를 흡인하고 수확된 각 플라스크에 대해 5% DMSO-DMEM 혼합물의 1 mL로 세포 펠릿을 재중단시켰다(표 1참조).
- DMSO-DMEM 혼합물 1 mL을 각 저온(수확한 3T3 플라스크 당 1개)에 세포 현탁액과 함께 놓습니다. 바이알에 통로 번호, 세포주 이름(3T3) 및 셀이 동결된 날짜를 표시합니다.
- 이 3T3 셀 바이알을 셀 냉동고 용기에 넣고 -70 °C 냉동고로 옮기고 >5 h. 조심스럽게 제거하고 다음 사용까지 장기간 보관할 수 있도록 액체 질소 저장 탱크에 놓습니다. . 세포주 이름, 탱크의 위치 및 실험실 액체 질소 인벤토리 시트에 날짜에 대한 정보를 입력합니다.
2. X 선 조사 및 시딩을위한 3T3 피더 층 준비
- 3T3 세포를 조사 하기 1 주일 전에 준비 하 고 성장 할 수 있도록 ~100% 합류. 3T3 세포는 전형적으로 120 에서 130의 대구 내에 있습니다.
-
1 차 각질 세포의 성공적인 클로노제닉 검문을 위해 3T3 세포를 파종하기 전에 60mm 페트리 접시를 콜라겐으로 코팅하십시오.
- 콜라겐 코팅 용액의 약 2-3 mL를 60 mm 페트리 접시에 피펫하여 바닥면을 코팅하고 여분의 콜라겐 코팅 액을 제거합니다(표 1참조). 페트리 접시를 최소 1시간 동안 5% CO2로 37°C 인큐베이터로 옮김. 인큐베이터에서 접시를 말리지 마십시오.
- X선 조사 단계: 1.4-1.6 단계를 따릅니다. 50 mL의 신선한 CGM을 사용하여 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 원엽 튜브를 닫고 파라핀 밀봉 필름으로 밀봉하십시오. 오염을 방지하려면 비닐 봉지를 사용하여 튜브가 들어있는 파라핀 밀봉 셀을 이중으로 봉지에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 미토마이신 계대체 피더 층은 각질세포 배양7에사용될 수 있다.
-
생물학적 엑스레이 기계로 5,000 rads (50 Cgy) 용량으로 50 mL 원엽 관에서 섬유 아세포 3T3 세포를 조사합니다. CGM 매체와 함께 이 세포를 조사하십시오.
- X 선 조사 후, 4 °C에서 7 분 동안 160 x g에서 원심 분리지 세포. 상층 매체를 흡인하고 5 mL의 CGM으로 셀 펠릿을 부드럽게 재중단하여 부드럽게 ~ 10x. 이제 최종 볼륨을 30mL로 가져오고 중간 크기 25mL와 10배의 트라이튜레이트(triturate)를 추가로 사용하십시오. 이러한 삼중 단계는 투과성 분석에 대한 균일한 3T3 섬유아세포 층에 매우 중요합니다.
- 실행 가능한 세포 계산: 일반 유리 혈세포계를 사용하여 각질 세포를 계산합니다. 세포의 약 0.5 mL을 가지고 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 세포 혼합물 200 μL을 제거하고 0.4% 트립판 블루 용액과 혼합물 3-4x의 동일한 부피를 추가합니다. 혈세포계로 세포를 옮기고 모든 핵세포(작은 금및 분홍색 세포)를 실행 가능한 세포로 계산한다. 생존 가능한 금 세포의 최종 농도를 계산합니다.
- 피펫 1 x 106 3T3 세포(최소 7 x 105)세포를 60 mm 콜라겐 코팅 페트리 접시(단계 2.2)로 넣고 수정된 고칼슘 윌리엄스 E 매체 4 mL를 부드럽게 첨가한다(표 1참조). 갓 시드한 3T3 세포를 24시간 동안 부착할 수 있습니다. 다음 날, 신선한 1 차 각질 세포체를 수확하고 아래와 같이 clonogenic 분석에 대한 부착 된 3T3 섬유 아세포 층 위에 씨앗.
3. 1 차 각질 세포 수확 및 파종
- 승인된 동물 시설/IACUC 기준에 따라 CO2 흡입을 통해 4~5마리의 성인 암컷 마우스를 안락사시. 그러나, 이 프로토콜은 또한 단일 여성/남성 마우스를 위해 사용될 수 있다.
- 전기 동물 클리퍼로 등쪽 털의 약 9cm 2를 클립하고 모든 잘린 마우스를 500 mL 항아리에 넣고 충분한 포비드 요오드 살균 용액 (스크럽이 아님)을 1-2 분 동안 덮을 수 있습니다. 마우스위에 솔루션을 제공합니다.
- 용액을 붓고 액체가 깨끗해질 때까지 깨끗한 물로 헹구어 줍니다. 동일한 방부제를 반복하고 물로 헹구고 나면 세탁하십시오. 요오드 용액으로 방부제를 씻은 후 모든 마우스를 70 % 에탄올에 5-10 분 동안 담가 둡니다.
참고: 가벼운 모피 (예를 들어, BALB/c)를 가진 마우스는 살균 요오드 세안물로부터 약간의 황색을 유지하지만 어두운 마우스 (예 : C57BL /6)는 그렇지 않습니다. 특히, 세포 생존 력 또는 배양 성장은 황색으로 인해 영향을 받지 않습니다.
- 라미나 흐름 후드에 엄지 집게와 가위를 사용하여 잘린 등도 피부를 조심스럽게 제거합니다. 절제된 등쪽 피부를 PBS/2x 젠타마이신으로 채워진 원엽 튜브에 놓습니다. 배양시 유방 세포 오염을 방지하기 위해 복부 측 피부를 사용하지 마십시오.
- 오토클레이브 포셉과 메스를 사용하여 한 번에 한 쪽 등쪽 피부를 얇은 페트리 접시에 내려 놓습니다. 그것은 반투명 될 때까지 피부 조직의 복부 측에서 지방을 포함한 모든 피하 조직을 긁어 시작합니다. 피부를 찢지 않고 피하 조직의 최대 흔적을 제거하려고합니다 (모낭 부분). 또한 장시간 긁지 말고 피부 건조를 피하십시오.
- 나머지 모든 스킨이 처리될 때까지 PBS 용액에 긁힌 피부를 보관하십시오. 메스를 사용하여 껍질을 0.5 cm x 1-1.5 cm 스트립으로 자르고 털이 많은 면을 멸균 페트리 접시위에 올려 놓습니다.
- 트립신과 혼합된 PBS/2x 겐타미신 용액 20mL 의 정성피펫(0.25%) 100mm x 20mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 집게를 사용하여, 피부를 옮기고 32°C 인큐베이터에서 2시간 동안 트립신 용액의 표면에 털이 많은 면을 띄우십시오.
참고: 트립시니화 시간과 온도는 매우 배분가능한 1차 각질세포의 양호한 수율에 매우 중요합니다. 다른 방법은 생존 세포의 좋은 수율을 제공 할 수 있지만, 각질 세포의 배분성은 덜 만족하고있다.- 이 2 시간 배양 시간 동안, 콜라겐 코팅으로 접시를 코팅하고 1 시간 동안 37 °C에 놓습니다 (단계 3.1.2 참조). clonogenic 검술의 경우, 60 mm 페트리 접시는 이미 조사 된 3T3 피더 층이 바닥에 부착하고 균등하게 확산 할 수 있도록 각질 자수 수확 전에 24 시간 코팅되었습니다.
참고: clonogenic 문화를 위한 문화 접시의 코팅은 마우스 표피 각질 세포의 적당한 부착, 식민지 형성 및 궁극적인 성장/증식을 위해 아주 중요합니다.
- 이 2 시간 배양 시간 동안, 콜라겐 코팅으로 접시를 코팅하고 1 시간 동안 37 °C에 놓습니다 (단계 3.1.2 참조). clonogenic 검술의 경우, 60 mm 페트리 접시는 이미 조사 된 3T3 피더 층이 바닥에 부착하고 균등하게 확산 할 수 있도록 각질 자수 수확 전에 24 시간 코팅되었습니다.
- 표피 스크레이핑 단계: 멸균 플라스틱 사각형 페트리 접시를 배열하고 수확 매체의 15 mL로 적절한 표피 스크레이핑을 위해 30° 경사로 표면을 만듭니다(표 1 참조). 곡면 집게가 있는 트립신 용액에서 부동 피부 스트립을 조심스럽게 제거합니다. 새로운 메스 블레이드로 표피와 머리카락을 배지로 긁어 냅니다.
- 과도한 힘을 사용하지 말고 표피를 긁어 충분한 힘을 사용하거나 세포 생존에 영향을 미칩니다.
- 표피를 긁는 동안 블레이드를 피부 조각에 수직으로 유지하십시오. 블레이드가 블레이드의 움직임을 향해 기울어져 있으면 피부가 찢어지는 가능성이 더 큽입니다. 블레이드가 블레이드 움직임에서 멀리 기울어지면 표피 제거가 불충분할 가능성이 더 큽입니다.
- 1.5 인치 자기 교반 막대로 멸균 60mL 항아리 (오토 클레이브 및 재사용 가능)에 긁힌 표피 세포를 포함하는 수확 매체를 조심스럽게 부어. 페트리 접시를 추가 수확 매체로 헹구어 남은 표피 세포를 수집하고 최종 부피를 30 mL로 가져옵니다. 마그네틱 교반기와 실온에서 20분 동안 100rpm에서 저어줍니다. 이 과정은 머리카락에서 갇힌 표피 세포를 제거합니다.
- 멸균 70 μm 세포 스트레이너를 50 mL 원엽 튜브 의 상단에 놓습니다. 셀 스트레이너는 50 mL 원엽 튜브 위에 맞습니다.
- 바이오 세이프티 후드 안에 항아리를 가져가십시오. 교반 바를 제거하고 50 mL 원추형 튜브에 부착 된 스트레이너 필터에 내용물을 부어. 원치 않는 머리카락과 각질층 시트를 변형시.
- 스트레이너 내의 각질층 물질과 함께 머리카락을 누르고 트랩 된 모발 세포를 풀어 놓기 위해 조작하십시오. 남은 갇힌 세포가 튜브로 방출되고 흐를 수 있도록 5 mL의 수확 매체를 사용하십시오. 원유관에 총 부피를 최대 50mL까지 가져옵니다.
- 50 mL 원엽 튜브를 세포 여과액과 원심 분리기를 160 x g에서 4 °C에서 7 분 동안 캡하십시오. 다음 상한을 흡인하고 수확 매체의 5 mL를 추가합니다. 5 mL 파이펫으로 ~ 20x를 부드럽게 삼각화하여 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
- 이 단계에서는 집계를 피하기 위해 셀을 아이스박스에 보관합니다. 수확 매체 25 mL를 추가하고 다시 삼중 (20-25x).
- 이 단계에서 정확한 각질 세포 수를 보장하려면 1 mL의 셀 서스펜션을 취하고 19 mL 수확 매체를 추가하십시오. 이제 세포 희석은 50 mL 원엽 관에서 1:20이다. 단일 마우스에서 각질 세포를 수확하는 경우 셀 서스펜션의 부피를 조정합니다. 30 mL 대신, 15 mL를 사용하고 세포를 세기 위해 1 :10 희석을하십시오.
- 50 mL 원엽 튜브 (1:20 희석)로부터 희석 된 세포의 파이펫 0.5 mL및 1.5 mL 오토 클레이브 미세 원심 분리 튜브로 옮김. 다른 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 셀 믹스0.2 mL (200 μL)을 제거하고 0.4 % 트립판 블루 용액의 동일한 부피 (200 μL)를 추가하십시오. 이 용액을 3배 부드럽게 혼합하고 세포를 혈전계로 옮겨 핵 각질 세포를 계수합니다.
- 실행 불가능한 죽은 세포로 Trypan 블루에 대한 긍정적 인 모든 어두운 파란색 세포를 점수, 실행 가능한 세포로 작은 금과 분홍빛이 도는 세포 점수. 마우스 당 최종 각질 세포 수율은 약 3천만 개의 생존 세포여야 합니다.
- 원심분리기 는 4 °C에서 160 x g에서 7 분 동안 원래 50 mL 원엽 튜브 (단계 3.8로부터). 이 단계에서 원하는 배지로 세포를 재중단하고 시딩 세포에 필요한 희석을 합니다.
- 대량 배양을 위해, 종자 2-4백만 개의 가능한 금 세포를 세포 배양 배지에서 각 35 mm 페트리 접시(KGM형 배지 + 단층 배양용 보충제)(표 1참조). clonogenic (콜로니 형성) 분석의 경우, X 선 조사 스위스 마우스 3T3 피더 층에 60 mm 페트리 접시 당 종자 1,000 세포 콜라겐 코팅 및 보충제 및 혈청으로 윌리엄의 E 배지를 수정.
- 총 2~4mL 배지를 사용하여 각각 35mm 및 60mm 페트리 접시를 사용하십시오. 또한, 5% CO2에서 사용하기 위해 중탄산나트륨의 감소 수준으로 ATCC에서 조달된 DMEM 및 윌리엄스 E 배지를 공식화합니다.
- 배양 세포(질량 또는 투향성)를 32°C, 95% 습도에서5% CO2로 성장시다. 대량 배양에 대한 초기 시드 후 하루 미디어를 변경한 다음 그 후 매주 3회 변경합니다. 그러나, 클로날 아시스의 경우, 첫 번째 배지 변화는 세포 시딩 후 2일, 그 후 매주 3배이다.
- 클론 배양을 위해, 2 주 간격으로 세포를 경작하십시오. 클론 배양 (2 또는 4 주)이 완료 된 후 배지를 흡인합니다. 식민지를 10% 버퍼링된 포르말린을 실온에서 하룻밤 동안 고정하고 오토클레이브 물에 0.5% 로다민 B를 1시간 동안 더럽히게 합니다. 그런 다음, 접시의 가장자리에서 피펫으로 로다민 B 얼룩을 제거합니다.
- 접시가 깨끗해질 때까지 차가운 오토클레이브 물로 접시를 헹구어 보시고 자라고 있습니다. 접시 뚜껑에 기울어진 접시를 놓고 마지막 식민지 계산을 위해 건조시키십시오. 특히, 투박 성 배양 분석을 수행 할 때, 결코 피펫 <1 세포의 mL. 세포가 집중되면 세포 농도를 연속적으로 희석시다.
Representative Results
전형적으로, 마우스당 표피 각질세포의 수율은 20 x 106 에서 30 x 10x 10 6 트리판 블루 를 제외한세포를8,9를수득한다. 생존 력은 80%-90%입니다. 일반적인 파종 효율은 조사된 3T3 피더 층에 대한 콜로니 형성이 24h에서 약 30% 부착되며, C57BL/6 마우스에 대해 시드된 1,000개의 생존 가능한 세포당 약 60개의 콜로니, 스위스형 마우스10개에 대한 1,000개의 세포당 약 30개의 콜로니 ,11. 콜로니 형성 성 검사에서 전형적인 결과는 그림1에 예시되어 있습니다. 모낭 줄기 세포의 수는 C57BL/6 마우스12에대한 약 9% CD34+/CD49f+ 줄기 세포이다. 유세포분석의 일반적인 결과는 그림 2에나와 있습니다.
도3에 도시된 4개의 상이한 매체의 성장 특성. 시험된 매체에는 KGM-gold, SFM, 윌리엄의 E 배지 및 모리스-2(윌리엄스 E를 기반으로 모리스 실험실에서 개발된 감소된 칼슘 배지)가 포함됩니다.
도 1: 성인 마우스로부터의 각질 각질 세포에 대한 분석에서 대표적인 예. 이 사진은 CD-1 암컷 마우스로부터 각질세포 콜로니 형성을 보여 준다 54 나이의 일 1) 치료없이 국소 처리, 2) 아세톤 은 2 주 동안 매주 두 번 아세톤에 의해 1 주일 후, 3) DMBA는 1 주일 후 두 번 매주 아세톤에 의해 다음 2 주 동안, 4) 아세톤은 2 주 동안 매주 두 번 TPA에 의해 1 주일 후, 5) DMBA는 2 주 동안 매주 두 번 TPA에 의해 1 주일 후에 뒤따랐다. 생체 내 치료 후, 각질 세포를 수확하고 조사 된 3T3의 피더 층에 접시 당 1,000 세포에서 씨를 뿌리고 2 주 동안 배양한 후 요리는 완충 된 포르말린으로 고정하고 로다민 B로 얼룩졌습니다. 각 열의 접시는 각 마우스 치료 그룹에서 복제됩니다. 더 큰 식민지의 수는 DMBA로 처리시 증가하고, 콜로니의 총 수는 각질 세포 수확 전에 마우스의 TPA 처리를 증가시켰습니다. 약어: DMBA: 7,12-디메틸벤드[a]안트라세네; TPA: 12-O-테트레이드카노일포르볼-13-아세테이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 성인 마우스로부터 모낭 줄기 세포의 유동 세포측정의 대표적인 예. 간략하게, 단리된 1차 각질세포는 등지 마우스 피부로부터 분리되었고 세포 필터를 사용하여 세포 파편을 여과하였다. 단리된 각질 세포염 현탁액은 살아있는 죽은 염료 및 그밖 통제와 더불어 CD49f 또는 α6-integrin (PE) 및 CD34 (FITC) 항체로 표지되었습니다. FITC 및 PE 이소타입 조절 항체(Rat IgG2akappa)는 보상 목적으로 사용하였다(재료 표참조). 줄기 세포는 기저 표피 및 모낭 세포에서 발견되는 헤미 데스모솜의 외부 성분을 인식한 CD49f(PE 채널)와 모낭 줄기 세포를 인식한 CD34(FITC 채널)를 통해 선택되었으며, 이는 모낭 줄기 세포(즉, CD34-FITC+)를 인식하였다. 및 a6-PE+ (오른쪽 상단 열, 총 5 %)). 우측 컬럼은 CD34-FITC 만, CD34-FITC 및 a6-PE 세포(이중 양성 줄기 세포 집단), a6-PE 전용, 및 얼룩지지 않은 세포와 같은 상이한 각질 세포 집단을 나타낸다. 참고로 CD34+ 줄기세포 집단은 6,14로보고되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 성인 암컷 마우스로부터의 표피 세포의 1차 배양에 대한 4개의 상이한 배지의 비교. 1차 각질세포는 등쪽 마우스 피부로부터 분리되었고 4개의 상이한 매체(KGM, SFM, Willem's-E 및 Morris-2)를 사용하여 시드를 위해 계산하였다. 각질 세포의 동등한 숫자는 시드하고 그들의 일반적인 형태와 성장 패턴을 따랐다. 증식각질은 약간 다른 형태를 가지고 있습니다. KGM, SFM 및 모리스-2 모두 칼슘 저온이 감소되어 14일 후 가장 견고한 성장을 이수한다. 대조적으로, 세포는 1.4 mM 칼슘및 나트륨칼륨의 높은 비율을 가지고 있는 윌리엄스 E 배지에서 배양될 때 지속되지 않습니다. 놀랍게도, 보충제와 20% 태아 소 혈청을 함유한 윌리엄스 E 배지는 다른 어떤 매체보다 훨씬 더 나은 각질세포 클론 배양물을 지원하며, 아마도 풍부한 윌리엄스 E 배지가 3T3 피더 세포가 더 잘 "공급"하는 데 도움이 되기 때문일 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 및 미디어 | 코멘트 |
| 수확 솔루션 | |
| 2.5% 트립신 (5 mL) | |
| 덜베코의 PBS (500 mL) | |
| 겐타마이신 (2 mL) | |
| 2x 젠타마이신 (45 mL)을 가진 PBS | |
| 2x 젠타마이신을 가진 인산염 완충식염수(PBS) | |
| 트립신 솔루션 | |
| 세포 배양 솔루션 | |
| 퓨어콜-피브로넥틴 접시 코팅 솔루션: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| 소 세럼 알부민 1.0 mg/mL (10 mL) | |
| 세포 배양 배지 (100 mL) | |
| 피브로넥틴 (1 mg) | |
| 퓨어콜 콜라겐 (1 mL) | |
| 세포 동결 용액 | |
| DMSO (2 mL) | |
| 10% BCS 및 펜 스트렙이 있는 DMEM | |
| 수확 매체 | 칼슘이 없어야 합니다. |
| 2x 젠타마이신(1mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| SMEM (500 mL) | |
| 높은 칼슘 윌리엄스 ' E 미디어와 함께: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| 글루타민 14.5 mL | |
| 하이드로 코르티손 (1 mg / mL) 0.5 mL | |
| 인슐린 1 mL | |
| 리노산드-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL | |
| MEM 에스 아미노산제 4 mL | |
| MEM 비타민 5 mL | |
| 페니실린-스트렙토마이신 5 mL | |
| 트랜스퍼린 (5mg / mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1,000 μL) 57.5 μL | |
| Vit E 1 mg/mL (4°C) 3.5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL | |
| 3T3 섬유아세포 완전 성장 배지(CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| 페니실린 연쇄상 구균 (10 mL) | |
| 한국GM | 대량 배양에 사용되는 배지는 감소된 칼슘 배지입니다. |
| 모리스 2 윌리엄스와 같은 보충제와 매체' E | 보충제를 가진 윌리엄스 E의 감소된 칼슘 변이체 |
표 1: 솔루션 및 미디어 레시피.
Discussion
여기에 기술된 각질 세포 수확 방법은 성인 암컷 마우스의 뒤쪽에서 매우 배분 가능한 1차 표피 각질세포의 높은 수율을 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 각질세포는 여기서 보고된 투박성 분석기를 포함하는 유세포분석, 분자생물학 적용, 및 1차 세포 배양에 적합하다. 이러한 각질세포 수확 방법은 또한 종양 화학발암 발생 및 종양 촉진의 다른 하류 양상을연구하는 데 유용하였다 1,13.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 엄격하고 재현성을 위해, 54±2일의 암컷 마우스를 사용하였다. 이것은 우리가 마우스의 다중 긴장에서 과민하고 양적 콜로니 분석을 능력을 발휘하고 적어도 1개의 새로운 줄기 세포 조절 유전자10,11의확인으로 이끌어 내는 연결 분석에 있는 표현형으로 사용하기 위하여 가능하게 했습니다. 둘째, 트립시니화는 피부를 전체적으로 유지하는 것보다 더 효과적이기 때문에 피부를 더 작은 조각으로 자르는 것이 도움이됩니다. 셋째, 트립신 부양의 시간 및 온도는 후속 의 과기성에 매우 중요하다. 또한, 하나는 부착 된 세포를 빼내기 위해 필터에 남아있는 머리카락에 "상당히 찌를"필요가 있습니다. 이 단계는 세포의 높은 수율을 얻기 위해 중요하다. 더욱이, 인큐베이터의 32°C 온도는 성인 마우스로부터 각질세포의 장기 배양에 중요하다. 마지막으로, 본 프로토콜에서, 생체외 및 생체내 실험 1의 병렬 판독은 하위 배양 또는 세포주보다는 1차 배양에 기초한다. 특히, 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 1 차 각질 세포염을 수확하는 경우, 조직 병리학 적 관찰에 의해 표피와 함께 모낭의 전체 제거를 확인하기 위해 긁어 후 나머지 진피를 유지.
성인 마우스 각질 세포를 수확하기위한이 프로토콜의 주요 강도는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 적합한 컬터링 세포의 높은 수율을 생성한다는 것입니다. 주요 한계는 몇몇 세포 표면 epitopes면역 염색이 손상될 수 있다 되도록 trypsinization에 과민할 수 있다는 것입니다. 따라서, 새로운 세포 표면 항체를 시험할 때, 비교를 위해 수확을 위한 디스파제6 또는 써모리신5 기반 방법을 사용하는 것이 신중할 수 있다. 이 프로토콜의 중요성은 대량 배양에 대한 1, 9,10,11,clonogenic 줄기세포에대한 분석실험과 같은 다양한 응용 분야에 엄격하게 테스트, 정량화 및 적용되었다는 것입니다. 생화학8에서, 줄기 세포 분석에서 FACS 분류3,4,분자 생물학3,12,진행 중인 RNA 및 DNA 염기서열 분석용.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 인정이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
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- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
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