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Behavior

Supramaximalen hypoxischer Intensität und Gefäßfunktion Bewertung bei Mäusen

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58708
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 3, 1, 2
1Division of Angiology, Heart and Vessel Department, Lausanne University Hospital (CHUV), 2Institute of Sport Sciences, Faculty of Biology and Medicine, University of Lausanne, 3Neonatal Research Laboratory, Clinic of Neonatology, Department Woman-Mother-Child, Lausanne University Hospital

Summary

High-Intensity-Training in Hypoxie ist ein Protokoll, die potenziell vorteilhaft bei einigen Patienten vaskuläre Anpassungen zu induzieren und Athleten zu verbessern Sprint Fähigkeit wiederholt bewährt hat. Hier testen wir die Machbarkeit der Ausbildung Mäuse verwenden, das Protokoll und die vaskulären Anpassungen mit ex-Vivo Gefäßfunktion Bewertung zu identifizieren.

Abstract

Übung-Training ist eine wichtige Strategie zur Erhaltung der Gesundheit und Prävention vieler chronische Krankheiten. Es ist die erste Linie der Behandlung von internationalen Leitlinien empfohlen für Patienten mit Herz-Kreislauf-Krankheiten, genauer gesagt, wo die Patienten zu Fuß Kapazität erheblich verändert ist, Extremität Arterie Krankheiten, niedrigere Auswirkungen auf ihre Verbesserung der Lebensqualität.

Traditionell haben niedrige kontinuierliche Übung und Intervall-Training eingesetzt. Vor kurzem, nachweislich supramaximalen Training auch Athleten Leistungen über vaskuläre Anpassungen, unter anderen Mechanismen zu verbessern. Die Kombination dieser Art von Training mit Hypoxie bringen könnte eine zusätzliche und/oder synergistische Wirkung, die für bestimmte Krankheiten von Interesse sein könnten. Hier beschreiben wir, wie supramaximalen Intensität Trainingseinheiten in Hypoxie auf gesunde Mäuse mit 150 % ihre maximale Geschwindigkeit ausführen ein motorisiertes Laufband mit einer hypoxischen Box. Wir auch zeigen, wie Sie die Maus zu sezieren, um Abrufen von Organen von Interesse, besonders der Lungenarterie, der Bauchschlagader und der Beckenkamm Arterie. Schließlich zeigen wir, wie ex-Vivo Gefäßfunktion Bewertung auf den abgerufenen Schiffen durchführen mit isometrischer Anspannung Studien.

Introduction

In Hypoxie führt die verminderte inspiriert Teil Sauerstoff (O2) zu Hypoxämie (gesenkten Blutdruck in Hypoxie) und eine veränderte O2 Transport Kapazität1. Akute Hypoxie induziert eine erhöhte sympathische Vasokonstriktor Tätigkeit richtet sich an Skelettmuskulatur2 und eine gegen "Ausgleichsmaßnahmen" Vasodilatation.

Bei submaximalen Intensität in Hypoxie ist dieser "Ausgleichsmaßnahmen" Vasodilatation bezogen auf das gleiche Maß an Übung inklusieve Bedingungen, , gut etablierte3. Diese Vasodilatation gilt, sorgen für einen erweiterten Blutfluss und Wartung (oder die Änderung zu begrenzen) der Sauerstoffzufuhr zu den aktiven Muskeln. Adenosin zeigte sich nicht haben eine eigenständige Rolle in dieser Antwort, während Stickstoffmonoxid (NO) die endotheliale Primärquelle scheint, da erhebliche Abstumpfung der augmented Gefäßerweiterung mit Stickoxid-Synthase (NOS) Hemmung während hypoxischen gemeldet wurde Übung4. Einige andere vasoaktive Substanzen spielen wahrscheinlich eine Rolle in der kompensatorischen Vasodilatation während eines hypoxischen Trainings.

Diese erhöhten hypoxischen Bewegung Hyperämie ist proportional zur Hypoxie-induzierten Herbst im arteriellen O2 -Gehalt und ist größer als die Übung Intensität zunahmen, zum Beispiel während intensivem inkrementelle Training in Hypoxie.

Die NO-vermittelten Bestandteil der kompensatorischen Gefäßerweiterung ist über verschiedene Wege mit zunehmender Übung Intensität3geregelt: Wenn β-adrenergen Rezeptor-keine Komponente angeregt wird während des niedrigen hypoxischen Trainings von größter Bedeutung , die Quelle kein Beitrag zur kompensatorische Dilatation scheint weniger abhängig von β-adrenerge Mechanismen wie die Trainingsintensität erhöht. Es gibt andere Kandidaten zur Stimulation keine Freigabe während des hypoxischen Trainings höhere Intensität, wie ATP aus Erythrozyten und/oder endotheliale abgeleitet Prostaglandine freigesetzt.

Supramaximalen Übung in Hypoxie (wiederholte Sprint Training in Hypoxie [RSH] in der Übung Physiologie Literatur genannt) ist ein den letzten Training Methode5 bietet Leistungssteigerung im Mannschaftssport oder Schläger Spieler. Diese Methode unterscheidet sich von Intervall-training in Hypoxie durchgeführt oder in der Nähe von max. Geschwindigkeit6 (Vmax) da RSH durchgeführt maximaler Intensität führt zu eine stärkere Muskel-Durchblutung und Sauerstoffversorgung7 und bestimmten Muskel transkriptionelle Antworten-8. Mehrere Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um die Wirksamkeit der RSH zu erklären: während der Sprints in Hypoxie, die kompensatorische Vasodilatation und damit verbundenen höheren Blutfluss würden profitieren die Fast-Twitch-Fasern über die slow-Twitch-Fasern. Infolgedessen dürfte RSH Effizienz Fasertyp selektive und Intensität abhängig sein. Wir spekulieren, dass die verbesserte Reaktionsfähigkeit des Gefäßsystems in RSH von größter Bedeutung ist.

Übung Schulung wurde ausgiebig in den Mäusen, in gesunden und pathologischen Maus Modelle9,10untersucht. Der häufigste Weg, um Mäuse zu trainieren ist ein Nagetier Laufband verwenden und die traditionell verwendete Therapie ist geringer Intensität Training, bei 40 – 60 % der Vmax (anhand eines inkrementellen Laufband Test11), für 30 – 60 min.12,13 ,14,15. Maximale Intensität Intervall-Training und ihre Auswirkungen auf Pathologien sind weit verbreitet in Mäusen16,17untersucht worden; So wurden Intervalltraining ausgeführten Protokolle für Mäuse entwickelt. Diese Protokolle bestehen meist aus ca. 10 Kämpfe laufen bei 80 – 100 % der V-max auf einem Nagetier motorisiertes Laufband, für 1 – 4 min, durchsetzt mit aktiven oder passiven Rest16,18.

Das Interesse an Mäusen mit supramaximalen Intensität (d. h. über die Vmax) in Hypoxie Ausübung kommt aus früheren Ergebnissen, denen die mikrovaskuläre gefäßerweiternde Vergütung und die intermittierende Trainingsleistung mehr erhöhte auf beides supramaximalen als maximal- bzw. mäßiger Intensität. Allerdings gibt es nach unserer Kenntnis keinen vorherigen Bericht von einer supramaximalen Trainingsprotokoll bei Mäusen, entweder in Normoxiezustand oder in Hypoxie.

Das erste Ziel der vorliegenden Studie war es, die Machbarkeit der supramaximalen Intensity Training bei Mäusen und die Bestimmung eines erträglich und angemessene Protokolls (Intensität, Sprintdauer, Erholung usw.) zu testen. Das zweite Ziel war, die Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Trainingsplan in Normoxiezustand und Hypoxie auf die Gefäßfunktion. Daher testen wir die Hypothese, dass (1) Mäuse vertragen supramaximalen Übung in Hypoxie und (2) dieses Protokoll eine größere Verbesserung der Gefäßfunktion als Übung in Normoxiezustand, sondern auch als Übung in Hypoxie bei niedriger Intensität induziert.

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Protocol

Der lokale Zustand Tierbetreuung Ausschuss (Service De La Consommation et des Affaires Vétérinaires [SCAV], Lausanne, Schweiz) genehmigt alle Experimente (Autorisierung VD3224; 01.06.2017) und alle Versuche wurden durchgeführt, im Einklang mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften.

1. Tierhaltung und Vorbereitung

  1. Haus 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6J männliche Mäuse in der Tierhaltung für mindestens 1 Woche vor Beginn der Experimente in Reihenfolge für die Mäuse zu ihren neuen Wohnverhältnissen zu gewöhnen. Aus praktischen Gründen sind in der Regel Mäuse derselben experimentellen Gruppe zusammen untergebracht.
  2. Halten Sie die Mäuse in einem temperierten Raum (22 ± 1 ° C) mit einem 12 h hell/dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.

2. Bestimmung der maximalen Geschwindigkeit und Standard Bewertung der Performance-Verbesserung von Laufband-Stufentest

Hinweis: Die folgenden Schritte sind entscheidend für die Trainingsprotokolle abschließen.

  1. Verwenden Sie ein motorisiertes Laufband für Mäuse wo Mäuse können auf mehrere Bahnen nebeneinander, mit einer 0°-Neigung und mit einem elektrischen Netz montiert auf 0,2 mA auf der Rückseite der Spur, um die Mäuse zu laufen zu fördern.
  2. Unterbreiten Sie vor der ersten Prüfung die Mäuse an 4 Tagen der Gewöhnung an das Laufband so das folgende Protokoll.
    1. Am 1. Tag haben Sie Mäuse mit 4,8 m/min für 10 min laufen.
    2. Am 2. Tag haben Sie die Mäuse bei 6 m/min für 10 min laufen.
    3. Am 3. Tag haben Sie die Mäuse mit 7,2 m/min für 10 min laufen.
    4. Am 4. Tag haben Sie die Mäuse mit 8,4 m/min für 10 min laufen.
  3. Am 5. Tag reichen Sie die Mäuse ein Stufentest bis zur Erschöpfung, nach das folgende Protokoll.
    1. Lassen Sie die Mäuse warm-up für 5 min bei 4,8 m/min (bei einer Neigung von 0°).
    2. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit von 1,2 m/min alle 3 min (z. B. 5 min bei 4,8 m/min, dann 3 Minuten bei 6 m/min, 3 min bei 7,2 m/min, 3 min bei 8,4 m/min, etc.) bis zur Erschöpfung, die erreicht wird, wenn die Maus entweder 3 aufeinanderfolgende Sekunden auf das elektrische Rasterfeld verbringt oder erhält 100 Schocks (angezeigt durch den Apparat).
    3. Notieren Sie sich die erreichte Geschwindigkeit (als die V-max), Dauer, Entfernung, Anzahl der Schocks, und Gesamt Zeit in der Startaufstellung.
      Hinweis: In der Regel Vmax betrug 28,8 ± 3,7 m/min.
    4. Mitte des Trainings erneut die Mäuse zu diesem Test um passen Sie die Geschwindigkeit der Ausbildung auf die aktualisierte Vmax der Mäuse (z.B. wenn das Trainingsprotokoll dauert 8 Wochen und führen Sie dann eine Mitte Training Stufentest 4 Wochen. In diesem Fall ersetzen Sie eine der geplanten Schulungen durch den Test), und wiederholen Sie also am Ende der Studie um Leistungsverbesserungen zu bewerten.
    5. Implementieren Sie eine 48 h Ruhezeit vor und nach diesem Test.
      Hinweis: Die inkrementellen Tests wurden am Morgen durchgeführt.

(3) hypoxischen Umwelt

  1. Platzieren Sie für das Training in Hypoxie das Laufband im Feld hypoxischen (Abbildung 1) zu einem Gas Mixer verbunden. Verwenden Sie einen kalibrierten Oximeter, um regelmäßig ambient Bruchteil von Sauerstoff (FichO2 [d. h. die Höhe der Hypoxie]) im Feld steuern.
  2. Der Gasmischer auf 100 % Stickstoff (N2) und verwenden Sie das Oximeter, um das Niveau der Hypoxie zu überprüfen. Einmal FichO2 = 0,13, ändern Sie die Parameter der Gasmischer aus 100 % N2 auf 13 % O2.
  3. Um längere passive Exposition gegenüber Hypoxie zu vermeiden, legen Sie die Mäuse in einem temporären kleiner Käfig mit Einstreu und Bereicherung und schnell platzieren Sie es im Feld einmal FichO2 = 0,13 erreicht wurde. Stellen Sie sicher, dass die Umwelt immer noch bei 13 % O2 nach dem Aufsetzen des Käfigs in; Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie es.
  4. Prüfen Sie regelmäßig die Höhe der O2 , im Laufe einer Trainingseinheit um sicherzustellen, dass es FiO2 bleibt = 0,13 ± 0,002.

(4) inklusieve Umwelt

  1. Für das Training in Normoxiezustand, das Laufband im hypoxischen Feld halten, aber die Handschuhe zu entfernen, so dass es Umgebungsluft (FichO2 = 0,21). Ziel ist es, die gleiche Ausbildung Umwelt als die Mäuse in Hypoxie neu.

5. supramaximalen-Intensity-Training

  1. Legen Sie die Mäuse auf einzelne Spuren in der Tretmühle (bei einer 0° Neigung) und legt sie auf das folgende Protokoll.
    1. Haben Sie die Mäuse 5 min warmlaufen mit 4,8 m/min, gefolgt von 5 min bei 9 m/min.
    2. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Sprints auf 150 % der die zuvor ermittelte Vmax.
      Hinweis: In der Regel die Sprint-Geschwindigkeit war 42.1 ± 5,5 m/min.
    3. Trainieren Sie die Mäuse für vier Gruppen von 5 x 10 s Sprints mit 20 s Pause zwischen jedem Sprint. Der interset Rest ist 5 min (Abbildung 2).
      Hinweis: Fügen Sie eine Abklingzeit, wenn die gesamte Arbeitsbelastung des Trainings mit einer anderen Ausbildungsgruppe übereinstimmen muss.
  2. Führen Sie das training 3 X pro Woche, mit vorzugsweise 48 h zwischen den Trainingseinheiten.
  3. Verwenden Sie Wattestäbchen als eine ergänzende Methode, um elektrische Schläge um zu ermutigen, die Mäuse zu laufen. Legen Sie ein Wattestäbchen in einen Schlitz an der Spitze der Gasse zwischen der Maus und dem elektrischen Netz und schubsen Sie sanft die Maus, wenn sie die Rückseite des Laufbandes erreicht. Die Lieferung der elektrischen Schlag vermeiden wird und die Mäuse laufen in einer weicheren Weise zu stimulieren.

(6) Low-Intensity-Training

  1. Legen Sie die Mäuse auf einzelne Spuren in der Tretmühle (bei einer 0° Neigung) und legt sie auf das folgende Protokoll.
    1. Haben Sie die Mäuse 5 min warmlaufen mit 4,8 m/min, gefolgt von 5 min bei 7,2 m/min.
    2. Stellen Sie die Geschwindigkeit der kontinuierlich laufenden Sitzung zu 40 % von den vorher festgelegten Vmax.
      Hinweis: In der Regel war die kontinuierliche laufende Geschwindigkeit 9,9 m/min.
    3. Die Mäuse für 40 min zu trainieren.
    4. Führen Sie das training 3 X pro Woche mit vorzugsweise 48 h zwischen den Trainingseinheiten.
    5. Verwenden Sie Wattestäbchen als eine ergänzende Methode, um elektrische Schläge um zu ermutigen, die Mäuse zu laufen.

(7) Mäuse Euthanasie und Orgel Extraktion

  1. Am Ende der Ausbildung Protokoll und mindestens 24 Stunden nach dem letzten inkrementellen Test betäuben Sie die Maus in eine Induktion-Kammer mit Isofluran (4 – 5 % O2 induzieren Anästhesie und 1 – 2 % 100 % O2 weiterhin Anästhesie). Ordnungsgemäße Anesthetization mit der Pfote Retraktion Reflex zu bestätigen (fest kneifen des Tieres Pfote; Anästhesie wird richtige betrachtet, wenn das Tier nicht auf den Reiz reagiert).
  2. Mit einer 25 G Nadel, führen Sie eine perkutane Herzpunktion, um maximale Blutvolumen als zuvor beschriebenen19zu sammeln.
  3. Führen Sie eine zervikale Dislokation und entfernen Sie die Haut der Maus, indem Sie die erste Schicht der Haut auf dem Bauch mit einer Runde-Tip Schere durchschneiden und auf beiden Seiten des Schnittes (in Richtung der Kopf und die Rute).
  4. Schnitt durch das Peritoneum unter den Brustkorb auf der linken Seite der Maus mit dünn-Punkt-Tip Schere zu erreichen die Milz und entpacken Sie es, wenn nötig.
    Hinweis: Sezieren Sie, Muskeln, wenn nötig.
  5. Sezieren Sie, der Lungenarterie.
    1. Mit kleinen Scheren und Pinzetten, entfernen Sie den Brustkorb und die Herz-Lungen-Bereich.
    2. Kneifen Sie mit "selbstschließend" Pinzette die Herzen so nah wie möglich an die Spitze und ziehen Sie sanft an die Basis der Aortenbogen und der Lungenarterie zu dehnen.
    3. Mit der rechten Hand, zurück gebogenen Pinzette einfügen unter der Lungenarterie und der Aorta und bewegen Sie die Pinzette ein wenig zu halten Sie nur die Lungenarterie (Abbildung 3).
    4. Verwenden Sie die linke Hand, um ein weiteres paar Pinzette, die statt mit der rechten Hand ersetzen einzufügen.
    5. Mit scharfen geraden Microscissors in der rechten Hand, sezieren der Lungenarterie als sehr am Herzen wie möglich auf der einen Seite, und so weit wie möglich auf der anderen Seite.
      Hinweis: Es spielt keine Rolle welche Hand welches Instrument hält, obwohl wir es leichter zu schneiden Sie mit der rechten Hand als mit der linken Seite gefunden zu haben.
    6. Legen Sie es in eine 2 mL-Tube mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer und halten Sie auf dem Eis.
  6. Führen Sie eine Ganzkörper-Perfusion.
    1. Benutzen Sie an der Spitze der rechten unteren Extremität der Maus eine Pinzette um die externe interne rechts Beckenkamm Arterie bis die richtige Femoral Arterie (unter der inguinalen Ligamentum) zu löschen. Mit scharfen geraden Microscissors, machen Sie einen vollen Schnitt in die Femoral Arterie.
    2. Legen Sie eine 5 mL 25 G Spritze gefüllt mit kaltem PBS in den linken Ventrikel des Herzens und injizieren Sie kalten PBS um das restliche Blut aus den Gefässen entfernen sanft zu.
      Hinweis: Durch die Gewinnung von der Lungenarterie ist es möglich, dass PBS nicht ganz nach dem Schnitt im Umlauf ist.
  7. Mit einer Pinzette, entfernen Sie das weiche Gewebe rund um die Aorta aus dem linken und rechten leisten-Bänder ins Herz so gründlich wie möglich.
    Hinweis: Das Herz kann bei Bedarf zur weiteren Analyse extrahiert werden.
  8. Mit Pinzette und Microscissors, sezieren Sie das Herz bis zum niedrigsten Punkt der externen Beckenkamm Arterie (in der linken und rechten Gliedmaßen) und komplett zerlegt-Abschnitt in einem 10 cm-Durchmesser Teller mit kaltem PBS.
  9. Beenden Sie mit Hilfe einer Pinzette und/oder Microscissors, Reinigung der restlichen Fett um die Aorta und die Arterien durch sanft ziehen oder schneiden es weg von den Schiffen.
  10. Mit Microscissors, Schneiden der linken Beckenkamm Arterie an der Bifurkation Beckenkamm Arterie links-rechts und zur weiteren Analyse zu speichern.
  11. Mit Microscissors, Schneiden der Bauchschlagader unter der linken Nierenarterie, und stellen Sie das extrahierte Gefäß in kaltem PBS-Puffer auf dem Eis (Abbildung 4).
  12. Halten Sie die verbleibenden gereinigte Behälter aus dem Aortenbogen nach rechts oberhalb der linken Nierenarterie im Speicher für die weitere Analyse.

Figure 4
Abbildung 4 : Bild der seziert Schiffe. Extrahierten Schiff von der Spitze der Bauchschlagader (unterhalb der linken Nierenarterie) bis zum Ende der rechten Beckenkamm Arterie, bereit, in kaltem PBS-Puffer auf Eis gelegt werden. (1) Abdominal Aorta. (2) rechts gemeinsame Beckenkamm Arterie. (3) externe Beckenkamm Arterie. (4) innere Beckenkamm Arterie. (5) Femoral Arterie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(8) ex Vivo Gefäßfunktion Bewertung

Hinweis: Eine Wäsche entspricht die Entleerung und Befüllung der Kammern mit Krebs.

  1. Nach einer zuvor beschriebenen Protokoll20vaskulären Ringe von 1,0-2,0 mm lang die isolierte Lungenarterie, Bauchaorta und rechten Beckenkamm Arterie Segmente geschnitten und jeder Ring auf zwei 0,1 mm Durchmesser Steigbügel durchlief das Lumen zu montieren.
  2. Aussetzen der Schiff-Ringe in vertikalen Orgel Kammern gefüllt mit 10 mL der modifizierte Krebs-Ringer-Bikarbonat-Lösung (118,3 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25,0 mM Nahco33und 11,1 mM Glukose) bei 37 ° C gepflegt und belüftet mit 95 % O2-5 % CO2 (pH 7,4). Ein Steigbügel an der Unterseite der Orgel Kammer verankert ist und die ander ist ein DMS zur Messung der isometrischen Kraft in Gramm an.
  3. Die Schiffe bringen ihre optimale ruhende Spannung: Ringe 0,5 g für die Lungenarterie, 1,5 g für den Beckenkamm Arterie und 2 g für die Bauchaorta zu dehnen, und waschen Sie sie nach einer 20 min Gleichgewichtherstellung. Wiederholen Sie die Dehnung-Gleichgewichtherstellung-Wash die Schritte 1 X.
  4. Um die Tragfähigkeit der Schiffe zu testen, schrumpfen die Ringe mit 235 µL KCl (10-1 M) für 10 min, waschen Sie sie für weitere 10 min, und Vertrag wieder mit 235 µL KCl (10-1 M) für ca. 20 min bis zum Erreichen einer Hochebene.
  5. Waschen Sie die Schiffe wieder für 10 min. und fügen Sie 58,4 µL von Indometacin (10-5 M) (Hemmstoff der Cyclooxygenase-Aktivität) für mindestens 20 Minuten hinzu, um mögliche Störungen der endogenen Prostanoide zu vermeiden.
  6. 10-4 M kumulativen Dosen von Phenylephrin (Phe) aus 10-9 (10 µL) hinzufügen (oder 10-9 bis 10-5 M für die Lungenarterie; 9 µL für alle Konzentrationen über 10-9 M) auf die Gefäße zusammenziehen.
  7. Warten Sie nach der letzten Dosis von Phe ca. 1 h, bis die Schiffe einen relativ stabilen Kontraktion Zustand (Plateau) zu erreichen.
  8. Hinzufügen von kumulativen Dosen von der Endothel-abhängigen gefäßerweiternde Acetylcholin (ACh) aus 10-9 bis 10-4 M (58,4 µL für 10-9 M, und abwechselnd 12,6 µL und 40 µL für alle Konzentrationen über 10-9 M), induzieren Salpetersäure Stickoxid (NO)-Entspannung vermittelt.
  9. Am Ende der Kurve Entspannung waschen Sie die Gefäße für 10 min und fügen Sie 58,4 µL von Indometacin (10-5 M) sowie 184 µL NG-Nitro-L-Arginin (NLA, 10-4 M), die ein Inhibitor von NOS, mindestens 20 min lang ist.
  10. Vertrag die Schiffe wieder mit einer einmaligen Dosis von 10 µL Phe (10-5 und 10-4 M für die Lungenarterie und 10-4 M für die Bauchaorta und der Beckenkamm Arterie) für 1 h, induzieren eine relativ stabile Kontraktion.
  11. Fügen Sie eine einmalige Dosis von 40 µL von ACh (10-4 M) bis zum Erreichen einer Hochebene.
  12. Waschen Sie die Gefäße wieder für 10 min. vor dem Hinzufügen von 58,4 µL von Indometacin (10-5 M) und 184 µL der NLA (10-4 M) für 20 Minuten.
  13. Zusammenziehen der Gefäße mit 10 µL Phe (10-5 und 10-4 M) 1 h.
  14. Hinzufügen von kumulativen Dosen (10-9 [58,4 µL] bis 10-4 M [40 µL für alle Konzentrationen über 10-9 M]) kein Spender Diethylamine (DEA) / Nein, bestellen die Endothel-unabhängige NO-induzierte Entspannung zu beurteilen.
  15. Am Ende des Experiments speichern Sie die Schiffe in flüssigem Stickstoff für zukünftige Analysen bei Bedarf.

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Representative Results

Nach unserer Kenntnis ist die vorliegende Studie die erste, eine Programm der supramaximalen Intensity Training in Normoxiezustand und Hypoxie bei Mäusen zu beschreiben. In diesem Protokoll lief Mäuse vier Sätzen von fünf 10 s Sprints mit einer 20 s Erholung zwischen jedem Sprint. Die Sätze wurden mit 5 min von Erholungsphasen durchsetzt. Es war unbekannt, ob die Mäuse wäre in der Lage ein solches Protokoll und füllen Sie es richtig. Die Gewichtszunahme der Mäuse die supramaximalen Intensität Ausbildung war jedoch gemäß Abbildung 5, ähnlich wie die Mäuse, die niedrigen Ausbildung, sowohl in Normoxiezustand als auch in Hypoxie.

Das Wohlbefinden der Tiere wurde zweimal in der Woche überwacht, mit Wertungsbögen, anhand der folgenden Kriterien: aussehen, natürliches Verhalten und Körpergewicht. Jedes dieser Kriterien wurde bis zu einem Ergebnis von 3 eingestuft, und eine Maus mit einem Score von 3 in jedem dieser Kriterien wurde in Schmerzen und/oder Distress durch das anhaltende Protokoll erwogen und musste eingeschläfert werden. Keine Maus erreicht je einen Punktestand von 3 im Laufe eines Trainings-Schemata (Tabelle 1).

Wie in der Einleitung dargestellt, hat es vermutet wurde, dass supramaximalen Ausbildung, insbesondere in Kombination mit Hypoxie, eine kompensatorische Vasodilatation auslösen würde. Dieses Phänomen soll ausreichend O2 an den Auftraggeber Muskeln, dadurch kompensieren das Ungleichgewicht zwischen O2 Angebot und Nachfrage, das durch die Kombination von supramaximalen-Intensity-Training erhöht wird und Hypoxie. Um diese Hypothese zu prüfen, verwendeten wir die zweite Technik präsentiert hier die Ex Vivo Gefäßfunktion Bewertung, über die Lungenarterie, der Bauchschlagader und der rechten Beckenkamm Arterie. Abbildung 6 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurven erhalten am Ende des Protokolls über die Bauchaorta einer Maus aus dem Training in der Gruppe mit supramaximalen Intensität in Hypoxie. Diese Grafik zeigt den gesamten Prozess der Kontraktion-Entspannung nach der Zugabe von verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen beobachtet (KCL, Phe, ACh, NLA und [DEA] / no) in der Orgel-Bäder.

Abbildung 7 zeigt die Dosis-Wirkungs-Entspannung-Kurve für die rechten Beckenkamm Arterie zu steigenden Konzentrationen von ACh. Die beiden vertretenen Gruppen sind die supramaximalen Intensität in Normoxiezustand Gruppe (SupraN) und supramaximalen Intensität in Hypoxie-Gruppe (SupraH). Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass SupraH tendenziell ACh-induzierte Entspannung im Vergleich zu SupraN, mit deutlichen Unterschieden bei 10-5 M und 10-4 M zu verbessern.

Figure 1
Abbildung 1 : Hypoxische Setup. Das Laufband wird innerhalb der hausgemachten Glovebox, verbunden mit einem Gasmischer platziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Beschreibung einer supramaximalen Intensität Trainingseinheit. Die Mäuse durchgeführt vier Sätze von fünf 10 s Sprints, durchsetzt mit 20 s Rest. Der interset Rest war 5 min. Diese Zahl wird vom Faiss Et Al.21angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Schematische Darstellung der Technik die pulmonale Aorta abrufen. (1) Ort der Pinzette unter der Lungenarterie und der Aorta. (2) ziehen Sie wieder die Pinzette in die Richtung der Nummer 2 um die Pinzette unter der pulmonalen Aorta nur zu halten. (3) Endposition der Pinzette. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Körper Gewicht Entwicklung im Laufe des Experiments. In grün, die Low-Intensity-Training-Gruppen; in rot, die Trainingsgruppen supramaximalen Intensität. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen jederzeit die Zeitpunkte (n = 4 Mäuse pro Gruppe; die Daten werden dargestellt als ± SD bedeuten). Statistische Auswertung erfolgte mittels einer zwei-Wege-wiederholte Maßnahme ANOVA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Gefäßfunktion Bewertung Kurven. Abfolge von Phasen der Anspannung und Entspannung induziert in das gesamte Protokoll, ausgedrückt in Gramm. Repräsentative Aufnahme der Variationen in Schiff Spannung als Reaktion auf die verwendeten Substanzen in einem Ring der Bauchschlagader von einer Maus isoliert trainiert mit supramaximalen Intensität in Hypoxie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Pharmakologische Reaktionen einer isolierten Beckenkamm Arterie vorgefertigt mit Phenylephrin (Phe), Acetylcholin (ACh). Kumulative Dosis-Wirkungs-Entspannung-Kurve des rechten Beckenkamm Arterie zu steigenden Konzentrationen von ACh (10-9 bis 10-4 M). Das Ergebnis wird ausgedrückt als ± SD von den Prozentsatz der Änderung in der Spannung induziert durch die gefäßerweiternde bedeuten mit n = 3 in SupraN und n = 4 Zoll SupraH. Statistische Auswertung erfolgte mittels einer zwei-Wege-ANOVA für Messwiederholungen Test. p < 0,05 vs. SupraN. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Table 1
Tabelle 1: typische Partitur Blatt eines Maus-Trainings mit supramaximalen Intensität in Hypoxie. Wir verwendeten Bewertungsbögen um das Wohlergehen der Mäuse zu überwachen. Eine Punktzahl von 3 in eines der Kriterien angegeben (aussehen, natürliches Verhalten und Körpergewicht) oder einem Gesamtscore von 5 (durch Zugabe von der Punktzahl in jeder Kategorie) bedeutete das Tier litt und musste eingeschläfert werden.

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Discussion

Das erste Ziel dieser Studie war der Durchführbarkeit des hypoxischen hoch intensives Training bei Mäusen und die ausreichende Eigenschaften des Protokolls zu bestimmen, die von Mäusen gut vertragen würde. Absichtlich, da keine Daten mit supramaximalen (d.h. mehr als V-max)-Intensity-Training bei Mäusen, mussten wir führen Studien basierend auf vorangegangenen Protokolle entwickelt mit Athleten, bestehend aus vier bis fünf Sätze von fünf all-out Sprints (ca. 200 % des Vmax), durchsetzt mit 20 s aktive Erholungen, mit einer interset aktive Erholung von 5 min21,22. Daher die erste bestand aus sechs Sätze von sechs 10 s Sprints auf 200 % des Vmax, durchsetzt mit 20 s passive Erholung und mit einer interset passive Erholung von 3 min, fünfmal pro Woche durchgeführt. Nach ein paar try-out läuft auf 200 % des Vmax, unter Berücksichtigung der Mäuse hatte Mühe, die Aufrechterhaltung einer hohen Intensität, beschlossen wir, die Geschwindigkeit auf 150 % der Vmaxzu verringern. Mit der Trainingsintensität, wir haben versucht, die Mäuse über die Länge eines vollständigen Protokolls auszuführen und Einstellen der Anzahl von Sprints innerhalb jedes Satzes und die Anzahl der Sätze pro Sitzung. Zu guter Letzt wir die Erholungszeit zwischen den Sätzen erhöht und verringert die Häufigkeit des Trainings. Nach einem Versuch-und-Irrtum-Methode haben wir eine optimale Schlussprotokolls sehr ähnelt, die auf Athleten verwendet und ermöglicht für Mäuse, dieser supramaximalen Intensität Test zu tolerieren.

Es gibt eine leichte Möglichkeit, dass die Leistung der Mäuse stark unterschätzt werden könnten, wie aus den großen Unterschieden zwischen früheren Studien unter Verwendung tierischer Übung Protokolle23,24beobachtet. Jedoch in der vorliegenden Studie, basierend auf Pre-Experiment Werte, es wäre unmöglich gewesen, eine höhere relative Intensität auf die Tiere, die in Anbetracht der Notwendigkeit, die gesamte wiederholten Sprints abzuschließen zu verhängen. Darüber hinaus berichtet die V-max -Werte in dieser Studie (28,8 ± 3,7 m/min) scheinen in den Bereich der Werte, die zuvor in der gleichen C57BL/6J Stamm25,26,27,28gemeldet werden. Zum Beispiel berichtet Lightfoot Et Al.25 ~ 28 m/min und Muller Et Al.27 Werte der 28,3 m/min. Daher sind wir zuversichtlich, dass die Intensität der supramaximalen Sprint Trainingsintensität in diesen Mäusen entspricht.

Auch wenn kritische Drehzahl (CS) (1) ein wertvolles Mittel für die Verschreibung von Trainingsintensität bei gesunden Menschen und Patienten29 sein und (2) perfekt in Mäusen23,24,30, die Übung bestimmt werden nachweislich Intensität Rezept basiert auf der Bestimmung der V-max nach wie vor relevant. Es ist bekannt, dass bei Mäusen, die entschlossen VO2peak und VO2max abhängen, das Protokoll, und als mit den Menschen, VO2max ermittelt werden mit einer Rampe Übung Protokoll11. Da das Ziel der vorliegenden Studie war es, festzustellen, die Machbarkeit der supramaximalen wiederholt Sprint in Mäuse, und trotz der Relevanz der CS, wir glauben nicht, dass mit Vmax ein Fehler zu den Zielen dieser Studie wäre.

Während der Beobachtung von Mäusen Verhalten, zeigte sich, dass das elektrische Rasterfeld auf der Rückseite des Laufbandes zwar Mäuse laufen ermutigt; jedoch schien es auch zu ihrer Müdigkeit beitragen. In der Tat hatte das Raster aus dem laufenden Band leicht verschoben, die Mäuse erzeugen einen zusätzlichen Aufwand, um wieder auf die Spur zu kommen. Wir beschlossen, diese Stimulation mit einem anderen, weicher, One, nämlich die Baumwolle Tupfer Stimulation, ergänzen die verringerte sich der Anzahl der Schocks erhielt von den Tieren und sie daran gehindert, um wieder aus dem Netz auf der Spur haben. Trotz der Empfehlung Kregel Et Al.31bleibt unklar, ob Stress abgebaut wird mit der Luft Blätterteig Stimulation im Vergleich zu der Stromnetz-32.

Soweit wir wissen, hat nur eine Studie "sprint-Intervall-Training"33verwendet. Jedoch seit die höchste Intensität, dass Studie bis 75 % – 80 % der V-max entsprach und die Sprintdauer 1,5 min Betrug, dieses Protokoll sah ganz anders aus der jetzige (z.B. 150 % der V-max; 10 s). Es war unbekannt, ob supramaximalen Intensität von den Mäusen toleriert werden würde. In der vorliegenden Studie liefern wir Ergebnisse zeigen, dass die Tiere sehr gut in diesem supramaximalen-Intensity-Training, sowohl in Hypoxie und Normoxiezustand durchführte. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5 eine Zunahme des Körpergewichts über die Ausbildungszeit ähnlich wie in den niedrigen Gruppen beobachtet. Auch spiegelt Tabelle 1 der Wohlstand mit einem Score niedriger als 3 in allen Gruppen. Insgesamt zeigen diese physiologischen Parameter, dass Hypoxie und supramaximalen-Intensity-Training von Mäusen sehr gut vertragen wurden.

Das zweite Ziel der vorliegenden Studie war es, die Gefäßfunktion von der Lungenarterie, der Bauchschlagader und der Beckenkamm Arterie mit isometrischen Schiff Spannung Studien20zu bewerten. Diese Technik ermöglicht es, festzustellen, ob die Intervention des Interesses die Fähigkeit der Gefäße beeinflusst zu kontrahieren und entspannen Sie sich in Reaktion auf pharmakologische Medikamente. Wie in Abbildung 7gezeigt, war die Beckenkamm Arterie entspannt mit steigenden Konzentrationen von ACh. Die beobachteten Kurven reflektieren eine progressive Zunahme der Entspannung der Gefäße, ausgeprägter für die SupraH-Gruppe. Wenn einer der beobachteten Kurven war ganz flach und etwa 0 % der Entspannung, es könnte bedeuten, die das Medikament nicht an der Orgel-Kammer geliefert wurde, oder die Schiffe während der Dissektion oder die Montage an die Steigbügel beschädigt worden, oder dass man die Medikamente war keine t verabreicht bei der optimalen Dosis oder lange genug.

Supramaximalen-Intensity-Training in Hypoxie wird jetzt auf Mäuse übertragen und potenziell genutzt werden auf pathologische Modelle zur Verbesserung verschiedener Parameter, einschließlich der Gefäßfunktion, die isometrischen Schiff Spannung Studien beurteilt werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten danken Danilo Gubian und Stephane Altaus aus der Lausanne University Hospital (CHUV) mechanische Werkstatt für die Unterstützung der hypoxische Einrichtung zu erstellen. Die Autoren möchten auch Diane Macabrey und Melanie Sipion Danke für ihre Hilfe bei der Ausbildung der Tiere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cotton swab Q-tip
Gas mixer Sonimix 7100 LSI Swissgas, Geneva, Switzerland Gas-flow: 10 L/min and 1 L/min for O2 and CO2, respectively
Hypoxic Box  Homemade Made in Plexiglas
Motorized rodents treadmill Panlab LE-8710 Bioseb, France
Oximeter Greisinger GOX 100 GREISINGER electronic Gmbh, Regenstauf, Germany
Sedacom software Bioseb, France
Strain gauge PowerLab/8SP; ADInstruments

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Verhalten Ausgabe 145 supramaximalen Intensität Hypoxie Gefäßfunktion Mäuse Laufband laufen
Supramaximalen hypoxischer Intensität und Gefäßfunktion Bewertung bei Mäusen
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Lavier, J., Beaumann, M., Ménetrey, S., Mazzolai, L., Peyter, A. C., Pellegrin, M., Millet, G. P. Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice. J. Vis. Exp. (145), e58708, doi:10.3791/58708 (2019).

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