Målet med denne protokollen er å isolere epidermal keratinocytter fra rygg huden til voksne mus for en rekke nedstrøms anvendelser som molekylærbiologi, biokjemi, fluorescens aktivert celle sortering og primær in vitro-bruk (f.eks. clonogenic keratinocytter).
Protokollen er beskrevet her er en pålitelig metode for høsting primære keratinocytter fra voksne kvinnelige mus (54 ± 2 dager gamle) gir ca 30 x 106 levedyktige celler per mus. Primær voksen mus keratinocytter er høstet fra rygg hud av kvinnelige mus. Mannlige mus (~ 6 uker gammel) kan brukes til Keratinocyte høsting avhengig av kravene i eksperimentet. Euthanized mus er barbert og sterilisert med seriell vasker i povidon jod og etanol løsninger (70% alkohol). Etter desinfisering av mus, er rygg hud fjernet og subkutan fett og muskler er fjernet med en skalpell og forkastet. Skinnene er skåret i små biter og behandlet med en mild, lav temperatur trypsinization å løsne de nedre dermis fra epidermis. De skrapte epidermises blir rørt ved lav hastighet, filtrert for å fjerne hårene, telles, og re-suspendert i kultur medium. Denne metoden gir en utmerket enkelt celle suspensjon av svært culturable celler for mange nedstrøms applikasjoner.
Pattedyr huden dekker hele kroppen og serverer en rekke funksjoner (f. eks, en primær fysisk barriere, temperaturregulering, og fuktighet oppbevaring). I løpet av de siste fem ti årene, grunnleggende forskning på musen huden har gitt ny informasjon om struktur og funksjon av huden. Musen huden modellen har i stor grad bidratt til forståelse av grunnleggende biologi bak de komplekse molekylære mekanismer av kjemisk eller ultrafiolett stråling-indusert kreft. Disse mus hud modeller gitt et betydelig bidrag til forståelse av menneskelige hudsykdommer og deres utslippsreduksjoner. For å utforske videre molekylær Disseksjon av den primære keratinocytter i hårsekken utviklingsmessige biologi, stilk cellen forskning, kreft, og genetisk utforskning av epidermis, er det ofte ønskelig å isolere og kultur primære epitel keratinocytter fra mus huden til bruk parallelt med in vivo eksperimenter. Den motiverende faktoren i utviklingen av denne metoden var behovet for en in vitro-analysen for clonogenic epidermal og hårsekken stamceller1,2. Det var også et presserende behov for enkelt celle suspensjoner av epidermal celler egnet for clonogenic analyser3, fluorescens aktivert celle sortering, og flyt flowcytometri3,4. Fordelene med denne metoden er en robust avling øke en størrelsesorden over andre metoder5,6, inkludering av epitel delen av hårsekkene, og den høye culturability av høstes celler. På 1980-tallet fantes det ingen kjente metoder som kunne oppfylle disse kravene. I de påfølgende årene, denne metoden ble raffinert for å øke celle yield. Den viktigste begrensningen av denne metoden ville være maskering av noen Trypsin følsomme antistoffer som ville kompromittere immunoreactivity6.
Musene fikk husdyrhold i henhold til spesifikke patogen gratis retningslinjer. En til fem kvinnelige mus 54 ± 2 dager av alder ble innhentet. I eldre mus, levedyktigheten av keratinocytter vil bli redusert på grunn av anagen fase (vekst) av hår syklusen. Dessuten er prosessen med trypsinization vanskeligere sammenlignet med unge mus. Den høsting prosedyren har blitt optimalisert for den tynnere huden av kvinnelige mus sammenlignet med mannlige. Mannlige mus er vanligvis ikke brukes til Keratinocyte avlinger som de har en tendens til å kjempe med hverandre under bolig og derfor kan etterlate riper eller sår på huden.
Den Keratinocyte høsting metoden beskrevet her ble utviklet for å produsere høy avkastning av høyt culturable primære epidermal keratinocytter fra baksiden av voksne kvinnelige mus. Disse keratinocytter er egnet for Flow flowcytometri, molekylærbiologi program, og primær cellekultur, inkludert clonogenic analysen rapportert her. Dette Keratinocyte høsting metoden har også vært nyttig for å studere andre nedstrøms aspekter av hud kjemiske kreft og tumor forfremmelse1,13.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. Først, for rigor og reproduserbarhet, kvinnelige mus av alder 54 ± 2 dager ble brukt. Dette har gjort det mulig for oss å utføre følsomme og kvantitative koloni analyser fra flere mus stammer og bruke dem som en fenotype i koblings analyse som fører til identifisering av minst én ny stilk cellen Regulatory gen10,11. For det andre er det nyttig å kutte skins i mindre biter, som trypsinization er mer effektivt enn å prøve å holde huden hel. For det tredje er tiden og temperaturen i Trypsin flyte svært viktig for den påfølgende culturability. Videre må man “rote betraktelig” på hårene som gjenstår på filteret for å løsne de vedlagte cellene. Dette trinnet er viktig å oppnå høy avkastning av celler. Videre er 32 ° c temperatur av inkubator viktig for lengre sikt dyrking av keratinocytter fra voksne mus. Til slutt, i denne protokollen, er parallell readouts av in vitro og in vivo eksperimenter1 basert på primære kulturer i stedet for subkulturer eller cellelinjer. Spesielt hvis høsting primære keratinocytter for første gang ved hjelp av denne protokollen, holde de resterende dermis etter skraping å bekrefte full fjerning av hårsekkene sammen med epidermis ved histopathological observasjon.
Den viktigste styrken i denne protokollen for høsting voksen mus keratinocytter er at den produserer høy avkastning av culturable celler som er egnet for mange nedstrøms applikasjoner. Det Chief begrensningen er det alt noe cellen overflate epitopes kanskje være følsom å trypsinization slik det immunostaining kanskje være kompromittert. Derfor, når du tester en ny celle overflate antistoff, kan det være klokt å bruke en dispase6 eller thermolysin5 basert metode for høsting for sammenligning. Betydningen av denne protokollen er at den har blitt grundig testet, kvantifisert, og brukes på slike ulike anvendelser som analyser for clonogenic stamceller1,9,10,11, for masse kulturer i biokjemi8, for FACS sortering i Stamcelle analyse3,4, for molekylærbiologi3,12, og for pågående RNA og DNA-sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen bekreftelser.
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |