Målet med detta protokoll är att isolera epidermal keratinocyter från den dorsala huden hos vuxna möss för en mängd olika nedströms tillämpningar såsom molekylärbiologi, biokemi, fluorescens aktiverad cell sortering, och primära in vitro-användning (t. ex., klonogena keratinocyter).
Det protokoll som beskrivs här är en tillförlitlig metod för skörd primära keratinocyter från vuxna honmöss (54 ± 2 dagar gamla) ger cirka 30 x 106 livskraftiga celler per mus. Primära vuxna mus keratinocyter skördas från dorsala huden av honmöss. Manliga möss (~ 6 veckor gamla) kan användas för keratinocyt skörd beroende på kraven i experimentet. Euthanized möss är rakade och steriliseras med seriella tvättar i povidon jod och etanol lösningar (70% alkohol). Efter desinfektion av möss, rygg huden avlägsnas och subkutant fett och muskler avlägsnas med en skalpell och kasseras. Skinnen skärs i små bitar och behandlas med en mild, låg temperatur trypsinization att lossa den nedre dermis från epidermis. Den skrapade epidermises rörs vid låg hastighet, filtreras för att ta bort hårstrån, räknas och återsuspenderas i odlingssubstrat. Denna metod ger en utmärkt enda cellsuspension av mycket odlingsbara celler för många nedströms applikationer.
Däggdjur huden täcker hela kroppen och serverar en mängd funktioner (t. ex. en primär fysisk barriär, temperaturreglering, och fukt retention). Under de senaste fem decennierna har grundforskning på mus hud gett ny information om hudens struktur och funktion. Musen hud modell har kraftigt bidragit till förståelsen av den grundläggande biologi bakom komplexa molekylära mekanismer för kemisk eller ultraviolett strålning-inducerad carcinogenes. Dessa mus hud modeller gav ett betydande bidrag till förståelsen av mänskliga hudsjukdomar och deras lindring. För att utforska ytterligare molekylär dissektion av den primära keratinocyter i hårsäcken utvecklingsbiologi, stamcellsforskning, carcinogenes, och genetisk utforskning av epidermis, det är ofta önskvärt att isolera och kultur primära epitelial keratinocyter från möss huden att använda parallellt med in vivo experiment. Den motiverande faktorn för att utveckla denna metod var behovet av en in vitro-analys för klonogena epidermal och hårfollikelstamceller1,2. Det fanns också ett brådskande behov av enstaka cellsuspensioner av epidermal celler som lämpar sig för klonogena analyser3, fluorescens aktiverad cell sortering, och flödescytometri3,4. Fördelarna med denna metod är en robust skörd öka en storleksordning över andra metoder5,6, införande av epiteliala delen av hårsäckarna, och den höga culturability av de skördade cellerna. På 1980-talet fanns det inga kända metoder som kunde uppfylla dessa krav. Under de följande åren har denna metod förfinats för att öka cell utbytet. Den huvudsakliga begränsningen av denna metod skulle vara maskering av vissa trypsin känsliga antikroppar som skulle äventyra immunoreaktivitet6.
Mössen fick djurhållning enligt de särskilda patogenfria riktlinjerna. En till fem honmöss 54 ± 2 dagars ålder erhölls. Hos äldre möss, lönsamheten av keratinocyter kommer att minskas på grund av anagen fas (tillväxt) av hår cykeln. Också, processen för trypsinization är svårare jämfört med unga möss. Skördeprocessen har framgångsrikt optimerats för den tunnare huden hos honmöss jämfört med manliga. Manliga möss är i allmänhet inte används för keratinocyter skördar eftersom de har en tendens att slåss med varandra under huset och därför kan lämna repor eller sår på huden.
Den keratinocyt skörd metod som beskrivs här utvecklades för att producera hög avkastning av mycket odlingsbara primära epidermal keratinocyter från bak av vuxna honmöss. Dessa keratinocyter är lämpliga för flödescytometri, Molekylär biologi ansökan, och primär cellkultur, inklusive den klonogena analysen rapporteras här. Denna keratinocyt skörd metod också har varit användbart för att studera andra nedströms aspekter av kutan kemisk carcinogenes och tumör promotion1,13.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. Först, för noggrannhet och reproducerbarhet, honmöss av ålder 54 ± 2 dagar användes. Detta har gjort det möjligt för oss att utföra känsliga och kvantitativa kolonianalyser från flera stammar av möss och att använda dem som en fenotyp i länkage analys som leder till identifiering av minst en ny stamcells reglerande gen10,11. För det andra är det bra att skära skinn i mindre bitar, som trypsinization är mer effektivt än att försöka hålla huden hela. För det tredje är tiden och temperaturen för trypsin flotation mycket viktigt för den efterföljande culturability. Dessutom måste man “peta betydligt” på hårstrån kvar på filtret för att få bort de bifogade cellerna. Detta steg är viktigt för att få hög avkastning av celler. Dessutom, den 32 ° c temperaturen i inkubatorn är viktigt för den långsiktiga odlingen av keratinocyter från vuxna möss. Slutligen, i detta protokoll, parallell avläsning av in vitro-och in vivo experiment1 är baserade på primära kulturer snarare än subkulturer eller cellinjer. Särskilt, om skörd primära keratinocyter för första gången med hjälp av detta protokoll, hålla resterande dermis efter skrapning för att bekräfta fullt avlägsnande av hårsäckar tillsammans med epidermis av histopatologisk observation.
Den främsta styrkan i detta protokoll för skörd vuxen mus keratinocyter är att det ger hög avkastning av odlingsbara celler som lämpar sig för många nedströms applikationer. Den viktigaste begränsningen är att vissa cellytan epitoper kan vara känsliga för trypsinization så att immun färgning kan äventyras. Därför, när du testar en ny cellyta antikropp, det kan vara klokt att använda en dispas6 eller thermolysin5 baserad metod för skörd för jämförelse. Betydelsen av detta protokoll är att den har testats rigoröst, kvantifierats och tillämpats på så skilda tillämpningar som analyser för klonogena stamceller1,9,10,11, för Mass kulturer i biokemi8, för FACS sortering i stamcells analys3,4, för molekylärbiologi3,12, och för pågående RNA och DNA-sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga erkännanden.
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |