Summary
ويصف هذا البروتوكول إنتاج خيوط polycaprolactone (PCL) مع المضمنة polylactic حمض (جيش التحرير الشعبي) الجزئي المجالات الخرز الصغير التي تتضمن مصفوفات ديسيلولاريزيد (ألماني) للطباعة 3D من الأنسجة الهيكلية الهندسية بنيات.
Abstract
بيوبرينتينج 3D يهدف إلى إنشاء مخصص السقالات النشيطة بيولوجيا واستيعاب الحجم المطلوب والهندسة. دعامة حرارية يمكن أن توفر الاستقرار ميكانيكية مشابهة للنسيج الأصلي بينما توفر العوامل البيولوجية العظة التركيبية للخلايا السلف، مما يؤدي إلى الهجرة والانتشار، والتمايز إلى إعادة تشكيل الأنسجة الأصلية/ أجهزة1،2. لسوء الحظ، العديد من متوافق مع 3D الطباعة، البوليمرات بيوريسوربابل (مثل حمض اللبنيك، جيش التحرير الشعبي الصيني) المطبوع في درجات حرارة 210 درجة مئوية أو أعلى--درجات الحرارة التي تضر بالبيولوجي. من ناحية أخرى، هو polycaprolactone (PCL)، نوع مختلف من البوليستر، بيوريسوربابل، ومواد للطباعة ثلاثية الأبعاد يحتوي على درجة حرارة طباعة الطف من 65 درجة مئوية. ولذلك، كان الافتراض بأنه المصفوفة خارج الخلية ديسيلولاريزيد (ألماني) الواردة ضمن حاجز جيش التحرير الشعبي الصيني حرارياً وقائي يمكن أن تكون طباعة داخل الشعيرة PCL والبقاء في أن تكيف وظيفي. في هذا العمل، كان إصلاح osteochondral التطبيق التي تم اختبار الفرضية. على هذا النحو، كان ديسيلولاريزيد الغضاريف الخنزير ومغلفة في polylactic حمض (جيش التحرير الشعبي) الجزئي المجالات الخرز الصغير الذي كان مقذوف ثم مع polycaprolactone (PCL) في خيوط لإنتاج 3D بنيات عبر تنصهر فيها ترسب النمذجة. بنيات مع أو بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير (PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني و PCL(-)، على التوالي) تم تقييم الفروق في السمات السطحية.
Introduction
استخدام التقنيات الهندسية الأنسجة الحالية للتطبيقات السريرية مثل إعادة بناء العظام والغضاريف والاوتار والرباط السيارات--واللوجرافتس لإصلاح الأنسجة التالفة. كل من هذه التقنيات هو يؤديها بشكل روتيني ك "معيار الذهبي" في الممارسة السريرية أول حصاد الأنسجة المانحة سواء من المريض أو تطابق المأخوذة، وثم وضع الأنسجة المانحين إلى عيب الموقع2. ومع ذلك، تقتصر هذه الاستراتيجيات المانحة الموقع الاعتلال، ندرة موقع المانحة لعيوب كبيرة، خطر العدوى، وصعوبة العثور على الطعوم التي تطابق هندسة المرجوة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن اللوجرافتس المستخدمة لإعادة الإعمار قد خفضت الخصائص الميكانيكية والبيولوجية بالمقارنة مع الأنسجة الأصلية3. هذه الاعتبارات في الحسبان، ومهندسو الأنسجة تحولت مؤخرا إلى بيوبرينتينج (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة لإنتاج الهندسات مخصصة، ومجمع النشيطة بيولوجيا ومصممة لاستيعاب حجم الخلل والشكل مع توفير كافية خصائص ميكانيكية حتى اكتمال إعادة عرض البيولوجية.
ومن الناحية المثالية، سيتألف سقالة طباعة 3D دعامة البوليمرية يمكن الاحتفاظ باستقرار الميكانيكية المطلوبة من الأنسجة الأصلية بينما تقدم البيولوجي إدراج الإشارات البيوكيميائية المحيطة بالخلايا، مما يؤدي إلى الهجرة، الانتشار، التمايز، والأنسجة إنتاج2،5. ولسوء الحظ، تتم معظم بنيات التي تحتوي على المكونات البيولوجية مع المواد الهلامية أو البوليمرات التي أضعف من أن يصمد في فيفو القوات تتعرض الأنسجة المستهدفة لإعمار السيارات/allograft. البوليمرات الأخرى مثل حمض اللبنيك (جيش التحرير الشعبي) هي بيوريسوربابل، 3D للطباعة وهيكليا الصوت، ولكن يتم طباعتها في درجات الحرارة عند أو فوق 210 درجة مئوية--مما يجعل من المستحيل البيولوجي أن المطبوع المشترك أثناء التصنيع. Polycaprolactone (PCL) هو آخر مسح إدارة الأغذية والعقاقير، بيوريسوربابل البوليمر يمكن أن 3D مطبوعة في درجة حرارة أقل (65 درجة مئوية)، التي أصبحت شعبية متزايدة في اختﻻق يزرع المريض على حدة مع مجمع مورفولوجيس5،6 7، ،،من89. بيد أن معظم بيوبرينتيرس باستخدام هوائي التكنولوجيا تجعل من المستحيل على طباعة PCL عند درجات حرارة منخفضة حيث يمكن أن تظل الأنشطة البيولوجية سالمين. حتى الآن، على إدماج هذه البوليمرات مع السيارات/اللوجرافتس مادة بيولوجية قابلة لطباعة رواية لم يتحقق. في غياب مثل هذه المواد، من المستبعد نهجاً صحيحاً أنسجة المهندسة لإعادة بناء الأنسجة. ولذلك، قد سعت إلى الجمع بين جيش التحرير الشعبي الصيني، PCL، وديسيلولاريزيد مصفوفات allograft (مارك ألماني) الاستفادة من مزايا كل المواد لصنع بنية سليمة قادرة على إعادة بناء الأنسجة المعقدة. هذه العملية ستوفر القوة الميكانيكية الأولية اللازمة لمقاومة القوات في فيفو والثبات الحراري لاستيعاب التصنيع المضافة في بنية الحث على تشكيل النسيج المطلوب.
في محاولة الأخيرة لمعالجة العقبات السالفة الذكر، واظهرنا أنه من الممكن لتغليف الغضروف ديسيلولاريزيد المصفوفة خارج الخلية داخل حاجز جيش التحرير الشعبي الصيني حرارياً واقية التي يمكن مقذوف داخل خيوط PCL، الحفاظ على قدرة مارك ألماني للتأثير على الخلايا المضيفة المحيطة بها2. هذا وقد الهمتنا التماس نهج فعالة سريرياً لإعادة بناء الأنسجة. في الدراسة الحالية، ويمكننا الاستفادة من التكنولوجيا منصة لبناء السقالات الكل في واحد التي تشمل جيش التحرير الشعبي الصيني، مارك ألماني، و PCL (PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني).
أن هدفنا تحسين الفعالية والفائدة من اللوجرافتس باستخدام تقنية بيوفابريكيشن الجديدة المقترحة أن الخص أدق الأنسجة الأصلية، وفي النهاية استخدامها في مختلف التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الحصول على وتجهيزها الجزئي المجالات الخرز الصغير
- تغليف المنتجات الجزئي المجالات الخرز الصغير مع المصفوفة المطلوبة (جيش التحرير الشعبي الصيني مارك ألماني)2.
ملاحظة: لا بد أن الجزئي المجالات الخرز الصغير ذات حجم موحد. لهذا السبب، من الضروري النخل الجزئي المجالات الخرز الصغير مسبقة لاستخدام. على الرغم من أن قد تم التفصيل مصفوفة ديسيلولاريزيشن والتغليف في المنشورات السابقة2، فيما يلي ملخص موجز للعملية.- أولاً، الحصاد المقابس الغضروف من الخنزير هند أطرافه. ديسيلولاريزي الغضروف في سلسلة من يغسل مع 0.05% التربسين/0.5 مم صوديوم حمض الإيثيلين (يدتا)، تعديل دولبيكو النسر حمض الاستيك المتوسطة (دميم)، و 1.5% و 2.0% X-100 تريتون ح 4 كل مع يغسل الماء المقطر قبل وبعد كل خطوة2.
- استنزاف مصفوفة ديسيلولاريزيد وتجميدها، ليوفيليزي، وطحن ويذوب في حل بيبسن. وبعد انحلال، مزيج الحل بيبسن مع جيش التحرير الشعبي الصيني الذي قد تم حله في الميثان.
- إضافة الخليط دروبويسي إلى 3% البولي فينيل كحول في المحلول المائي. الطرد المركزي الناتج الجزئي المجالات الخرز الصغير والشطف واستنزاف، وليوفيليزي مرة أخرى.
ملاحظة: للحصول على تفاصيل كاملة حول العملية انظر البروتوكول المنشورة سابقا2.
- منخل الجزئي في المجالات الخرز الصغير.
- التأكد من أن جميع لوحات غربال قد تم تنظيفها وجافة قبل الاستعمال. إذا كان ضروريا، نظيفة المسارب استخدام الموجات فوق الصوتية الأنظف ضمان إزالة كافة المجالات من المنخل.
- تجميع شاكر غربال مع علبة غربال ميكرومتر 106 في الجزء العلوي، علبة ميكرومتر 53 بعد، وغربال عموم في الجزء السفلي.
- وضع الجفاف الجزئي المجالات الخرز الصغير في علبة غربال الأعلى ووضع الغطاء على الدرج العلوي. قم بتشغيل النخل الخشنة لمقدار 8 إلى 10 تكرار في غرامة لمدة 8 إلى 10 دقائق.
ملاحظة: قد تحتاج مرات غربال أن تزيد أو تنقص حسب الدفعة. - إزالة لوحات غربال واحداً تلو الآخر ووضعها رأسا على عقب على ورقة كبيرة تزن بعناية. اضغط على الجانبين برفق للتأكد من أن معظم مجالات قد انخفضت من المنخل وعلى الورقة.
- تجاهل المجالات ذات الحجم الكبير (> 106 ميكرومتر) ومجالات الأصغر (< ميكرومتر 53). إضافة المجالات التي هي في حدود حجم ميكرون 53 إلى 106 إلى أنبوب الطرد مركزي مسمى مع عدد دفعة ونوع ثم ضعه في ثلاجة-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
2-ميكروسفيري مراقبة جودة التقييمات
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- إجراء تقييم العيانية والبصرية للتأكد أن الجزئي المجالات الخرز الصغير موحدة والكروية، مع لا من المجاميع الحالية.
- تقييم الجزئي المجالات الخرز الصغير باستخدام مسح الإلكترون صورة مجهرية (SEM).
- لهذا، مكان الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى وزارة شؤون المرأة تشاك وتفل معطف مع البلاديوم الذهب في أجواء الأرجون استخدام المغطى الرش لسمك 4 نانومتر.
- ملاحظة السمات السطحية ومورفولوجيا وأقطار الجزئي المجالات الخرز الصغير باستخدام 10 كيلوفولت التعجيل بمسافة عمل 10 ملم والجهد لضمان أن الإنتاج والنخل للجزئي المجالات الخرز الصغير كان ناجحاً.
3-إنشاء خيوط للطباعة ثلاثية الأبعاد
- قياس وتسجيل كتلة الجزئي المجالات الخرز الصغير التي تم الحصول عليها من الخطوات 2 و 3؛ ويلزم على الأقل 25 غراما.
- إضافة مسحوق polycaprolactone (PCL) إلى الجزئي المجالات الخرز الصغير لنسبة 1:4 وزن الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى PCL.
- مزيج مسحوق الخليط في خلاط مصغرة متداول 20 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ثم الوجه الحاوية ومزيج 20 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق إضافية (انظر الشكل 2).
- العديد من اكستروديرس المتوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) قد سترات عازلة لأن الحرارة العامل المقصود بهم خيوط النمذجة (FDM) ترسب تنصهر التقليدية. تعديل في الطارد (إذا لزم الأمر) عن طريق إزالة المواد العازلة واستخدامه في تركيبة مع المشجعين سطح المكتب (التي تهب الهواء المحيط على الطارد وخيوط مقذوف) لاستخدام الطارد عند درجات حرارة منخفضة.
ملاحظة: مراوح سطح المكتب التي تهب الهواء المحيط لتبريد الطارد وخيوط مفيدة لهذا الإجراء. - إعداد إعداد معدات البثق. انظر الشكل 3.
- الإعداد الطارد حيث يكون لها منفذ ~ 60 سم من المدخل للتخزين المؤقت، مع مسار مباشر من مخرج النتوء إلى مدخل المخزن المؤقت.
ملاحظة: التخزين المؤقت يمكن اختيارياً يمكن رفع 3-4 بوصة من على مقاعد البدلاء إذا ما تبين أن الشعيرة هي تدلي إلى النقطة لمس في benchtop. - ضع مروحة سطح مكتب ~ 15 سم من سترة التدفئة وتوجيهها صوب سترة التدفئة توفر التبريد مع الهواء المحيط في جميع أنحاء الإنتاج الشعيرة. ضع مروحة تبريد ثانية في منتصف الطريق تقريبا بين الطارد والتخزين المؤقت وتوجيهها صوب اكستروداتي للمساعدة في التبريد خيوط مع الهواء المحيط.
- ضبط الموضع كما هو مطلوب في جميع مراحل العملية.
- الإعداد الطارد حيث يكون لها منفذ ~ 60 سم من المدخل للتخزين المؤقت، مع مسار مباشر من مخرج النتوء إلى مدخل المخزن المؤقت.
- تعيين الطارد تعديل تدفئة العنصر إلى 52 درجة مئوية، وتشغيل سطح المكتب مراوح التبريد، وتسمح هذه الوسيلة للتوصل إلى التوازن لضمان أن فوهة المناسبة يتم إرفاقه الطارد كحد أدنى 20 إلى 30.
- فقط قبل بداية، ملء هوبر الطارد مع خليط ميكروسفيري/PCL من الخطوة 3، 3. تشغيل التخزين المؤقت ومثقب الطارد الشروع في البثق للشعيرة.
- عندما هو مقذوف الشعيرة الأولى، يدوياً سحب اكستروداتي من مخرج البثق بالملقط وتغذية للتخزين المؤقت الشعيرة.
- خيوط المطلوب سوف يستغرق بعض الوقت للخروج من التخزين المؤقت. استخدام البكرات منفصلة أو الشريط، الاحتفال بوضوح عندما يظهر تكوين خيوط بصريا موحد.
- رصد العملية عن كثب وتعديل المعلمات حسب الضرورة. ضبط درجة الحرارة الطارد، سرعة مثقب البثق وسرعة التخزين المؤقت للحصول على خيوط قطرها 1.75 مم مقاسا بالفرجار. ضبط الجماهير حسب الحاجة لتهدئة الشعيرة بشكل صحيح لتجنب المقاطع العرضية خيوط غير دائرية. خلط وتعبئة هوبر حسب الضرورة.
ملاحظة: مطلوب الاهتمام الوثيق خلال هذه العملية للحصول على خيوط كافية للطباعة 3D اللاحقة. سيتم تغيير المعلمات أعلاه تبعاً للظروف المحيطة، ومستوى التعبئة وتوحيد المخلوط في هوبر، وديناميات الديناميكا الحرارية وتدفق من دفعات محددة PCL والجزئي المجالات الخرز الصغير. - مواصلة البثق حتى قد استخدمت كل من المسحوق وهوبر فارغ تقريبا. إضافة مسحوق PCL (دون الجزئي المجالات الخرز الصغير) إلى هوبر لطرد الخليط ميكروسفيري في الطارد الوقت الحالي. متابعة إضافة مسحوق PCL إلى هوبر حتى لا الجزئي المجالات الخرز الصغير أكثر مرئية في اكستروداتي.
- ومن المؤكد أن تسمية ومنفصلة الشعيرة التي تتضمن الجزئي المجالات الخرز الصغير في تركيز المطلوب، كبعد أن يتم تبريده خيوط أصعب لتمييز خيوط موحدة من خيوط غير موحدة.
- مواصلة البثق حتى يكون هناك مسحوق أدنى اليسار في هوبر، ثم إيقاف تشغيل التخزين المؤقت, أوجير الطارد، الطارد والتدفئة، والمشجعين.
4-الطباعة مع الشعيرة
- تصميم هندسة الشكل المطلوب والنموذج باستخدام برنامج تصميم الحاسوب. ثم شريحة الطراز وإملاء toolpath استخدام البرمجيات تشريح متوافق مع 3D آلة الطباعة المستخدمة.
- تحميل خيوط من الخطوة 3 إلى أي طابعة FDM القياسية، مزودة بفوهات قياسية للقطر المطلوب (عادة 0.4 مم). تبدأ الطباعة (عادة في سرعة خطي 65-70 درجة مئوية و 300 ملم/دقيقة) كما الشعيرة المخصصة المودعة-قبل-طبقة طبقة بالجهاز.
- تأكد من تولي اهتماما خاصا للطبقة الأولى وضبط الإعدادات حسب الحاجة للحصول على نوعية جيدة من الطباعة.
ملاحظة: يجوز إجراء تعديلات على سرعة الطباعة وطباعة درجة الحرارة ودرجة حرارة منصة، مضاعف البثق والمعلمات الأخرى. الرجوع إلى الطابعة ودليل الشركة المصنعة تشريح استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على مزيد من المساعدة.
5-مراقبة جودة التقييم
- وضع بنيات المطبوعة في SEM كوكس وتفل معطف مع البلاديوم الذهب في أجواء الأرجون استخدام المغطى الرش لسمك 4 نانومتر.
- مراقبة تحت المجهر باستخدام 10 كيلوفولت التعجيل بالجهد ومسافة عمل 10 ملم للتحقق من السمات السطحية ووجود أو غياب الجزئي المجالات الخرز الصغير إذا كان ذلك ممكناً.
6-وظيفية اختبار من بنيات المطبوعة
ملاحظة: يمكن استخدام الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) كبديل لمصفوفة ديسيلولاريزيد لتحديد ما إذا كانت مغلفة البروتينات النشيطة بيولوجيا بعد عملية إنتاج خيوط. ويستخدم حزب العمال الأسترالي نظراً لأنه يحفز رد فعل من الركازة، فوسفات نيتروفينيل ف، أن تغير من عديم اللون إلى مشتقات الأصفر، فنيتروفينول والفوسفات غير العضوي، ولكن فقط إذا كان الب في تكيف وظيفي.
- طباعة هندسة (n = 3) الذي يحتوي على كتلة نهاية على الأقل 400 ملغ مع خيوط ميكروسفيري الب (PCL-الب/جيش التحرير الشعبي الصيني) باستخدام معلمات طباعة متطابقة السقالات PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني. أيضا طباعة PCL-فقط (السقالات PCL(-)) للهندسة نفسه السقالات PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-الب. تغرق بها في المخزن المؤقت تريس-HCl 1 مل واحتضانها ح 24 في تناوب 37 درجة مئوية و 110 دورة في الدقيقة للسماح بنشر الإنزيم.
- أضف 1 مل من 1 ملغ/مل فنيتروفينيل فوسفات وثنائي سداسي هيدرات في تريس-HCl. إينكوباتي في 37 درجة مئوية، في الدقيقة 110 ل h. 10 إضافية قراءة امتصاص طافية في 415 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد النخل، ينبغي أن تظهر موحدة الجزئي المجالات الخرز الصغير وتكون خالية من المجاميع. تحت وزارة شؤون المرأة، ينخل الجزئي المجالات الخرز الصغير قد المسام الصغيرة على سطحها، ولكن خلاف ذلك تكون كروية والسلس، كما هو مبين في الشكل 1. ينبغي أن تكون جميع خيوط مقذوف قطرها موحد وشريحة دائرية. خيوط تحتوي على الجزئي المجالات الخرز الصغير (PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني) سوف يكون ماتي أكثر قليلاً الانتهاء بينما PCL فقط (خيوط PCL(-)) تبدو أكثر لامعة. كما سيشعرون بخشونة لمسة من خيوط PCL(-) خيوط PCL-مارك ألماني/جيش التحرير الشعبي الصيني. يجب طباعة السقالات في الهندسة المطلوبة التي تمليها البرامج الموجودة في الخطوة 4، 1. ينبغي أن تكون نوعية سقالة والشكل قابل للتكرار وموحدة من طباعة واحد إلى آخر. بعد الطباعة، سيكون من الصعب التمييز بين الميكروسكوب السقالات ودون الجزئي المجالات الخرز الصغير، ولكن الجزئي المجالات الخرز الصغير تحت وزارة شؤون المرأة، يجب أن تكون مرئية على السطح وفي جميع أنحاء بنيات. تحت وزارة شؤون المرأة، سوف تظهر خيوط PCL(-) على نحو سلس، مع بعض التصدعات كقطعة أثرية من عملية البثق (الشكل 4ب). الجزئي المجالات الخرز الصغير يجب أن تكون مرئية كلا بارزة من خلال وتحت السطح من السقالات PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني (انظر الشكل 4ج). عند استخدام الب كبديل لمارك ألماني، ينبغي الإبقاء على وظيفة الإنزيم داخل السقالة مع امتصاص أعلى بكثير (t-اختبار، ف < 0.05) في 415 نانومتر من تلك التي PCL(-) فارغة السقالات، 0.297 ± 0.023 و 0.166 ± 0.012، على التوالي، الرقم 5.
الشكل 1 . الممثل العيانية (يسار) وصور الجزئي المجالات الخرز الصغير بعد التحضير والنخل (يمين) ووزارة شؤون المرأة 2-ملاحظة أن الجزئي المجالات الخرز الصغير كروية وفي نطاق الحجم المناسب (القطر ميكرومتر 53-106). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مخصص خلاط المتداول. يتم استخدام خلاط المتداول مصنوعة خصيصا للجمع بين الجزئي في المجالات الخرز الصغير مع مسحوق PCL. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . إعداد الإنتاج الشعيرة. يتم تعيين مخرج الطارد حوالي 60 سم من المدخل للتخزين المؤقت. مراوح سطح المكتب تقع قرب عنصر التدفئة وحوالي نصف الطريق بين الطارد والتخزين المؤقت. بشكل اختياري يمكن التخزين المؤقت مرتفعة 3-4 بوصة أعلاه benchtop. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تقييمات الجودة- (أ) PCL(-) (على اليسار) وجيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني/PCL السقالات (يمين) صعوبة التمييز بين الميكروسكوب. (ب) "تحت وزارة شؤون المرأة"، سقالة PCL(-) يظهر معظمها على نحو سلس، مع بعض التصدعات كالقطع الأثرية من عملية الطباعة. (ج) "تحت وزارة شؤون المرأة"، الجزئي المجالات الخرز الصغير مرئية في عينات PCL-مارك ألماني/جيش التحرير الشعبي الصيني. وترد بعض الجزئي المجالات الخرز الصغير استخدام الأسهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . نتائج الممثل مقايسة اللونية الب. امتصاص المحتوية على الب السقالات (PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-الب) أعلى كثيرا من PCL فقط (السقالات PCL(-))، تشير إلى أن الإنزيم الب حفزت رد فعل من الفوسفات عديم اللون فنيتروفينيل فنيتروفينول وغير العضوية الفوسفات. وهذا يدل على أن القدرة على طباعة البروتينات الوظيفية مع العملية الموصوفة في هذه المخطوطة. * إلى حد كبير مختلفة (ف < 0.05) من جميع الفئات الأخرى. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كلا ديسيلولاريزيد المصفوفات وأظهرت 3D السقالات PCL المطبوعة بشكل مستقل للسماح بإصلاح التصاق وتكاثر الخلايا، والتحقق من استخدامها ل osteochondral10،،من1112. استخدام مصفوفة ديسيلولاريزيد في النهج الهندسية لإصلاح الأنسجة كان موضوعا للكثير من الاهتمام والنجاح في2،3،،من1415الأخيرة. وقد لاحظنا سابقا زيادة الهجرة والالتصاق والانتشار والصيانة الشاملة للأنسجة الناتجة عند مقارنتها بالتقنيات التقليدية2،،من1516،17 ،18. كثير نسبت هذه النتائج المرجوة في عملية دينامية المعاملة بالمثل من خلالها الخلايا المضيفة تلقي العظة من مصفوفة ديسيلولاريزيد والاستجابة بشكل حيوي، وتكرار العظة للخلايا الجديدة بوضع مصفوفة خارج الخلية أكثر أن عادة ما يشبه ما هو بالفعل هذا19،20،،من2122. في حين أن هذا قد تم درس للعديد من التطبيقات، العديد من العمليات ليست سهلة للنسخ المتماثل ولا يمكن تكييفها لاستخدامات مختلفة، غير قادر على بنجاح إنشاء بنيات عالية خاصة بالمريض، غير قادر على إنشاء مجمع مورفولوجيس، وقادر على تحمل قوات في فيفو 2،3،4،،من1314،،من1516.
ويتجنب النهج المبتكرة المقترحة هنا كل عابر وطويلة التعرض لدرجات الحرارة العالية التي عادة ما تتطلبها 3D الطباعة عند استخدام التقليدية الميكانيكية المستندة إلى قذف FDM الطابعات مع سيارة حاملة جديدة. وعلاوة على ذلك، يساعد السيارة الناقل (جيش التحرير الشعبي الصيني الجزئي المجالات الخرز الصغير) على حماية مغلفة البيولوجية لفترة قصيرة نسبيا من الزمن فإنه يتعرض للحرارة ويوفر خياراً معاملة الكل في واحد لدوران سريع في عيادة2. الأساليب المقترحة هنا شرح كيفية إنشاء خيوط النشيطة بيولوجيا للطباعة 3D والسقالات عن طريق الطباعة 3D حيث هو خطوة حاسمة قذف خيوط وطباعة تلك خيوط عند درجات حرارة منخفضة (65 درجة مئوية). وتجلى قدرة البروتينات المغلفة تبقى وظيفية استخدام الب كبديل لمارك طوال العملية. حزب العمال الأسترالي واستخدمت كما يجب أن تكون الإنزيم في تكيف وظيفية محددة جداً أجل تحفيز رد فعل اللونية المقررة في هذا البروتوكول23. إذا لم يتم مقذوف خيوط مع إيلاء اهتمام دقيق للقطر، ودرجة الحرارة، وسرعة، أن التضحية بنشاط بيولوجي والأداة المساعدة للطباعة 3D.
في هذا البروتوكول، الجزئي المجالات الخرز الصغير تتضمن مصفوفات ديسيلواريزيد (جيش التحرير الشعبي الصيني مارك ألماني) مقذوف يشترك مع PCL جعل خيوط قابلة للطباعة 3D والسقالات المطبوعة 3D ل osteochondral إصلاح (PCL/جيش التحرير الشعبي الصيني-مارك ألماني). وكما ذكر في الخطوات البروتوكول، الرصد المستمر لعملية إنتاج خيوط ضروري للجودة العالية للشعيرة. يجب إجراء تعديلات لسرعة البثق وسرعة التخزين المؤقت ودرجة حرارة البثق حفاظا على قطر الشعيرة المطلوب (عادة 1.75 ملم). يؤكد وجود الجزئي المجالات الخرز الصغير في السقالات بتصوير وزارة شؤون المرأة والحفاظ على إنزيم وظيفة يتجلى مقايسة الفوسفاتيز قلوية. لاحظ أن هذا البروتوكول هو محدودة بكمية كبيرة من الجزئي المجالات الخرز الصغير المطلوبة للإنتاج والقرار أقل نسبيا من ترسب تنصهر النمذجة إلى طرائق أخرى للطباعة 3D. ومع ذلك، زيادة نشاط بيولوجي تقدما كبيرا. على الرغم من عدم تركيز هذا البروتوكول، ستركز الدراسات اللاحقة على أثر الجزئي المجالات الخرز الصغير في القوة الميكانيكية والهجرة الخلية والتمايز، والمزيد من الأوصاف للسقالات. وعموما، يسمح الأسلوب الموصوفة هنا مصفوفة ديسيلولاريزيد وغيرها من البروتينات التي سيتم طباعتها في درجات حرارة أقل من المسموح به سابقا وفي الحواجز الحمائية حرارياً للحفاظ على وظيفة والقوة الميكانيكية2، 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع جزئيا بمنحه من طب تقويم العظام المجتمع من أمريكا الشمالية (بوسنا) و "المعاهد الوطنية للصحة" منح نيبيب R21EB025378-01 (منحة بحثية الهندسة الحيوية الاستكشافية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
