Summary
Bu iletişim kuralı ile yapısal doku mühendislik yapıları 3D baskı için decellularized matrisler (DM) içeren katıştırılmış polylactic asit (PLA) mikroküreler polycaprolactone (PCL) filaman imalatı açıklar.
Abstract
3D bioprinting biyolojik olarak aktif olan ve istediğiniz boyuta ve geometri özel iskele yaratmayı amaçlamaktadır. Biyolojik ajanlar progenitör hücre, kompozisyon ipuçları onların geçiş, yayılması ve farklılaşma özgün doku reconstitute için önde gelen sunarken termoplastik bir omurga mekanik istikrar için yerel doku benzer sağlayabilir / organ1,2. Ne yazık ki, birçok 3D yazdırma uyumlu, bioresorbable polimerler (örneğin polylactic asit, PLA) 210 ° C sıcaklıkta yazdırılan veya daha yüksek - sıcaklık destekte için zararlıdır. Öte yandan, polycaprolactone (PCL), polyester, farklı bir türü olan bir bioresorbable, daha nazik vekibar bir yazdırma sıcaklık 65 ° c 3D yazdırılabilir malzeme Bu nedenle, olan termal olarak koruyucu bir PLA bariyer içinde yer alan bu hücre dışı decellularized matriks (DM) PCL filaman içinde basılmış ve onun işlevsel uyum içinde kalır. Bu çalışmada, osteokondral onarım için hipotez test edildi uygulama oldu. Bu nedenle, domuz kıkırdak decellularized ve içinde hangi o zaman polycaprolactone (PCL) ile kalıptan çekilmiş polylactic asit (PLA) mikroküreler filaman 3D yapıları ile erimiş ifade modelleme üretmek için saklanmış. Yapıları ile ya da ezelî mikroküreler (PLA-DM/PCL ve PCL(-), sırasıyla) yüzey şekil farklılıkları için değerlendirildi.
Introduction
Geçerli doku mühendisliği teknikleri kemik, kıkırdak, tendon ve bağ rekonstrüksiyonu gibi klinik uygulamalar için auto - ve allogrefler hasarlı doku onarmak için kullanın. Bu tekniklerin herbirini rutin ilk hasta veya bir kadavra maç donör doku hasat ve sonra donör doku kusuru sitesinde2yerleştirerek klinik pratikte bir "altın standart" olarak gerçekleştirilir. Ancak, bu stratejileri tarafından donör sitesi morbidite, donör sitesi kıtlığı riski enfeksiyon ve istenen geometri maç Greftler bulmakta zorluk büyük kusurları için sınırlıdır. Ayrıca, çalışmalar allogrefler yeniden yapılanma için kullanılan yerel doku3ile karşılaştırıldığında mekanik ve biyolojik özellikleri azalttı göstermiştir. Bunu göz önünde bulundurarak, doku mühendisleri son zamanlarda biyolojik olarak aktif olan ve kusur boyutu ve şekli yeterli sağlarken karşılamak için tasarlanmış özel, karmaşık geometriler üretmek için üç boyutlu (3D) bioprinting için açık var biyolojik remodeling tamamlanana kadar mekanik özellikleri.
İdeal olarak, bir 3D baskılı iskele dahil destekte hücreler lider onların göç, nükleer silahların yayılmasına karşı çevresindeki biyokimyasal cues sunarken bu yerel doku gerekli mekanik kararlılığını koruyabilirsiniz bir polimer omurga oluşacak, farklılaşma ve doku üretim2,5. Ne yazık ki, biyolojik bileşenleri içeren çoğu yapıları jelleri veya otomatik/homogreft yeniden inşası için hedef dokulara yaşadığı vivo içinde kuvvetleri dayanmak için çok zayıf Polimerler ile yapılır. Diğer polimerler polylactic asit (PLA) gibi bioresorbable, 3D yazdırılabilir ve yapısal olarak ses, ama ya da 210 ° C - destekte imalat sırasında ortak basılı olmak imkansız hale üzerinde sıcaklıklarda yazdırılır. Polycaprolactone (PCL) karmaşık türleri morfoloji5,6 hastaya özgü implantlarda imalatı giderek daha popüler hale geldi bir daha düşük sıcaklık (65 ° C), yazdırılan 3D olabilir başka bir FDA onaylı, bioresorbable polimerdir ,7,8,9. Ancak, çoğu bioprinters Pnömatik teknolojisi kullanılarak daha düşük sıcaklıklarda nerede biyolojik etkinlikler sağ salim kalabileceği PCL yazdırmaya imkansız hale. Bugüne kadar bu polimerler otomatik/allogrefler ile entegrasyon bir roman yazdırılabilir biomaterial başarılı olmak henüz. Böyle bir malzeme yokluğunda, bir mühendislik doğru doku doku imar olası yaklaşımdır. Bu nedenle, biz PLA, PCL, birleştirmek aranan ve homogreft matrisler (DM) uygun bir yapı karmaşık dokuları yeniden inşa yetenekli üretmek için her malzeme avantajları kullanmak için decellularized. Bu işlem ilk mekanik mukavemeti vivo içinde kuvvetler ve istenilen doku oluşumu indükler bir yapı içinde katkı maddesi üretim karşılamak için termal kararlılık karşı gerekli sağlayacaktır.
Bir son girişimi söz konusu Engelli adrese, decellularized kıkırdak hücre dışı matriks içinde PCL filamentler, kalıptan çekilmiş termal olarak koruyucu bir PLA bariyer içinde kapsüllemek için uygulanabilirdir yeteneğini koruyarak gösterdik DM çevresindeki ana makine hücreleri2etkilemek için. Bu bizim doku yeniden inşası için klinik olarak etkili yaklaşımlar aramak için ilham kaynağı olmuştur. Mevcut çalışmada, PLA, DM ve PCL (PLA-DM/PCL) dahil tüm-içinde-bir iskele inşa etmek için platform teknolojisi kullanmaktadır.
Amacımız etkinlik ve sonuçta onları çeşitli uygulamalarda kullanmak için yerel doku, daha doğru bir şekilde özetlemek için önerilen roman biofabrication tekniği kullanarak allogrefler yarar geliştirmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. almak ve mikroküreler ön işleme
- Mikroküreler istenen matris (PLA-DM) kapsüllenmiş2üretmek.
Not: Mikroküreler Tekdüzen boyutu vardır zorunludur. Bu nedenle, kullanmadan mikroküreler önce eleme esastır. Matris decellularization ve kapsülleme önceki yayınları2' detaylı rağmen işlemi kısa bir özetini izler.- İlk olarak, kıkırdak fişler domuz hind uzuvların üzerinden hasat. Kıkırdak yıkar % 0.05 tripsin/0.5 mm tetrasodium ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile bir dizi decellularize, Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ve % 1.5 Perasetik asit ve % 2,0 Triton X-100 distile su yıkama ile her 4 h için önce ve sonra her adım2.
- Decellularized matris drenaj, dondur, lyophilize, eziyet ve pepsin çözümde geçiyoruz. Dağılması, pepsin çözüm diklorometan içinde çözünmüş PLA ile karıştırın.
- Karışımı dropwise % 3 Polivinil alkol su çözüm içine ekleyin. Santrifüj kapasitesi elde edilen mikroküreler, durulama, drenaj ve tekrar lyophilize.
Not: Daha önce yayımlanmış Protokolü2işlemiyle ilgili tüm bilgiler için bkz:.
- Mikroküreler elek.
- Tüm elek plakaları iyice temizlenir ve kullanımdan önce kuru olduğundan emin olun. Eğer gerekli, temiz tüm küreler elek kaldırılır emin olmak için ultrasonik temizleyici kullanarak Sita.
- Elek shaker üst, sonra bu ve elek altındaki pan 53 µm tepsi vasıl 106 µm elek tepsi ile bir araya getirin.
- Kuru mikroküreler en üst elek tepsisine yerleştirin ve kapağı üst tepsiye yerleştirin. 8-10 dakika tekrar ince 8-10 dakika süreyle kaba eleme üzerinde açın.
Not: Elek kez artırılması veya toplu iş bağlı olarak azaltılması gerekebilir. - Dikkatle elek plakaları tek tek kaldırmak ve baş aşağı bir büyük tartmak kağıt üzerine koyun. Yavaşça küreler çoğu elek ve kağıdın üzerine düşmüş emin olmak için iki tarafın dokunun.
- Büyük boyutlu küreler atmak (> 106 µm) ve cılız küreler (< 53 µm). 53-106 µm boyut türü ve toplu iş numarası etiketli santrifüj tüpü için arasındadır sonra -20 ° C dondurucuya kadar daha fazla kullanmak yer küre ekleyin.
2. Microsphere kalite kontrol değerlendirmeler
Not: Bkz. Şekil 1.
- Mikroküreler düzgün ve küresel, hiçbir toplamları mevcut ile kontrol etmek için makroskopik/görsel değerlendirmesi gerçekleştir.
- Bir tarama elektron test (SEM) kullanarak mikroküreler değerlendirmek.
- Bunun için yer mikroküreler bir SEM üzerine chuck ve ceket altın-Paladyum için 4 kalınlığında bir sputter coater kullanarak argon atmosferde şaplatın nm.
- Yüzey özellikleri, Morfoloji ve çapları 10 kullanarak mikroküreler gözlemlemek bu üretim ve mikroküreler eleme emin olmak için kV gerilim ve 10 mm çalışma mesafesi hızlanan başarılı oldu.
3. filament oluşturmak için 3D baskı
- Ölçü ve kayıt 2 ve 3 numaralı adımları elde edilen mikroküreler kütlesi; en az 25 bin gereklidir.
- Polycaprolactone (PCL) toz mikroküreler mikroküreler PCL için oranı 1:4 ağırlık için ekleyin.
- 5 min için bir minyatür haddeleme Mikser-20 devirde toz karışımı karıştırın sonra konteyner flip ve mix bir ek 5 min için 20 rpm (bkz. Şekil 2).
- Çünkü onların hedeflenen çalışma sıcaklıkları geleneksel yuvarlak ifade filamentler için (FDM) modelleme ( Tablo reçetesigörmek) birçok ticari olarak mevcut Ekstruderlerde yalıtım ceketler var. Yalıtım malzemesi kaldırarak (gerekirse) ekstruder değiştirin ve birlikte (hangi ortam havası ekstruder ve haddelenmiş filaman üzerine darbe) Masaüstü hayranları ile daha düşük sıcaklıklarda ekstruder kullanımı için kullanabilirsiniz.
Not: blow ekstruder ve filament soğutmak için ortam hava masaüstü hayranları bu yordam için yararlıdır. - Kur donatım Kur ekstrüzyon için. Şekil 3' e bakın.
- Böylece onun çıkış giriş biriktirici giriş ekstrüzyon prizinden doğrudan bir yol ile ~ 60 cm biriktiricisine ekstruder Kur.
Not: filaman benchtop dokunmadan noktasına sarkık bulunursa biriktirici isteğe bağlı olarak 3-4 inç kürsüye gelen yükseltilebilir. - Masaüstü fan ~ 15 cm Isıtma ceketinden yerleştirin ve filament üretim boyunca ortam havası ile soğutma sunmak için Isıtma ceketi doğru yönlendirin. İkinci bir soğutma fanı yaklaşık yarısına ekstrüder biriktirici arasında yer ve filament ortam havası ile Soğutma tesisatında yardımcı olmak için extrudate doğru yönlendirin.
- Konumlandırma süreci boyunca gerektiği gibi ayarlayın.
- Böylece onun çıkış giriş biriktirici giriş ekstrüzyon prizinden doğrudan bir yol ile ~ 60 cm biriktiricisine ekstruder Kur.
- 52 ° c Isıtma değiştirilmiş ekstruder ayarla, soğutma fanları masaüstünde açın ve araç denge 20-30 dk. uygun meme ekstruder için bağlı olduğu sağlamak için gelmek izin.
- Başlamadan önce ekstruder hopper adım 3.3 microsphere/PCL karışımı ile doldurun. Biriktirici ve ekstruder burgu filaman ekstrüzyon başlatmak için açın.
- İlk filaman kalıptan çekilmiş, el ile forseps ile extrudate ekstrüzyon prizinden çekin ve filament biriktiriciye besleme.
- İstenen filaman biriktirici dışarı gelmek için biraz zaman alacak. Ayrı biriktiricileri veya teyp kullanarak, açıkça ne zaman filaman kompozisyon görsel olarak Tekdüzen görünür işaretler.
- Süreci yakından izlemek ve parametreleri gerektiği gibi değiştirin. Ekstruder sıcaklık, ekstrüzyon burgu hızı ve biriktirici hız Kumpasları tarafından ölçülen bir 1,75 mm çap filament elde etmek için ayarlayın. Hayranları düzgün dairesel filaman kesit önlemek için filaman soğutmak için gereken şekilde ayarlayın. Mix ve gerekli hazne doldurma.
Not: Yakın ilgi sonraki 3D baskı için yeterli filaman elde etmek için bu işlem sırasında gereklidir. Yukarıdaki parametreler ortam koşulları, dolgu düzeyi ve hazne karışımı düzgünlüğü ve PCL ve mikroküreler belirli toplu işlemler termodinamik ve akış dinamikleri bağlı olarak değişir. - Tüm tozu kullanılmıştır ve hazne neredeyse boş kadar yükseltme devam edin. PCL toz (olmadan mikroküreler) Şu anda ekstruder içinde olduğunu microsphere karışımı dışarı floş hazne ekleyin. Yok daha fazla mikroküreler extrudate içinde görünür hale gelene kadar PCL toz hazne için eklemeye devam edin.
- Etiketlediğinizden emin olun ve ayrı filaman soğutmalı sonra içeren mikroküreler istenen konsantrasyon olarak filaman Tekdüzen filaman üniform olmayan filaman ayırt etmek zordur.
- En az toz hazne içinde yaptı kadar yükseltme devam, o zaman biriktirici, Ekstruder burgu, Ekstruder ısıtma elemanı ve fanlar kapatın.
4. Filament ile yazdırma
- Bir geometriye istenilen şekil ve bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanarak form tasarla. Daha sonra model dilim ve kullanılan 3D baskı makinesi ile uyumlu Dilimleme yazılımı kullanarak takım dikte.
- İstenilen çap (genellikle 0.4 mm) standart püskürtme ile donatılmış filaman kimden adım 3 herhangi bir standart FDM yazıcı üzerine yükleyin. Özel filaman yatırılan katman--katman makine tarafından olduğu gibi Yazdır (genellikle doğrusal hız 65-70 ° C ve 300 mm/dak) başlar.
- İlk katman özel dikkat ve kaliteli baskı almak için gerektiği gibi ayarları değiştirmek emin olun.
Not: Yazdırma hızı, yazdırma sıcaklığı, platform sıcaklık, ekstrüzyon çarpanı ve diğer parametreleri için ayarlamalar yapılabilir. Yazıcı ve dilimleme üretici daha fazla yardım için sorun giderme kılavuzu bakın.
5. kalite kontrol değerlendirme
- Yazdırılan yapıları SEM chucks yerleştirin ve ceket altın-Paladyum için 4 kalınlığında bir sputter coater kullanarak argon atmosferde şaplatın nm.
- Bir 10 kullanma mikroskop altında gözlemlemek yüzey özellikleri kontrol etmek için kV gerilim ve 10 mm çalışma mesafesi hızlandırılması ve varlığı ya da yokluğu mikroküreler varsa için.
6. işlevsel test edilmesini yazdırılan yapıları
Not: Alkalen fosfataz (ALP) decellularized matris için bir vekil olarak kapsüllenmiş proteinler filaman üretim işleminden sonra biyolojik olarak aktif olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. ALP bir substrat, p-nitrophenyl fosfat, renksiz sarı yan, p-nitrophenol ve inorganik fosfat, değiştirmek için bir tepkiden tromboksan çünkü ama ALP işlevsel biçimi ise kullanılır.
- Bir geometriye yazdırma (n = 3) en az 400 mg PLA-DM/PCL iskele aynı yazdırma parametrelerini kullanarak ALP microsphere filaman (PLA-ALP/PCL) ile bir son kitle vardır. Ayrıca PCL yazdırma-tek (PCL(-)) iskele, PLA-ALP/PCL iskele olarak aynı geometri. 1 mL Tris-HCl arabellekte daldırın ve enzim difüzyon izin için 37 ° C ve 110 rpm döndürme, 24 h için kuluçkaya.
- 1 mL 1 mg/mL p-nitrophenyl fosfat, Tris disodyum hekzahidrat ekleyin-Incubate HCl. 37 ° c, ek 10 h 415 süpernatant absorbans okumak için 110 d/d nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eleme sonra mikroküreler Tekdüzen görünür ve toplamları ücretsiz. SEM altında süzülen mikroküreler küçük gözenekleri onların yüzey üzerinde olabilir, ama Şekil 1' de gösterildiği gibi küresel ve pürüzsüz, aksi takdirde olacak. Tüm haddelenmiş filamentler Tekdüzen çapı ve dairesel kesit olmalıdır. Mikroküreler (PLA-DM/PCL) içeren bir filament-ecek-si olmak biraz daha fazla bir mat bir PCL-yalnızca bitirmek (PCL(-)) filaman bakmak daha parlak. PLA-DM/PCL filament de PCL(-) filaman dokunmak kaba hissediyorum. İskele adım 4.1 yazılım tarafından dikte istenen geometri yazdırılmalıdır. İskele kalite ve şekil tekrarlanabilir ve düzgün bir parmak izi üzerinden başka bir olmalıdır. Sonra baskı, iskele ve mikroküreler olmadan macroscopically ayırt etmek zor olacak, ama SEM altında mikroküreler yüzeyi ve yapıları boyunca görünür olmalıdır. SEM altında PCL(-) filaman pürüzsüz, ekstrüzyon işleminin (Şekil 4B) bir obje olarak bazı çizikler ile görünür. Mikroküreler görünür olmalı her iki çıkıntılı aracılığıyla ve (bkz. Şekil 4C) PLA-DM/PCL iskele yüzeyinin altında. ALP DM için bir vekil olarak kullanırken, iskele içinde enzim işlevselliğini önemli ölçüde daha yüksek absorbans ile sağlanmalıdır (t-testi, p < 0,05) 415, bu boş PCL(-) daha nm iskele, 0.297 ± 0.023 ve 0.166 ± 0.012, sırasıyla, Şekil 5.
Resim 1 . Temsilcisi makroskopik (sol) ve SEM mikroküreler hazırlık ve eleme sonra (sağda) görüntüleri 2. mikroküreler küresel ve uygun boyut aralığı (53-106 µm çapı) olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Özel haddeleme karıştırıcı yaptı. Özel yapım çalışırken Mikser mikroküreler PCL tozu ile birleştirmek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Filaman üretim kurulumu. Ekstruder çıkış yaklaşık 60 cm biriktirici giriş--dan ayarlanır. Masaüstü hayranları ısıtma elemanı ve yaklaşık yarım ekstruder biriktirici arasında yakınında yer alır. Biriktirici isteğe bağlı olarak yükseltilmiş 3-4 santim benchtop üzerinden olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Kalite değerlendirmeler. (A) PCL(-) (solda) ve PLA-DM/PCL (sağda) iskele macroscopically ayırt etmek zor. (B) SEM altında PCL(-) iskele çoğunlukla pürüzsüz, yazdırma işlemi eserler olarak birkaç çizikler ile görünür. (C) altında SEM, PLA-DM/PCL örneklerinde mikroküreler görülebilir. Bazı mikroküreler okları kullanarak belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Temsilcisi bir ALP Renkölçer tahlil sonuçlarını. İskele (PLA-ALP/PCL) ALP içeren absorbans önemli ölçüde salt PCL daha yüksek (ALP enzim p-nitrophenol ve inorganik renksiz p-nitrophenyl fosfat tepkiden katalize gösteren PCL(-)) iskele, fosfat. Bu işlemi ile fonksiyonel proteinler yazdırma olanağı bu el yazması açıklanan gösterir. * önemli ölçüde farklı (p < 0,05) tüm diğer gruplar. Hata çubukları standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ikisi de matrisler decellularized ve 3D yazdırılan PCL iskele bağımsız olarak onarım10,11,12yapışma ve kullanımları osteokondral için doğrulama hücrelerin çoğalması izin gösterilmiştir. Decellularized matris doku onarımı Mühendisliği yaklaşımlar kullanımı çok ilgi ve başarı yakın geçmişte2,3,14,15bir konu olmuştur. Biz daha önce artan göç, adezyon, yayılması ve geleneksel teknikleri2,15,16',17 karşılaştırıldığında ortaya çıkan dokuların genel bakım kaydetti var. ,18. Birçok dinamik karşılıklılık ile konak hücreleri yardımlar decellularized matris almanıza neden olan işlemi bu arzu edilen sonuçlar atfedilen, dinamik olarak yanıt vermek ve yeni hücreler için ipuçları daha hücre dışı matriks bu çekilme çoğaltmak genellikle zaten mevcut19,20,21,22nedir benzer. Bu birçok uygulama için eğitim gördü, işlemlerin çoğunu çoğaltmak kolay değildir ve farklı anlamları, son derece hasta özel yapıları, karmaşık türleri morfoloji, oluşturamıyor başarıyla oluşturulamadı ve yapamaz için adapte olamaz dayanacak vivo içinde 2,3,4,13,14,15,16zorlar.
Burada önerilen yenilikçi yaklaşım geçici ve uzun süreli maruz kalma geleneksel mekanik ekstrüzyon tabanlı FDM yazıcılar ile yeni bir taşıyıcı araç kullanırken tarafından 3D baskı genellikle gerekli yüksek sıcaklıklarda önler. Ayrıca, taşıyıcı araç (PLA mikroküreler) kapsüllenmiş korur biyolojik nispeten kısa bir süre için bu ısıya maruz ve hızlı devir oranı, Kliniği2için bir All-in-one tedavi seçeneği sağlar. Burada önerilen yöntemleri biyolojik olarak aktif filamentler 3D baskı ve iskele yolu ile önemli bir adım filaman ekstrüzyon nerede 3D baskı ve bu filamentler baskısı için düşük sıcaklıklarda (65 ° C) oluşturmak nasıl gösterir. İşlevsel kalır yeteneği kapsüllenmiş proteinlerin süreci boyunca DM için bir vekil olarak ALP kullanarak gösterilmiştir. Enzim bu protokolü23' değerlendirildi kolorimetrik reaksiyon katalizler için çok özel bir işlev uyum içinde olması gerekir gibi ALP kullanıldı. Tel çapı, sıcaklık ve hız için dikkatli dikkat çekilmiş değil, biyolojik aktivite ve 3D baskı için programını kurban.
Bu iletişim kuralı, decelluarized matrisler (PLA-DM) içeren mikroküreler 3D yazdırılabilir filamentler yapmak PCL ile birlikte haddelenmiş ve osteokondral için 3D yazdırılan iskele (PLA-DM/PCL) onarma. İletişim kuralı adımlarda belirtildiği gibi sürekli filament üretim işleminin izlenmesini filaman yüksek kalitesi için önemlidir. Ayarlamaları istenen filaman çapı (genellikle 1,75 mm) korumak için ekstrüzyon hızı, biriktirici hız ve ekstrüzyon sıcaklık ile yapılmalıdır. İskele mikroküreler varlığı teyit SEM görüntüleme ve enzim bakımından tarafından işlevselliği bir alkalen fosfataz tahlil tarafından gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı mikroküreler üretim ve diğer 3D yazdırma yöntemleri için modelleme erimiş yükünün nispeten daha düşük çözünürlük için gerekli büyük miktarda tarafından sınırlı unutmayın. Bununla birlikte, artan biyolojik etkinliği büyük bir ilerleme olduğunu. Değil bu protokolü odak noktası olsa da, daha sonraki çalışmalar mikroküreler mekanik mukavemeti, hücre göç ve farklılaşma üzerine etkisi ve daha fazla karakterizasyonu, iskele üzerinde odaklanacaktır. Genel olarak, burada açıklanan tekniği decellularized matris ve diğer proteinler düşük sıcaklıklarda önceden izin verdiğinden ve işlev ve mekanik gücü2korumak için termal olarak koruyucu bariyerleri yazdırılmasını sağlar, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu projenin kısmen bir hibe den pediatrik ortopedi Derneği, Kuzey Amerika (POSNA) tarafından finanse edildi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIBIB R21EB025378-01 (keşif Biyomühendislik Araştırma Bursu) verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
