Summary
Este protocolo describe la producción de filamento de policaprolactona (PCL) con microesferas de ácido (PLA) de poliláctico incrustados que contienen matrices decellularized (DM) para la impresión 3D de ingeniería construcciones de tejidos estructurales.
Abstract
Bioprinting 3D pretende crear andamios personalizados que son biológicamente activos y acomodar el tamaño y la geometría. Una red troncal de termoplástica puede proporcionar estabilidad mecánica similar al tejido nativo mientras que agentes biológicos ofrecen composición señales a las células progenitoras, llevando a su migración, proliferación y diferenciación para reconstituir los tejidos originales / órganos1,2. Desafortunadamente, muchos compatible con impresión 3D, polímeros bioabsorbibles (como el ácido poliláctico, PLA) son impresos en las temperaturas de 210 ° C o superior - temperaturas que son perjudiciales para los productos biológicos. Por otro lado, la policaprolactona (PCL), un tipo diferente de poliester, es un biorreabsorbibles, 3D material imprimible que tiene una temperatura más suave de impresión de 65 ° C. Por lo tanto, se planteó la hipótesis eso matriz extracelular decellularized (DM) contenida dentro de una barrera térmica protectora del PLA puede ser impreso en filamento PCL y permanecer en su conformación funcional. En este trabajo, osteocondrales reparación fue la aplicación para que la hipótesis fue probada. Como tal, cartílago porcino era decellularized y encapsulado en microesferas ácidas sobre poliláctico (PLA) que luego fueron sacadas con policaprolactona (PCL) en filamento para producir construcciones 3D mediante fundido deposición modelado. Las construcciones con o sin las microesferas (PLA-DM/PCL y PCL(-), respectivamente) se evaluaron las diferencias en características superficiales.
Introduction
Actuales técnicas de ingeniería de tejidos para aplicaciones clínicas como la reconstrucción de hueso, cartílago, tendón y ligamento usan auto y aloinjertos para reparar el tejido dañado. Cada una de estas técnicas se realiza habitualmente como un "gold standard" en la práctica clínica primera cosecha el tejido donante de la paciente o de un partido cadavérico, y luego colocando el tejido del donante en el sitio de defecto2. Sin embargo, estas estrategias están limitadas por la morbosidad del sitio donante, escasez de sitio donante para defectos grandes, riesgo de infección y dificultad para encontrar los injertos que coincidan con la geometría deseada. Además, estudios han demostrado que los aloinjertos utilizados para la reconstrucción han reducido propiedades mecánicas y biológicas cuando se compara con tejido propio3. Con estas consideraciones en mente, los ingenieros de tejidos recientemente han recurrido a tres dimensiones (3D) bioprinting para producir geometrías personalizadas y complejas que son biológicamente activos y diseñados para acomodar el tamaño del defecto y la forma mientras que proporciona suficiente propiedades mecánicas hasta remodelación biológica es completa.
Idealmente, un andamio 3D impreso consistiría en una estructura polimérica que puede conservar la estabilidad mecánica necesaria del tejido nativo mientras que los productos biológicos incorporados ofrecen señales bioquímicas para que rodea las células, conduciendo a su migración, proliferación, la diferenciación y producción de tejido2,5. Por desgracia, más construcciones que contienen componentes biológicos se hacen con geles o polímeros que son demasiado débiles para resistir en vivo las fuerzas experimentadas por los tejidos específicos para la reconstrucción de auto/del allograft. Otros polímeros como el ácido poliláctico (PLA) son biorreabsorbibles, 3D imprimibles y estructuralmente sano, pero se imprimen en las temperaturas en o por encima de 210 ° C - lo que hace imposible para productos biológicos que co impresos durante la fabricación. Policaprolactona (PCL) es otro polímero biorreabsorbibles aprobados por la FDA, que puede ser impreso a baja temperatura (65 ° C), que se ha vuelto cada vez más popular en la fabricación de implantes específico para cada paciente con morfologías complejas5,6 3D ,7,8,9. Sin embargo, la mayoría bioprinters con tecnología neumática impiden impresión PCL a temperaturas más bajas, donde las actividades biológicas pueden permanecer ilesos. Hasta la fecha, la integración de estos polímeros con auto/allografts en un nuevo biomaterial para imprimir tiene que lograrse. En ausencia de tal material, un enfoque de ingeniería tisular verdadera reconstrucción de tejido es poco probable. Por lo tanto, hemos intentado combinar PLA, PCL y decellularized matrices de aloinjerto (DM) para utilizar las ventajas de cada material para la fabricación de una construcción viable capaces de reconstruir tejidos complejos. Este proceso daría la fuerza mecánica inicial necesaria para resistir las fuerzas de en vivo y la estabilidad térmica para fabricación aditiva en un constructo que induce la formación del tejido deseado.
En un reciente intento de abordar los obstáculos antes mencionados, nos demostró que es posible encapsular la matriz extracelular del cartílago decellularized dentro de una barrera térmica protectora de PLA que se puede sacar en filamentos PCL, mantener la capacidad de DM para influir en entorno host células2. Esto nos ha inspirado a buscar enfoques eficaces clínicamente para la reconstrucción del tejido. En el estudio actual, utilizamos la tecnología de plataforma para construir andamios de all-in-one que incluyen PLA, DM y PCL (PLA-DM/PCL).
Nuestro objetivo es mejorar la eficacia y la utilidad de aloinjertos mediante la técnica propuesta biofabrication novela recapitular con mayor precisión del tejido nativo, para finalmente usarlos en diferentes aplicaciones.
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Protocol
1. obtención y procesamiento de microesferas
- Producir microesferas con la matriz deseada encapsulado (PLA-DM)2.
Nota: Es imperativo que las microesferas son de tamaño uniforme. Por esta razón, el tamizado previo utilizar microesferas es esencial. Aunque encapsulado y descelularización de matriz han sido detallados en anteriores publicaciones2, sigue un breve resumen del proceso.- En primer lugar, la cosecha cartílago enchufes de porcinos extremidades traseras. Decellularize del cartílago en una serie de lavados con 0.05% tripsina/0,5 mm tetrasodium dihidratada del ácido (EDTA), Dulbecco de modificado de águila ácido peracético medio (DMEM) y 1.5% y 2.0% Tritón X-100 durante 4 h con lavados de agua destilada antes y después de cada paso2.
- Vaciar la matriz decellularized, congelarlo, liofilizar, triturar y disolver en solución de pepsina. Tras la disolución, mezclar la solución de pepsina con PLA que ha sido disuelta en diclorometano.
- Añadir gota a gota la mezcla en un alcohol de polivinilo de 3% en solución de agua. Centrífuga de la microesferas resultantes, enjuague, desagüe y liofilizar otra vez.
Nota: Para más detalles sobre el proceso de ver el protocolo publicado anteriormente2.
- Tamiz de las microesferas.
- Asegúrese de que todas las placas de tamiz ha limpiado completamente y estén secas antes de usar. Si es necesario, limpiar los tamices utilizando ultrasonidos limpiador para Asegúrese que todas las esferas del tamiz.
- Montar el tamiz vibratorio con la bandeja del tamiz μm 106 en la tapa, la bandeja de μm 53 después de y el tamiz de la bandeja en la parte inferior.
- Lugar seco microesferas en la bandeja del tamiz superior y coloque la tapa sobre la bandeja superior. Encienda el tamizado grueso de 8 a 10 minutos repetir a multa de 8 a 10 min.
Nota: Los tiempos de tamiz deba aumentar o disminuir dependiendo el lote. - Retire las placas de tamiz uno por uno con cuidado y colocarlos boca abajo sobre un papel de gran peso. Golpee los lados con cuidado para asegurarse de que la mayoría de las esferas ha caído fuera del tamiz y en el papel.
- Descartar las esferas de gran tamaño (> 106 μm) y esferas de tamaño insuficientes (< 53 μm). Agregar esferas que están en el rango de tamaño de 53 a 106 μm a un tubo de centrífuga etiquetados con el tipo y número de hornada y luego colocar en un congelador de-20 ° C hasta su uso posterior.
2. las evaluaciones de Control de calidad de la microesfera de
Nota: Vea la figura 1.
- Realizar evaluación macroscópica o visual para comprobar que las microesferas son uniforme y esférico, con los no agregados presentes.
- Evaluar las microesferas usando un micrográfo de electrón de barrido (SEM).
- Para ello, lugar de microesferas en un SEM chuck y sputter coat con oro paladio en atmósfera de argón con un recubridor sputter a un grosor de 4 nm.
- Observar características de superficies, morfología y diámetros de las microesferas con un 10 kV aceleración de voltaje y una distancia de trabajo de 10 mm para asegurar que la producción y el cribado de las microesferas fue exitosa.
3. filamento creación para impresión 3D
- Mida y anote la masa de las microesferas obtenidas de los pasos 2 y 3; se necesita al menos 25 g.
- Añadir polvo de policaprolactona (PCL) a las microesferas para una relación de 1:4 peso de microesferas a PCL.
- Mezclar la mezcla del polvo en un mezclador de balanceo de miniatura a 20 rpm por 5 min luego voltear el recipiente y mezclar en 20 rpm para un adicional 5 min (ver figura 2).
- Muchos extrusoras disponibles comercialmente (véase la Tabla de materiales) tienen chaquetas de aislamiento dado que sus temperaturas de trabajo previstas son filamentos de tradicional deposición fundida (FDM) de modelado. Modificar la extrusora (si es necesario) quitando el material aislante y utilizar en combinación con ventiladores de escritorio (que soplan el aire ambiente a la extrusión y extrusión filamento) para el uso de la extrusora a temperaturas más bajas.
Nota: Escritorio ventiladores que soplan aire ambiente para enfriar el estirador y el filamento son útiles para este procedimiento. - Configuración la configuración de equipos para extrusión. Vea la figura 3.
- Configuración de la extrusora para que su salida es ~ 60 cm de la entrada a la cola, con un camino directo desde la salida de la protuberancia a la entrada de cola de impresión.
Nota: La cola de impresión se puede opcionalmente levantar 3 a 4 pulgadas desde el banquillo si se encuentra que el filamento está cayendo hasta el punto de tocar la mesa. - Coloque un ventilador de escritorio ~ 15 cm de la camisa de calefacción y directo hacia la chaqueta de calentamiento para ofrecer refrigeración con aire ambiente a través de la producción del filamento. Colocar un segundo ventilador aproximadamente a medio camino entre la extrusora y la cola de impresión y dirigirlo hacia la extrusión para ayudar en el filamento con aire ambiente de enfriamiento.
- Ajuste la posición según sea necesario durante todo el proceso.
- Configuración de la extrusora para que su salida es ~ 60 cm de la entrada a la cola, con un camino directo desde la salida de la protuberancia a la entrada de cola de impresión.
- Establecer la extrusora modificada calefactor a 52 ° C, gire en el escritorio, ventiladores de refrigeración y que el instrumento llegar a equilibrio durante 20 a 30 minutos Asegúrese que la boquilla apropiada se une a la extrusora.
- Justo antes de empezar, llene la tolva de la extrusora con la mezcla de microesferas/PCL de paso 3.3. Abra la cola de impresión y el sinfín de extrusión para iniciar la extrusión de filamentos.
- Cuando se saca el filamento inicial, manualmente tire la extrusión de la toma de extrusión con pinzas y alimentar a la cola del filamento.
- El filamento deseado tomará algún tiempo para salir de la cola de impresión. Con bobinas separadas o cinta, marque claramente cuando la composición del filamento visualmente aparece uniforme.
- Seguir de cerca el proceso y modificar parámetros según sea necesario. Ajustar la temperatura de extrusión, extrusión taladro velocidad y velocidad de cola de impresión para obtener un filamento de diámetro 1,75 mm medida por pinzas. Ajustar los ventiladores según sea necesario para que se enfríe el filamento adecuadamente para evitar cortes transversales no circulares del filamento. Mezclar y rellenar la tolva según sea necesario.
Nota: La atención es necesaria durante este proceso para obtener el filamento adecuado para la posterior impresión 3D. Los parámetros anteriores cambiará dependiendo de las condiciones ambientales, el nivel de llenado y la uniformidad de la mezcla en la tolva y la dinámica termodinámica y flujo de lotes concretos de PCL y microesferas. - Siguen sacando hasta que todo el polvo se ha utilizado y la tolva está casi vacía. Añadir polvo PCL (sin microesferas) a la tolva para eliminar la mezcla de microesferas que se encuentra actualmente en la extrusora. Seguir añadiendo polvo PCL a la tolva de hasta no más microesferas son visibles en la extrusión.
- Asegúrese de etiquetar y separado el filamento que contiene microesferas en la concentración deseada, como después de que el filamento se enfría lo es más difícil distinguir el filamento uniforme de filamento no uniforme.
- Siguen sacando hasta que haya un mínimo polvo en la tolva a la izquierda, girar a la cola de impresión, barrena de extrusora, elemento de calefacción del estirador y fans.
4. impresión con el filamento
- Diseño de una geometría de la forma deseada y utilizando un software de diseño asistido por ordenador. Luego cortar el modelo y dictar la trayectoria utilizando el software de corte que es compatible con la impresora 3D que utiliza.
- Cargar el filamento del paso 3 en cualquier impresora estándar de la FDM, equipado con boquillas estándar del diámetro deseado (normalmente 0,4 mm). Comenzar la impresión (por lo general en los 65-70 ° C y 300 mm/min velocidad lineal) como el filamento personalizado es depositado capa por capa por la máquina.
- Asegúrese de prestar especial atención a la primera capa y ajustar la configuración según sea necesario para obtener una buena calidad de impresión.
Nota: Pueden hacerse ajustes a la velocidad de impresión, impresión temperatura, temperatura de plataforma, multiplicador de extrusión y otros parámetros. Consulte la impresora y guía de corte fabricante para obtener asistencia.
5. Control de calidad evaluación
- Coloque las construcciones impresas en tiradas de SEM y sputter coat con oro paladio en atmósfera de argón con un recubridor sputter a un grosor de 4 nm.
- Observar al microscopio utilizando un 10 kV aceleración de voltaje y una distancia de trabajo de 10 mm para verificar características de superficie y la presencia o ausencia de las microesferas si corresponde.
6. prueba funcional de las construcciones impresas
Nota: Fosfatasa alcalina (ALP) puede utilizarse como un sustituto para la matriz de decellularized para determinar si las proteínas encapsuladas son biológicamente activas tras el proceso de producción de filamentos. Fosfatasa alcalina se utiliza porque cataliza una reacción de un sustrato p-nitrofenil fosfato, que cambia de incoloro a amarillo subproductos, p-nitrofenol y fosfato inorgánico, pero sólo si es de ALP en la conformación funcional.
- Imprimir una geometría (n = 3) que tiene una masa final de al menos 400 mg con el filamento de la microesfera de la ALP (PLA-ALP/PCL) con idénticos parámetros de impresión como los andamios de PLA-DM/PCL. También impresión PCL-único (andamios PCL(-)) de la misma geometría como los andamios de PLA-ALP/PCL. Sumerja en 1 mL de tampón de Tris-HCl e incubar durante 24 h a 37 ° C y 110 rpm rotación para permitir la difusión de la enzima.
- Añadir 1 mL de 1 mg/mL p-nitrofenil fosfato, hexahidrato disódico en Tris-HCl. incubar a 37 ° C, 110 rpm para un adicional 10 h. leer la absorbancia del sobrenadante a 415 nm.
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Representative Results
Después de tamizado, microesferas deben aparecer uniforme y estar libre de agregados. Bajo SEM, las microesferas tamizadas pueden tener pequeños poros en su superficie, pero de lo contrario será esférica y lisa, como se muestra en la figura 1. Todos los filamentos extruidos deben ser de diámetro uniforme y de sección circular. Un filamento que contiene microesferas (PLA-DM/PCL) tendrá un poco más mate acabado mientras que sólo un PCL (filamento PCL(-)) sería más brillante. El filamento de PLA-DM/LCP también se sentiría más grueso al tacto que el filamento PCL(-). Los andamios se deben imprimir en la geometría deseada que fue dictada por el software en el paso 4.1. La forma y calidad del andamio deben ser repetible y uniforme de una impresión a otra. Después de la impresión, andamios con y sin microesferas será difíciles distinguir macroscópicamente, pero bajo SEM, microesferas deben ser visibles en la superficie y en las construcciones. Bajo SEM, PCL(-) filamento aparecerá liso, con algunas estrías como un artefacto del proceso de extrusión (figura 4B). Las microesferas deben ser visibles tanto que sobresalen a través y bajo la superficie de los andamios de PLA-DM/PCL (vea la figura 4C). Cuando use ALP como un sustituto para la DM, la funcionalidad de la enzima en el andamio debe mantenerse con absorción significativamente mayor (t-test, p < 0.05) a 415 nm que PCL(-) en blanco andamios, 0,297 ± 0.023 y 0.166 ± 0.012, respectivamente, figura 5.
Figura 1 . Representativa macroscópica (izquierda) e imágenes (derecha) SEM de microesferas después de la preparación y tamizado 2. observar que las microesferas son esféricos y en el rango de tamaño apropiado (53-106 μm de diámetro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Por encargo de mezclador de balanceo. El mezclador rodante a medida se utiliza para combinar las microesferas con polvo PCL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Instalación de producción de filamento. La salida de la extrusora se encuentra aproximadamente 60 cm de la entrada de la cola de impresión. Ventiladores de escritorio se encuentran cerca del elemento de calefacción y aproximadamente a medio camino entre la extrusora y la cola de impresión. La cola de impresión puede ser elevado de 3 a 4 pulgadas por encima de la mesa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Evaluaciones de calidad. (A) PCL(-) (izquierda) y andamios (derecha) PLA-DM/PCL son difíciles de distinguir a simple vista. (B) bajo SEM, el andamio de la PCL(-) sobre todo aparece liso, con algunas estrías como artefactos del proceso de impresión. (C) bajo SEM, las microesferas son visibles en las muestras de PLA-DM/PCL. Algunas de las microesferas se indican con flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Resultados representativos de un ensayo colorimétrico ALP. La absorbancia de andamios que contiene fosfatasa alcalina (ALP-PLA/PCL) es significativamente mayor que la de sólo el PCL (andamios PCL(-)), que indica que la enzima fosfatasa alcalina catalizada la reacción incolora de p-nitrofenil fosfato inorgánico y p-nitrofenol fosfato. Esto demuestra que la capacidad para imprimir de proteínas funcionales con el proceso descrito en este manuscrito. * significativamente diferente (p < 0.05) de todos los otros grupos. Barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Ambos decellularized matrices y 3D impreso PCL andamios han demostrado independientemente para permitir adherencia y proliferación de las células, validar su uso para osteocondral reparacion10,11,12. El uso de decellularized matriz de enfoques de ingeniería para la reparación de los tejidos ha sido un tema de gran interés y éxito en los últimos años2,3,14,15. Previamente hemos observado el aumento de la migración, adhesión, proliferación y mantenimiento general de los tejidos resultantes en comparación con las técnicas tradicionales de2,15,16,17 ,18. Muchos atribuyen estos resultados deseables para el proceso de reciprocidad dinámica a través del cual las células hospedadoras reciban señales de la matriz decellularized, dinámicamente responder y replicar las señales de nuevas células mediante el establecimiento de matriz extracelular más por lo general se asemeja a lo que ya es presente19,20,21,22. Mientras que esto ha sido estudiado para muchas aplicaciones, muchos de los procesos no son fáciles de replicar y no pueden ser adaptados para diferentes usos, no se puede crear con éxito construcciones altamente específico para cada paciente, no se puede crear morfologías complejas e incapaces de soportar en vivo las fuerzas2,3,4,13,14,15,16.
El enfoque innovador que se propone en este documento evita transitoria y prolongada exposición a altas temperaturas que se requieren típicamente por la impresión en 3D al utilizar tradicionales impresoras FDM mecánicas basado en la extrusión con un nuevo vehículo. Además, el vehículo del portador (microesferas PLA) ayuda a proteger el encapsulado biológica para el periodo de tiempo relativamente corto se expone al calor y proporciona una opción de tratamiento all-in-one para facturación rápida en la clínica2. Los métodos propuestos en este documento muestran cómo crear filamentos biológicamente activos para la impresión 3D y andamios por impresión 3D donde un paso crítico es la extrusión del filamento y la impresión de los filamentos a baja temperatura (65 ° C). La capacidad de las proteínas encapsuladas para permanecer funcional fue demostrada utilizando ALP como un sustituto para DM en todo el proceso. ALP se utilizó la enzima debe ser en una conformación funcional muy específica con el fin de catalizar la reacción colorimétrica en este protocolo23. Si el filamento no se saca con cuidado de diámetro, la temperatura y la velocidad, la actividad biológica y la utilidad de impresión 3D serían sacrificados.
En este protocolo, microesferas que contienen matrices decelluarized (PLA-DM) se co-extruidas con PCL de hacer 3D filamentos imprimibles y 3D andamios impresos para osteocondral reparación (PLA-DM/PCL). Como se menciona en los pasos del Protocolo, monitoreo continuo del proceso de producción de filamento es esencial para la alta calidad del filamento. Ajustes deben hacerse a velocidad de la protuberancia, la cola de impresión velocidad y temperatura de extrusión con el fin de mantener el diámetro del filamento deseada (normalmente 1,75 mm). Se confirma la presencia de las microesferas en las matrices de soporte de proyección de imagen de SEM y el mantenimiento de la enzima funcionalidad se demuestra por un análisis de fosfatasa alcalina. Tenga en cuenta que este protocolo está limitado por la gran cantidad de microesferas necesarias para la producción y la resolución relativamente baja de deposición fundida modelado a otras modalidades de impresión 3D. Sin embargo, el aumento de la actividad biológico es un gran avance. Aunque no es el objetivo de este protocolo, los estudios subsecuentes se concentrarán en el impacto de las microesferas en fuerza mecánica, migración celular y diferenciación y otras caracterizaciones de los andamios. En general, la técnica descrita permite matriz decellularized y otras proteínas que se imprimirán a temperaturas más bajas que anteriormente permitía y en barreras protectoras térmicamente para mantener la función y la fuerza mecánica2, 3.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue parcialmente financiado por una beca de la sociedad de Ortopedia Pediátrica de América del norte (POSNA) y los institutos nacionales de salud otorgar NIBIB R21EB025378-01 (beca de investigación de Bioingeniería exploratorio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
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