Summary
このプロトコルでは、埋め込まれたポリ乳酸 (PLA) 微粒子構造組織構造 3 D プリントの脱行列 (DM) を含むポリカプロラクトン (PCL) フィラメントの生産について説明します。
Abstract
3 D バイオプリンティングは、生物学的活性は、目的のサイズと形状に対応するカスタムの足場の作成を目指しています。熱可塑性のバックボーンは生物学的製剤元の組織を再構成する彼らの移行・増殖・分化に至る前駆細胞に組成の手がかりを提供していますネイティブの組織に同じような機械的安定性を提供できる/臓器1,2。残念ながら、多くの 3 D 印刷対応 (ポリ乳酸 PLA など生体吸収性ポリマーが 210 ° C の温度で印刷またはより高い - 温度が生物学的製剤に有害であります。その一方で、ポリカプロラクトン (PCL)、ポリエステルの種類はセラミックバイオマテリアル、65 ° C の温度が穏やかな印刷 3 D の印刷可能な素材したがって、仮説その機能構造 PCL フィラメント内で印刷可能性がありますされ、その decellularized 細胞外マトリックス (DM) PLA に熱防護壁の内で含まれています。この作品は、軟骨修復仮説のテストのアプリケーションだった。など、豚軟骨は脱され 3 D 構造を介して溶融堆積モデリングを生成するフィラメントにポリカプロラクトン (PCL) で押し出された、ポリ酸の (PLA) 体微小球カプセル化します。マイクロスフィアの有無構成要素 (- PLA/PCL DM と PCL(-)、それぞれ) 表面の特徴の違いを評価しました。
Introduction
骨、軟骨、腱、靭帯再建など臨床応用の現在の組織工学的手法は、損傷した組織を修復するのに自動・同種移植片を使用します。これらの技術が実行されるごと定期的に「ゴールド スタンダード」として臨床実習では、まずドナー組織患者または死体の一致からを収穫し、欠陥サイト2にドナー組織を置いてします。ただし、これらの戦略は、ドナー サイト罹患率、ドナー サイト不足大きな欠損のリスクの感染目的のジオメトリに合わせて移植を見つけることの難しさによって制限されます。さらに、研究では、移植再建がネイティブの組織3と比較して機械的及び生物学的特性を減少したことを示しています。念頭に置いてこれらの考慮事項は、組織エンジニア生物学的活性はその欠陥寸法と形状を提供しながら十分に対応するために設計されたカスタム、複雑なジオメトリを生成する 3 つの次元 (3 D) バイオプリンティングになっている最近機械的性質の生物学的改造が完了するまで。
理想的には、3 D プリントされた足場が組み込まれた生物学的製剤の移行、増殖につながる細胞の周囲に生化学的な手がかりを提供して、ネイティブの組織の必要な機械的安定性を保持できるポリマー主鎖で構成されます。分化と組織生産2,5。残念ながら、生物学的コンポーネントを含むほとんどの構造はゲルや自動/移植再建の対象となる組織によって経験される体内の力に耐えるには弱すぎる、ポリマーで作られています。ポリ乳酸 (PLA) など他のポリマー市場、3 D 印刷と構造的に音が製作中に共同印刷する生物学的製剤の不可能 - 210 ° C 以上の温度で印刷されます。ポリカプロラクトン (PCL) は別 FDA クリア、生体吸収性ポリマー 3次元複雑な形態5,6 インプラント患者固有の製造でますます人気となっている低温 (65 ° C) で印刷をすることができます。 ,7,8,9。ただし、空気圧技術を使用してほとんどの bioprinters を使用すると、低温生物学的活動が無傷で残ることができる PCL を印刷することは不可能に。日には、新規印刷可能な生体材料への自動/同種これらのポリマーの統合を達成するのには。そのような材料がない場合は、組織再建に組織設計アプローチはそうではありません。したがって、PCL、PLA を組み合わせることを模索して脱同種行列 (DM) 複雑な組織を再構築することができる実行可能な構成要素を製造するために各材料の利点を活用します。このプロセスは、抵抗体内力と目的の組織の形成を誘導するコンス トラクターに添加剤の製造に対応するため熱安定性に必要な初期強度を提供します。
前述のハードルに対処する最近の試み、示した PCL フィラメント内押し出される熱防護 PLA 壁内脱軟骨の細胞外マトリックスをカプセル化することは不可能であるの能力を維持します。DM ホスト細胞2で周囲に影響を与える。これは組織再建のため臨床的に効果的なアプローチを求めて私たちを触発しています。現在の研究では、PLA、DM、PCL (PLA-DM/PCL) などのすべての 1 つの足場を構築するプラットフォーム技術を活用します。
私たちの目標は、最終的にそれらをさまざまなアプリケーションで使用する、ネイティブの組織をより正確に要約する提案された新しい立体組織自動製造を用いた同種移植の有用性と性を改善するためにです。
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Protocol
1. 取得と微粒子の前処理
- 微粒子カプセル化希望のマトリックス (PLA DM)2を生成します。
注意: マイクロスフィアが均一な大きさであることが不可欠です。このため、使用する前に、微小球をふるいは不可欠です。マトリックス decellularization とカプセル化は、以前の出版物2で詳述されているがプロセスの簡単な概要に従います。- まず、豚の後肢から軟骨プラグを収穫します。0.05% トリプシン/0.5 mm ナトリウム エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と洗浄のシリーズで軟骨を decellularize、ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) と 1.5% の過酢酸と 2.0% トリトン X-100 蒸留水洗浄で各 4 時間各ステップ2前後。
- Decellularized マトリックスをドレイン、それを凍結、凍結乾燥、挽く、ペプシン ソリューションに溶解します。次の解散、ジクロロ メタンに溶解している PLA とペプシン ソリューションをミックスします。
- 3% ポリビニル アルコール水溶液中に滴下し、混合物を追加します。結果は、マイクロスフィア、リンス、ドレイン、遠心し、再び凍乾します。
注: プロセスの完全な詳細は、以前に公開されたプロトコル2を参照してください。
- マイクロスフィアをふるい。
- すべてふるい板徹底的に掃除されている、使用する前に乾燥していることを確認します。必要に応じて、きれいなふるいふるいからすべての球が削除されていることを確認する超音波クリーナーを使用します。
- 106 μ m ふるいトレイを上部、下部にパンして、ふるい後 53 μ m トレイ フルイ振とう機を組み立てます。
- 最上位のふるいトレイ内乾燥微粒子を置き、一番上のトレイに蓋を配置します。8 を 10 分繰り返す 8 〜 10 分のための罰金の粗い篩を入れます。
注: ふるい回増加またはバッチによって減少する必要があります。 - 慎重にふるいプレート 1 つずつを取り、大きな重量を量る紙に逆さまに置きます。優しくふるいから、紙の上に、球のほとんどが下落していることを確認するために側面をタップします。
- 特大球を破棄 (> 106 μ m) と小柄な球 (< 53 μ m)。球型とバッチ番号をラベル付き遠心管に 53 に 106 μ m サイズの範囲内にあるし、さらに使用するまで-20 ° C のフリーザーの場所を追加します。
2. 微小球の品質管理評価
注: は、図 1を参照してください。
- マイクロスフィアが均一で球状、集計がないことを確認する/ビジュアル巨視的評価を実行します。
- 走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して微粒子を評価します。
- このため、SEM には場所、マイクロスフィアはチャックし、4 の厚さにスパッタ コーターを用いたアルゴン雰囲気中の金パラジウム コートをスパッタ nm。
- 表面の機能、形態、および 10 を使用して微粒子の直径を確認生産とマイクロスフィアのふるい分けを確保するため kV 加速電圧と 10 mm のワーキングディ スタンスが成功しました。
3. フィラメント 3 D プリントの作成
- 測定し、記録手順 2 および 3; から得られた微小球の質量少なくとも 25 g が必要です。
- PCL を微小球の重量比率が 1:4 の微粒子にポリカプロラクトン (PCL) の粉末を追加します。
- 20 rpm で 5 分間ミニチュア ローリング ミキサーの混合粉末をミックスし、コンテナーを反転し、さらに 5 分間 20 rpm でミックス (図 2参照)。
- 多くの市販押出機 (材料の表を参照) がある目的の作業温度は、従来の溶融堆積モデリング (FDM) フィラメント絶縁ジャケット。断熱材を削除することで (必要に応じて) 押出機を変更し、低温押出機を使用する (これは押出機や押出成形のフィラメントに周囲の空気を吹き飛ばす) デスクトップのファンとの組み合わせで使用します。
注: クールな押出機とフィラメントに周囲の空気を吹き飛ばすデスクトップのファンは、この手順に役立ちます。 - 押出機器のセットアップをセットアップします。図 3を参照してください。
- コンセントはスプーラー入口への押出コンセントから直接パスし、スプーラーは入口から ~ 60 cm、押出機をセットアップします。
注: スプーラー必要に応じても、発生ベンチから 3 から 4 インチ ベンチトップに触れることのポイントにフィラメントが垂れ下がっていることが判明した場合。 - デスクトップのファン加熱ジャケットから 〜 15 cm を置き、フィラメント製造を通じて周囲の空気と冷却を提供する加熱ジャケットに向かってそれを指示します。2 番目の冷却ファンを押出機およびスプーラーのほぼ中間に配置し、周囲の空気とフィラメントを冷却を支援する押し出しに向かってそれを指示します。
- プロセス全体で必要なように、位置を調整します。
- コンセントはスプーラー入口への押出コンセントから直接パスし、スプーラーは入口から ~ 60 cm、押出機をセットアップします。
- 設定変更された押出機 52 ° c の発熱、冷却ファン、デスクトップをオンに、20 ~ 30 分ほどを確認、適切なノズルを押出機に添付の平衡に来て楽器を許可します。
- 初めの直前にステップ 3.3 から微小球/PCL の混合物で押出機ホッパーを埋めます。フィラメントの押し出しを開始するスプーラーと押出機のオーガーを入れます。
- 初期のフィラメントを押し出し、時手動で鉗子で押出コンセントから押し出しを引き、フィラメント スプーラーにフィードします。
- 必要なフィラメント スプーラーから出てくるいくつかの時間がかかります。別のスプールまたはテープを使用して、フィラメント構成は視覚的に統一表示されたら明確にマークを付けます。
- 密接にプロセスを監視し、必要に応じてパラメーターを変更します。押出温度、押し出しオージェ速度、およびスプーラー ノギスで測定した 1.75 mm 径フィラメントを取得する速度を調整します。フィラメント非円形断面を避けるため適切にフィラメントを冷却するためにファンを調整します。ミックスし、必要に応じてホッパーを補充します。
注: 以降の 3 D プリントのための十分なフィラメントを取得するこのプロセス中に細心の注意が必要です。上記のパラメーターは、周囲の条件、充填レベルと、ホッパーの混合物の均一性と PCL と微小球の特定のバッチの熱力学とダイナミクスに応じて変化します。 - 全ての粉末が使用されており、ホッパーはほぼ空までの押し出しを続行します。押出機は現在、微粒子混合物を洗い流すホッパー (微粒子) なし PCL 粉末を追加します。ないより多くの微粒子が押し出しで表示されるまで、ホッパーに PCL パウダーを追加していきます。
- ラベルを必ず、別フィラメント フィラメントはそれを冷却後として所望の濃度で微粒子を含む不均一フィラメントから制服のフィラメントを区別するために困難です。
- 押し出し、ホッパーに最小限の粉末があるまで継続し、スプーラー、オージェ押出機や押出機の発熱、ファンをオフにします。
4. フィラメントと印刷
- 幾何形状とコンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、フォームをデザインします。モデルをスライスし、使用されている 3 D 印刷機と互換性のあるスライスのソフトウェアを使用してツールパスを指示します。
- 希望の直径 (通常 0.4 mm) の標準ノズル装備標準 FDM プリンターにステップ 3 からフィラメントをロードします。カスタムのフィラメントはマシンで層状に堆積した (通常は 65 ~ 70 ° C、300 mm/分の線形速度) で印刷を開始します。
- 最初の層に特別な注意を払うし、良い品質のプリントを取得するために必要に応じて設定を調整してください。
注: 印刷速度、印刷温度、プラットフォーム温度、押出、乗数、他のパラメーターに調整ができます。プリンターとスライスの製造元の詳細については、トラブルシューティング ガイドを参照してください。
5. 品質管理評価
- SEM チャックに印刷された構成要素を配置し、4 の厚さにスパッタ コーターを用いたアルゴン雰囲気中の金パラジウム コートをスパッタ nm。
- 10 を使用して顕微鏡下で観察表面機能をチェックする kV 加速電圧と 10 mm の作動距離と該当する場合は、マイクロスフィアの有無。
6 印刷構成の機能テスト
注: アルカリフォスファターゼ (ALP) は脱マトリックスのための代理としてカプセル化された蛋白質がフィラメントの生産過程後生理活性であるかどうかを使用できます。ALP は、無色から黄色の副産物、p-ニトロフェノールと無機リン酸塩に変更する基板、p-ニトロフェニル リン酸からの反応を触媒するので、ALP が機能的な構造の場合にのみ使用されます。
- ジオメトリを印刷 (n = 3) ALP 微小球フィラメント (PLA-アルプ/PCL) - PLA/PCL DM 足場として同一の印刷パラメーターを使用して、少なくとも 400 mg の端に集中質量があります。PCL 印刷も-だけ (ALP PLA/PCL 足場と同じジオメトリの PCL(-)) 足場。1 mL トリス塩酸バッファーにそれらを沈めるし、酵素の拡散を許可する 37 ° C および 110 rpm 回転で 24 時間インキュベートします。
- 1 mg/mL p-ニトロフェニル リン酸トリスの二ナトリウム水和物の 1 つの mL を追加-塩酸 37 ° C、415 で上清の吸光度を読み取り追加 10 h 110 rpm で加温 nm。
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Representative Results
ふるい分けの微粒子が均一表示され集計から自由であります。Sem では、ふるわれた微粒子の表面に小さな孔がありますが、そうでなければ球形で滑らかな、図 1に示すように。すべて押し出しフィラメントは均一直径の円形断面にする必要があります。微粒子 (PLA-DM/PCL) が含まれているフィラメントは少しマット PCL 専用ながら仕上げを持っている (PCL(-)) フィラメントより光沢のあるになります。PLA/PCL DM フィラメントも PCL(-) フィラメントより粗いタッチに感じると思います。足場は、4.1 の手順でソフトウェアによって決定された目的のジオメトリで印刷すべき。足場の品質と形状再現性と別に 1 つの印刷から均一にする必要があります。印刷した後、マイクロスフィアと足場が肉眼的に区別するために困難になりますが、sem では、微粒子が表面および構造の全体で目に見えるする必要があります。Sem では、PCL(-) のフィラメントが滑らかさ、押出成形プロセス (図 4B) の成果物としていくつかの縞表示されます。微粒子を可視にする必要があります (図 4C参照) - PLA/PCL DM 足場の表面の下で、両方の突出します。足場内酵素の機能が有意に高い吸光度が維持されるべき代理として DM の ALP を使用する場合 (t-テスト、p < 0.05) 415 で空白の PCL(-) のそれらより nm 骨格、0.297 ± 0.023 と 0.166 ± 0.012それぞれ、図 5。
図 1.代表的な巨視的 (左) と準備とふるい後微粒子の SEM (右) の画像2。 マイクロスフィアが球状、適切なサイズの範囲 (53 106 μ m 径) であるに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.カスタムには、ローリング ミキサーが作られました。PCL 粉末とマイクロスフィアを組み合わせるため特注ローリング ミキサーを使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.フィラメント生産セットアップします。押出機のコンセントは、スプーラーの入口から約 60 cm を設定されています。デスクトップのファンは、発熱と押出機とスプーラーの約半分の方法の近くにあります。スプーラーでは、ベンチトップの上高架の 3-4 インチすることもできます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.品質評価します。(A) PCL(-) (左) と - PLA/PCL DM (右) 足場は肉眼的に区別するために困難です。(B)下 SEM PCL(-) 足場滑らかに見える主、印刷プロセスの成果物として、いくつかの縞を持つ。(C)下 SEM、微粒子が-PLA/PCL DM サンプルに表示されます。マイクロスフィアのいくつかは、矢印を使用して示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.ALP 比色試金の典型的な結果。ALP を含む足場 (PLA-アルプ/PCL) の吸光度は PCL 専用のそれよりも有意に高かった (PCL(-)) 足場、ALP 酵素触媒 p-ニトロフェノール ・無機無色 p-ニトロフェニル リン酸からの反応であることを示すリン酸。これはこの原稿で説明されているプロセスと機能性タンパク質を印刷する機能を示します。* 著しく異なる (p < 0.05) 他のすべてのグループから。エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
両方脱行列、3 D 印刷 PCL 足場は、接着・増殖細胞、軟骨の彼らの使用を検証の修復10、11,12を許可するない示されている独立。脱マトリックス組織修復するエンジニア リング手法の使用は、被写体の多くの関心と最近の2,3,14,15過去の成功をされています。我々 は以前、移行、接着、増殖、結果組織伝統的なテクニック2,15,16,17と比較した場合の全体的なメンテナンスを指摘しています。 ,18。多くは宿主細胞が decellularized のマトリックスからの手がかり受け取る動的相互作用のプロセスにこれらの望ましい結果を帰因させるが、動的応答し、より細胞外マトリックスを置くことによって新しい細胞の手がかりを複製通常現在19,20,21,22に既にあるものと似ています。これは多くのアプリケーションを検討されている、プロセスの多くを複製する簡単ではないし、高い患者固有の構造、複雑な形態を作成できません。 を正常に作成できません。、できません。、さまざまな用途に適応することはできません。耐えられる生体内で強制的に2,3,4,13,14,,1516。
ここに提案する革新的なアプローチは、キャリア新車で伝統的な機械的押し出しベース FDM のプリンターを使用する場合、3 D プリントで通常必要な高温過渡および長期暴露の影響を回避できます。また、運搬 (PLA 微小球) を支援保護する、カプセル化された生物学的時間の比較的短い期間の熱にさらされ、クリニック2で高速回転のためのオール ・ イン ・ ワンの治療オプションを提供しています。ここに提案する方法では、低温 (65 ° C) 3 D 印刷・ 3 D 印刷の重要なステップがフィラメントの押出およびこれらのフィラメントの印刷を介して足場用の生物学的活性のフィラメントを作成する方法を示します。プロセス全体で DM の代理としての高峰を使用してカプセル化されたタンパク質の機能を維持するための能力を示した。ALP は、酵素はこのプロトコル23で評価した比色反応を触媒するために非常に特定の機能構造である必要がありますように使用されました。フィラメントは直径・温度・速度に細心の注意と押し出されない、生物学的活性と 3 D プリントのためのユーティリティが崩れてしまいます。
このプロトコルではミクロスフィア decelluarized 行列 (PLA DM) された 3 D 印刷用フィラメントに PCL による共押と軟骨の 3 D 印刷足場を修復 (PLA-DM/PCL)。プロトコルの手順で述べたように、フィラメント製造プロセスの継続的な監視、フィラメントの高品質のため不可欠です。必要なフィラメント径 (通常 1.75 mm) を維持するために押出速度、スプーラーの速度、および押出温度に調整を行う必要があります。足場における微粒子の存在が確認されたアルカリフォスファターゼ法による SEM 画像と酵素のメンテナンス機能のデモです。このプロトコルは、大量生産と他の 3 D 印刷の様相にモデリング熱溶解積層の比較的低解像度のために必要な微小球のによって制限されることに注意してください。しかし、生物学的活動の増加は大きな進歩です。このプロトコルのフォーカスではない、その後の研究は機械的強度、細胞遊走、分化、微粒子の影響、さらに足場の特性に集中します。全体的にみて、記載方法により脱行列と以前の許容量を超えると熱保護障壁関数と機械的強度2を維持するために低温で印刷する他のタンパク質 3。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトから、小児整形外科学会の北アメリカ (POSNA) の補助金によって資金が供給された部分的にし健康の国民の協会は NIBIB R21EB025378-01 (探索的バイオ エンジニア リング研究助成) を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
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