이 프로토콜의 목표는 분자 생물학, 생화학, 형광 활성화 세포 선별 및 1 차 체외 용도 (예를 들어, 클로노겐성)와 같은 다양한 다운스트림 응용 을 위해 성인 마우스의 등쪽 피부로부터 표피 각질 세포를 분리하는 것입니다. 각질 세포).
여기서 설명된 프로토콜은 성인 암컷 마우스(54±2일)로부터 1차 각질을 수확하는 신뢰할 수 있는 방법이며 마우스당 약 30 x 106개의 생존 가능한 세포를 산출한다. 1차 성인 마우스 각질세포는 암컷 마우스의 등지 피부로부터 수확된다. 수컷 마우스(~6주령)는 실험의 요건에 따라 각질세포 수확에 사용될 수 있다. 안락사 된 마우스는 포비동 요오드 및 에탄올 솔루션 (70 % 알코올)에서 직렬 세안으로 면도및 멸균됩니다. 마우스를 소독 한 후 등지 피부를 제거하고 피하 지방과 근육을 메스로 제거하고 폐기합니다. 피부는 작은 조각으로 잘라 보고 표피에서 더 낮은 진피를 분리 하는 온화 한, 낮은 온도 트립 시니화로 처리. 긁힌 표피는 낮은 속도로 교반되고, 여과되어 털을 제거하고, 계수하고, 배양 배지에서 다시 부유한다. 이 방법은 많은 다운스트림 응용 분야에서 매우 배분 가능한 셀의 우수한 단일 셀 현탁액을 제공합니다.
포유류 피부는 몸 전체를 덮고 다양한 기능(예: 1차 물리적 장벽, 온도 조절 및 수분 유지)을 제공합니다. 지난 5년 동안 마우스 피부에 대한 기본 연구는 피부의 구조와 기능에 대한 새로운 정보를 산출했습니다. 마우스 피부 모형은 화학방사선 유도한 발암의 복잡한 분자 기계장치 의 뒤에 기본적인 생물학의 이해를 크게 도왔습니다. 이 마우스 피부 모형은 인간적인 피부 질병 및 그들의 완화의 이해로 중요한 기여를 제공했습니다. 모낭 발달 생물학, 줄기 세포 연구, 발암 및 표피의 유전 적 탐구에서 1 차 적인 각질 세포의 추가 분자 해부를 탐구하기 위해, 자주 분리하고 배양 기본 상피 생체 내 실험과 병행하여 사용하는 마우스 피부의 각질 세포. 이 방법을 개발하는 동기 부여 요인은 클로노제닉 표피 및 모낭 줄기 세포에 대한 시험관내 분석의 필요성이었다1,2. 또한 clonogenic 분석3, 형광 활성화 세포 선별 및 유세포측정3,4에적합한 표피 세포의 단세포 현탁액에 대한 긴급한 필요성이 있었다. 이 방법의 장점은 견고한 수확이 다른 방법5,6,모낭의 상피 부분의 포함, 수확 된 세포의 높은 배분성에 비해 크기의 순서를 증가시키는 것이다. 1980년대에는 이러한 요구 사항을 충족할 수 있는 알려진 방법이 없었습니다. 이후 몇 년 동안, 이 방법은 세포 수율을 증가시키기 위해 정제되었다. 이 방법의 주요 한계는 면역 반응성을 손상시킬 몇몇 트립신 과민한 항체의 마스킹일 것입니다6.
마우스는 특정 병원균 무료 지침에 따라 축산을 받았다. 1~5마리의 암컷 마우스를 54±2일 생후로 수득하였다. 오래된 마우스에서는, 각질 세포의 생존은 머리 주기의 anagen 단계 (성장)때문에 감소될 것입니다. 또한, 트립시니화 과정은 젊은 쥐에 비해 더 어렵다. 수확 절차는 성공적으로 남성에 비해 여성 마우스의 얇은 피부를 위해 최적화되었습니다. 수컷 마우스는 일반적으로 하우징 도중 서로 싸우는 경향이 있고 그러므로 피부에 상처 또는 상처를 남길 수 있기 때문에 각질 세포 수확을 위해 이용되지 않습니다.
여기에 기술된 각질 세포 수확 방법은 성인 암컷 마우스의 뒤쪽에서 매우 배분 가능한 1차 표피 각질세포의 높은 수율을 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 각질세포는 여기서 보고된 투박성 분석기를 포함하는 유세포분석, 분자생물학 적용, 및 1차 세포 배양에 적합하다. 이러한 각질세포 수확 방법은 또한 종양 화학발암 발생 및 종양 촉진의 다른 하류 양상을연구하는 데 유용하였다 1,13.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 엄격하고 재현성을 위해, 54±2일의 암컷 마우스를 사용하였다. 이것은 우리가 마우스의 다중 긴장에서 과민하고 양적 콜로니 분석을 능력을 발휘하고 적어도 1개의 새로운 줄기 세포 조절 유전자10,11의확인으로 이끌어 내는 연결 분석에 있는 표현형으로 사용하기 위하여 가능하게 했습니다. 둘째, 트립시니화는 피부를 전체적으로 유지하는 것보다 더 효과적이기 때문에 피부를 더 작은 조각으로 자르는 것이 도움이됩니다. 셋째, 트립신 부양의 시간 및 온도는 후속 의 과기성에 매우 중요하다. 또한, 하나는 부착 된 세포를 빼내기 위해 필터에 남아있는 머리카락에 “상당히 찌를”필요가 있습니다. 이 단계는 세포의 높은 수율을 얻기 위해 중요하다. 더욱이, 인큐베이터의 32°C 온도는 성인 마우스로부터 각질세포의 장기 배양에 중요하다. 마지막으로, 본 프로토콜에서, 생체외 및 생체내 실험 1의 병렬 판독은 하위 배양 또는 세포주보다는 1차 배양에 기초한다. 특히, 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 1 차 각질 세포염을 수확하는 경우, 조직 병리학 적 관찰에 의해 표피와 함께 모낭의 전체 제거를 확인하기 위해 긁어 후 나머지 진피를 유지.
성인 마우스 각질 세포를 수확하기위한이 프로토콜의 주요 강도는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 적합한 컬터링 세포의 높은 수율을 생성한다는 것입니다. 주요 한계는 몇몇 세포 표면 epitopes면역 염색이 손상될 수 있다 되도록 trypsinization에 과민할 수 있다는 것입니다. 따라서, 새로운 세포 표면 항체를 시험할 때, 비교를 위해 수확을 위한 디스파제6 또는 써모리신5 기반 방법을 사용하는 것이 신중할 수 있다. 이 프로토콜의 중요성은 대량 배양에 대한 1, 9,10,11,clonogenic 줄기세포에대한 분석실험과 같은 다양한 응용 분야에 엄격하게 테스트, 정량화 및 적용되었다는 것입니다. 생화학8에서, 줄기 세포 분석에서 FACS 분류3,4,분자 생물학3,12,진행 중인 RNA 및 DNA 염기서열 분석용.
The authors have nothing to disclose.
저자는 인정이 없습니다.
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |