Summary
Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.
Abstract
Ne kadar sinir devreleri işlem bilgileri sürücü davranış çıkış amacıyla büyük ölçüde işleme ve nöronlar içinde vivoetkinliğini izleme için son zamanlarda geliştirilen optik yöntemlerle destekli anlamak için arayışı. Bu tür deneyler iki ana bileşenleri üzerinde bağlıdır: beynin optik erişim sağlamak 1) implante edilebilir cihazların ve nöronal uyarılabilirlik değiştirmek veya bir okuma nöronal aktivitenin sağlayabilirsiniz 2) ışığa duyarlı proteinlerdir. Işığa duyarlı proteinler hızlı yolları vardır, ancak ifade, anatomik, genetik ve zamansal hassasiyetle kontrol edilebilir çünkü viral vektörler stereotaksik enjeksiyon şu anda en esnek yaklaşım. Viral vektörler büyük yarar rağmen virüs sayısız sorunlar optik implantlar pozlar siteye teslim. Stereotaksik virüs enjeksiyonları cerrahi süresini artırmak, çalışmaları maliyetini artırmak ve hayvan sağlığı için riski ameliyatları talep ediyorlar. Çevreleyen doku fiziksel olarak enjeksiyon şırınga ve immünojenik iltihap yüksek titresi virüs bolus ani teslim tarafından neden olduğu zarar görebilir. Enjeksiyonları optik implantlar ile hizalama zor özellikle küçük bölgeleri hedeflerken beynin derinliklerinde. Bu zorlukları aşmak için birden çok türü Filmler Adeno ilişkili viral (AAV) vektörel çizimler ve ipek fibroin oluşan optik implantlarda kaplama yöntemi açıklanmaktadır. Fibroin, Bombiks mori, koza türetilmiş bir polimer Kapsüller ve biomolecules korumak ve çözünür filmlerden seramik için değişen formları içine işlenebilir. Beyne ipek/AAV kaplamalar tam olarak gerektiğinde ifade sürüş arabirimi optik elemanları ve çevresindeki beyin arasında virüs serbest. Bu yöntem kolayca uygulanır ve in vivo çalışmalar nöral devre fonksiyonunun büyük kolaylaştırmak vaat ediyor.
Introduction
Son on yıl için izleme ve sinirsel aktivite1manipüle mühendislik ışığa duyarlı proteinlerin bir patlama üretti. Virüsler bu optogenetic araçlar beyinde ifade etmek için benzersiz esneklik sunar. Transjenik hayvanlar için karşılaştırıldığında, virüs üretmek, ulaşım ve mağaza, en yeni optogenetic araçların hızlı uygulama izin için daha kolay. İfade için farklı nöron popülasyonları genetik olarak yönlendirilebilir ve retrograd taşıma için tasarlanmış virüs bile nöronal bağlantı2dayalı ifade hedeflemek için kullanılır.
Virüsler genellikle zaman alıcı ve zor olabilir stereotaksik enjeksiyonları ile tanıtılmaktadır. Tam olarak küçük bölgeleri hedefleme-ebilmek var olmak zor, ifade kez geniş alanlar üzerinde sürüş birçok enjeksiyonları gerekirken. Bir optik cihaz daha sonra hafif vivo içindeteslim etmek için beynine yerleştirilmiş iken, Ayrıca, İmplantın doğru viral enjeksiyon ile hizalı gerekir. Burada, kolayca uygulanabilir bir yöntem viral vektörler ipek fibroin Filmler3kullanarak bir implant cihaz etrafında doku teslim etmek için açıklamak. İpek fibroin piyasada bulunan, nöral dokular tarafından iyi tolere ve çeşitli özellikleri ile malzeme üretmek için kullanılabilir. İpek filmleri ya da mikroenjeksiyon Pipetler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak implantlar için uygulanan Pipetler el. İpek/AAV filmleri iki cerrahi işlemler gereksinimini ortadan kaldırmak ve virüs-aracılı ifade düzgün optik implant uyumlu olun. Sonuçta elde edilen ifade lifleri ve lif parça daha az istenmeyen ifadeye stereotaksik enjeksiyonları daha sonuçlarında ucuna sınırlıdır.
Hedeflenen ifade ucundaki küçük liflerinin üreten ek olarak, ipek/AAV filmleri yaygın sürücü için kullanılabilir (> 3 mm çapında) kafatası windows altında kortikal ifade. İn vivo 2-Foton görüntüleme floresan etkinlik sensörler duyusal ve bilişsel işleme sürüş nöronal aktivite rolünün değerlendirilmesi için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Ancak, ifade geniş kortikal alanlarda Denemecileri kez üzerinde üniforma sürücü için birden fazla enjeksiyonları gerçekleştirin. Bu iğneleri son derece zaman alıcı olabilir ve tutarsız ifade görüş alanı açabilir. Buna ek olarak, kafatası windows ipek/AAV-ceket imalatı, büyük ölçüde ameliyatları için gereken süreyi azaltmak ve en dikkat çekici ifade yüz mikron kortikal yüzeyinin altında sürücü son derece kolaydır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm Deney hayvanları içeren Harvard daimi Komitesi aşağıdaki yönergeleri bize NIH bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu' nda tanımlanan hayvan bakımı üzerinde tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Yetişkin C57BL/6 fareler her iki cinsiyetten (yaş 6-15 hafta) tüm deneyler için kullanılmıştır.
1. sulu ipek Fibroin alın
- Hazırlamak veya sulu ipek fibroin (% 5-7,5 w/v) satın alın.
2. mix AAV ifade vektörel çizimler ile sulu ipek
- Sürücü optogenetic protein veya floresan göstergesi seçim için bir AAV ifade vektör seçin.
Not: stok-titresi AAV (~ 1013 gc/mL genellikle vektör göbek elde titreleri vardır stok) hala sağlam ifade sürüş sırasında implant uygulanması gerekir ipek/AAV hacmi en aza indirmek için tavsiye edilir. - Kaplama implantlar, hemen önce bir aliquot AAV, çözülme ve % 5-7.5 sulu ipek fibroin (bu karışımı için ipek/AAV anılacaktır) ile birleştirir. Bir 200 µL PCR tüp içinde sulu fibroin ve AAV (kafatası windows kullanımı için 1:4) 1:1 oranında hemen önce uygulama karıştırın. Yavaşça çözüm fibroin ve AAV iyice karıştırmak için girip birkaç kez pipette.
- İpek/AAV karışımı buz üzerinde kullanmak için önceden tutun.
3. ekipman imalat ve ipek/AAV-kaplı aygıt Muhafazası için hazırlayın
- Ekipman temin etmek kaplama optik elyaf ve gradyan-Index (ECE) lensler (rakamlar 1, 2).
- Bir kararlı yüksük tutucu oluşturmak. Seramik halkalar tutmak için 1,25 mm ¼" sayfası akrilik bloğunu delik. Set vida halkalar tutmak için yan eklemek için delik dokunun.
Not: Herhangi bir kelepçe bu amaç için kullanılabilir. - Bir manipülatör optik fiberler (stereotaksik cihazlar veya diğer hassas micromanipulator) taşımak için alt milimetre hassasiyetle getirin.
- Microinjector konumlandırmak için istikrarlı bir tutucu bir araya getirin.
- Bir stereoscope optik lifler ve ipek damlacık görselleştirmek için kullanın.
- Optik lifler aydınlatmak için ışık kaynağı getirin.
- Bir kararlı yüksük tutucu oluşturmak. Seramik halkalar tutmak için 1,25 mm ¼" sayfası akrilik bloğunu delik. Set vida halkalar tutmak için yan eklemek için delik dokunun.
- Kafatası windows (şekil 3) kaplama için donatım hazırlayın.
- Herhangi bir P10 pipettor seçin.
- Bir konteyner kapak ile elde edilir.
Not: Herhangi bir kapsayıcı bir silikon alt ile önerilir — yumuşak alt kranial Windows'u kaldırma kolaylaştırır.
- Ekipman bitmiş implantları (şekil 4) depolamak için hazırlayın.
- Bir küçük (1-5 L) vakum odası edinin.
- 4 ° C buzdolabında saklamak için alan implantlar olduğundan emin olun.
4. ipek/AAV Film aygıtlara uygular
- Sürücü odak ifade fiber uç optik elyaf kaplama
- Kronik fiber implantlar yukarıda açıklanan4hazırlayın.
- Kullanım önce durulama ile etanol implantlar sonra ultrasaf su ile sağlamak için optik lifler temizdir.
Not: İpek filmleri daha güvenilir bir şekilde cam yüzeyleri temizlemek için uygun. - Fiber halkalar tutmak için bir cihazını hazırlayın. Tipik 1,25 mm çaplı halkalar için kullanmak bir blok ¼ inch ~1.3 ile açık akrilik mm delikler ve set vida kenardan delik implantlar sıkıca yerinde (şekil 1A) girerek vurdu.
- Stereotaksik aparatı (veya submillimeter hassas işleme çözümü) yüksük yuvasına bir microinjector ile donatılmış monte edin. Yer microinjector yukarıda yüksük tutucu ve ipek/AAV karışımı aşağıdan uygulayın.
Not: yukarıda geniş hacimli uygulamalar için belgili tanımlık uç kısıtlı değildi ipek/AAV sonuçlandı olmasıdır. Ancak, birçok küçük sıralı birim yukarıda veya aşağıda uygulanması (biz aşağıdan uygulamak tercih rağmen) ucuna kadar cezalısınız AAV/ipek mevduat üretebilir. - Bir çift kafa içi enjeksiyon pipet borosilikat camdan kapiller çek.
- Kolay hale getirmek için
- Bir iğne ucu ile istenilen çap temiz düz bir ucu üretmek için bir pipet her elinde tutmak ve konik kalın bölümü üzerinde bir pipet diğer pipet istenen mola yerinde puanı için kullanın.
- Hafifçe ileri geri bir testere hareket (cam üzerinde puanlama yöntemi) ovalayın.
- Pipet puanlama sonra temiz bir mola elde etmek için diğer pipet gövdesi ile attı pipet ucu hafif basınç uygulayın.
- Fiber optik yüzleri net bir görünüm vermek için bir stereoscope getirin.
Not: Büyütme optik lifler yüzü yukarıda enjeksiyon pipet doğru pozisyon için yeterli olmalıdır. - Tutucu beyin yüzü aşağı bakacak şekilde fiber optik fiber implantlar takın.
- Enjeksiyon pipet ile herhangi bir standart kafa içi enjeksiyon5gelince ipek/AAV çözüm yükleyin. Ayrıca ~ %30 Pipetler tıkanma nedeniyle kayıpları karşılamak için ilave yaptım implantlar sayısı için gerekli miktar yük. Örneğin, 10 implantları yapılırsa, o zaman 100 nL mevduat ile yük ve ~1.3 µL çekilme.
Not: İpek/AAV pipet ucu pipet yapışmasına neden olabilir atılanlar arasında kuru. Büyük çaplı Pipetler (50-100 µm) daha az zarar olasılığı. Takunya bir ıslak kağıt mendil ya da alkol bez ile pipet ucu aşağı hafif fırçalayarak yerinden. - Dokunmadan veya neredeyse dokunmadan fiber optik yüzeyi ortasına kadar enjeksiyon pipet manevra. 10-20 nL ipek/AAV çözüm çıkarma. Pipet geri alıyorum.
Not: Teslimat oranı kritik değildir, ancak tipik oranları 5-20 nL/s vardır. - İpek/AAV ~ 1 dk içinde düz bir film için kurur bir sıvı kubbe olarak görünen düz yüzeye bolus gözlemlemek (şekil 1B).
- İpek/AAV istenilen miktarda kadar adımları 4.1.9-4.1.10 yatırılır (20-200 nL çoğu uygulama için toplam) yineleyin. Birden çok implantlar hazırlanırken, ipek/AAV bir implant uygulamak ve ardından dönmeden önce diğer implantlar kat hareket ilk.
- 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
- Vakum desiccate gecede, ~ 125 Torr (içinde -25. HG), 4 ° C. Bunu tüm yüksük tutucu bir vakum odası yerleştirerek.
- Şekil ve yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek film konumunu değerlendirmek. Filmler fiber optik yüzeyi ucuna kadar cezalısınız sağlamak, nispeten ince (> 100 µm) ve simetrik (şekil 1 c).
Not: Büyük veya asimetrik ipek/AAV Filmler implantasyonu (şekil 1 d) fiber çıkarmak. Sorunlarının en yaygın nedeni birçok küçük birimlerin sıralı uygulama yerine uygulama tek büyük miktarlar doğar.
- Kaplama optik lifler lif eksen boyunca sürücü ifade için konik
- Konik fiber optik implantlar elde etmek ve enjektör (şekil 2A) dikey öyle ki konik fiber yanal konumlandırılmış dışında bu adımları 4.1.2-4.1.8, gerçekleştirin. Enjektör konik lif üzerinde konumlandırın.
Not: yüzey gerilimi damlacıkları geri enjeksiyon pipet atlamak veya konik fiber kadar göç neden eğilimi çünkü konik lifleri pozlar üzerine sıvı damlacıkları yükleme sorunları, ekledi. Daha küçük enjeksiyon Pipetler (30-50 µm çapı) üstesinden gelmek bu problem ama enjeksiyon pipet zarar riskini artırmak için yardımcı olur. Yüzey gerilimi, nedeniyle damlacıkları en büyük yüzey alanı alan için uygun eğilimindedir, böylece optimum enjeksiyon pipet boyutu konik lif ve ara sıra takunya için kişinin tolerans boyutunu bağlıdır. - Fiber optik tarafına ipek/AAV enjeksiyon pipet ucu başında yerleştirin. Enjeksiyon pipet fiber optik dokunuyor emin olun.
- 20 çıkarma nL ipek/AAV, kaplama işlemi başlatmak için. Damlacık fiber optik bağlı kalır ve lif/pipet arayüzü kalır emin olun. İpek/AAV kurur damlacık fiber uç sonuna doğru yavaşça fitil (~ 45 s). Enjekte etme pipet pipet ucu tıkanmasını önlemek için kurutma damlacığı ile temas halinde tutmak.
Not: Her mevduat konik fiber (şekil 2B) yaklaşık 400 µm ceket. - Ne zaman ilk bolus neredeyse tamamen kurudu, başka bir 20 çıkarma nL ve konik boyunca damlacık esneklik devam.
Not: Sıvı ipek bir ucunu ankraj: damlacık pipet olarak konik taşır kurutulmuş ipek için uygun olacaktır. - İpek/AAV küçük miktarlarda dışarı atmak ve yavaş yavaş konik üst çözüm çizim tarafından 4.2.4 arasındaki adımları yineleyin. 5-6 atılanlar 2.5 mm Konik yüzey çapraz geçiş yapmak yeterlidir.
- Etrafındaki tüm Tekdüzen ifade daha fiber götürmek için fiber döndürmek ve ipek/AAV istenilen miktarda yatırılır kadar adımları 4.2.2-4.2.5 tekrarlayın.
- Eğer, bir asılı strand kurutulmuş ipek/AAV fiber uç genişletir, dikkatle strand makasla kesmek ya fırlatma pipet strand geri katlayın ve lif konik için uygun kullanmak.
- 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
- Vakum desiccate gecede 4 ° c Tüm yüksük tutucu bir vakum odası yerleştirilebilir.
- Şekil ve yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek film konumunu değerlendirmek.
Not: Film tamamen tek tip olması gerekmez ancak 100'den fazla µm implantasyonu (şekil 3 c) çevresindeki doku hasarı en aza indirmek için lif yüzeyine ötesinde genişletmek diken diken olmamalıdır. Film boyutu en aza indirmek için sonraki mevduat yapılmadan önce her damlacık tamamen kuru olduğundan önemlidir.
- Konik fiber optik implantlar elde etmek ve enjektör (şekil 2A) dikey öyle ki konik fiber yanal konumlandırılmış dışında bu adımları 4.1.2-4.1.8, gerçekleştirin. Enjektör konik lif üzerinde konumlandırın.
- Kaplama SIRITIŞ lens implantları
- SIRITIŞ lensler6,7 almak ve adımları 4.1.2-4.1.8 tekrarlayın. Enjektör yukarıda monte edilebilir.
- İpek/AAV tek fırlatma (1.0 mm çap lens için 1 µL) havale.
Not: Bu bir kubbe objektif yüze bağlı kalır ve (100-200 µm kalın) Tekdüzen bir film üretmek için kurur sıvı ortaya çıkarır. Tek bir büyük fırlatma düzensiz kurur ve GÜLÜMSEME objektifin kenarlarına kalın bir film üretir olay bu, ancak, birden çok daha küçük damlacıklar (100-200 nL) yatırma (izin veren yatırma önce kurumasını her damlacık lens yüzeyinde ortasına deneyin Sonraki) film görüş alanı merkezinde ifade sürücü olacaktır emin olmak için. - 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
- Şekil ve elde edilen ipek film film lens yüzeyini kapsar emin olmak için yüksek güçlü bir mikroskop altında konumunu değerlendirmek.
- Kaplama cam kafatası windows
- Cam hazırlamak kafatası windows tarafından yapışan iki 3 mm çapında bir 5 mm çap penceresine optik yapıştırıcı ile coverslips (No 1 kalınlık) yuvarlak (ayrıntılı bilgi için bkz: Goldey vd. 20148).
- İpek: virüs ipek film toplam miktarını azaltmak için 1:4 oranında karıştırın. Aşırı miktarda ipek kafatası windows altında implantasyon sonra geçiyoruz değil. Titrasyon deneyler oranı ve istenen ifade profil verir birim belirlemek için gerekli.
- El 5 µL damlacık 3 mm (beyin bakan) coverslip yüzeyinin pipette. Damlacık tüm cam yüzey (şekil 3) kapsayacak şekilde yaymak.
- 2-3 h windows taşımadan önce kurutma için izin.
5. ipek/AAV-kaplamalı implantlar depolama
- İpek/AAV-kaplamalı optik lifler soğutmalı vakum desiccator (~ 125 Torr, 4 ° C) kullanılmadan önce (şekil 4A) depolar.
- Vakum altında depolanan büyük ipek filmleri tamamen erimesi implantasyon sonra da kafatası windows ve vakum altında SIRITIŞ lensler depolamayın. Kafatası windows ve SIRITIŞ lensler hemen sonra kurutma veya atmosferik basınç ve 4 ° c depolanmış olsa üretim bir gün içinde implant
6. aygıtların yerleştirilmesi
- Hayvanlar yukarıda açıklanan4implant ameliyat için hazırlayın.
- Kısaca, mayi ketamin/xylazine (100/10 mg/kg) enjeksiyonu ile fareler anestezi ve nazik bir ayak çimdik kullanarak anestezi derinliği kontrol edin. İmplantın alan kafatasında tıraş ve iyot ve alkol ile kafa derisi temiz.
- Mount hayvan stereotaksik aygıt ve oksijen ve isoflurane (% 1-2) karışımı kullanarak ek anestezi. Bir kesik kafa derisi içinde ilgi alanı yapmak ve implant kapsayacak kadar geniş bir kranyotomi gerçekleştirin.
- Optik lifler9 ve microendoscope lensler daha önce yayımlanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı10 implant. Kolu özenle, silikon ve ipek/AAV mevduat kusurlu bir kranyotomi veya kafatası kenarında yakalamak implant kapalı çaldı gibi. Protez yavaşça beyine indirin (~ 2 mm/dak).
- Gibi daha önce8tarif implant kafatası windows. Pencerenin boyalı tarafındaki dokunmaya değil ve bu virüs silsin gibi sıvı içeren pencereyi sonda ile besleme, performans Eğer durulama kaçının. Maksimal ifade elde etmek için bir durotomy gerçekleştirin.
7. ifade değerlendirme ve sorun giderme
- İfade virally-proteinlerin değerlendirmek için izin ~ 2-3 hafta için ifade sürücü, daha sonra intracardial perfüzyon ile %4 paraformaldehyde fosfat içinde gerçekleştirmek virüs arabelleğe alınmış floresan tuzlu çözüm11 ve işlem beyin dokusu mikroskopi12.
- Ifade fluorophore öğesini optogenetic proteinlerin ifade deseninin görüntüye floresan mikroskopi kullanarak değerlendirmek.
- İfade düzeyi yetersiz ise, ipek/AAV kaplama toplam hacmini artırarak veya tercihen kullanarak daha yüksek bir titresi virüs virüs kaplamalar içinde miktarını artırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İfade sürüş ipek/AAV filmleri başarısını değerlendirmek için biz hayvanlar 2-3 hafta implantasyonu sonrası derin ve bölge beyin dilim faiz hazırladı. Floresans görüntüleri (ChR2-YFP) fluorophore öğesini optogenetic proteinlerin ifade (şekil 1 d) kapsamını ölçüsü sağlanan. Tipik optik fiberler (230 µm çapı) kolayca 200 karşılamak ipek/AAV nL. Uygulama ile Denemecileri implante lifleri (şekil 5) ucu etrafında son derece güvenilir ifadesi elde edebilirsiniz.
İpek/AAV-kaplı kafatası windows tarafından tahrik ifade değerlendirmek için 7-10 gün implantasyonu sonrası başlayan görüntüleme başlar. Biz-si olmak kullanılmış iki fotonlu görüntüleme görselleştirme için ama bir CCD ile görüntüleme Floresans gibi diğer yöntemleri de kullanılabilir. İki olası sorunlar ile kaplı kafatası windows yetersiz ifade ve dağıtılması ve görüş alanı belirsiz başarısız ipek filmler vardır. İfade artırmak için pencerenin yerleştirilmesi ve/veya virüs filmde miktarını artırarak önce bir durectomy yapmak öneririm. Biz en iyi ifade ipek ve stok-titresi AAV, 1:4 karışımından sırasıyla kullanarak elde. Bu genellikle stereotaksik enjeksiyonları kullanılır daha önemli ölçüde daha büyük bir sayı viral parçacıkların temsil ederken, azalan cerrahi zaman virüs marjinal ek ücret sayaçları. İpek filmleri penceresinin altında dağıtılması için başarısız olursa, bu arada, daha fazla pencere kat için kullanılan ipek miktarını azaltmak. İpek kaplamalı Windows toplam miktarı 10 - 100 kat daha fazla lif implantlar üzerinde olması ve daha az doku içinde gömülü ve böylece proteolitik aktivite aynı düzeyde ipek filmleri13çözünebilmektedir daha maruz değil filmidir. Ancak, bazı ipek varlığı virüse karşı yalnız yapılan bir film interstisyel sıvı tarafından ameliyat sırasında akıp çünkü windows3, büyük olasılıkla altında ifade ulaşmak için önemlidir.
Şekil 1: ipek/AAV filmleri optik lifler için uygulanıyor. (A) kronik fiber implantlar XYZ çevirmen monte fiber yan aşağı bir tutucu (gömme) yerleştirilir. Lifler aşağıda sabit bir microinjector ipek/AAV fiber ipuçları üzerine dağıtır. Bir stereoscope sürecinin görselleştirme sağlar. (B) ipek/AAV fiber ipuçları küçük cilt (10-20 nL) olarak uygulanır. Bir çıkarma sonra pipet geri çekmek ve ~ 60 izin s düz film izlemeye kuruması damlacık için. Gerekli birim fiber ucuna kadar uygulanan kadar işlemi tekrarlayın. (C) ipek boyaları inceleyin. Uygunsuz kaplamalar dışa doğru onları (sağda) fiber çıkarmak daha fazla eğilimli hale fiber yüzünden genişletmek iken en uygun kaplama (solda) fiber ucuna merkezli. (D) temsilcisi elyaf 200 ile kaplı ipek/AAV nL ve elde edilen AAV tahrik ChR2-YFP ifade implantasyonu sonrası 2 hafta. Sağdaki kaplama lif yüz fırlamıştı ve ipek/AAV fiber optik implantasyon sırasında uygun değil çünkü neredeyse herhangi bir ifade, büyük olasılıkla sonuçlandı kompakt ipek/AAV kaplama soldaki güçlü ifade, sonuçlandı. Ölçek 0.2 mm (elyaf) ve 1.0 mm (beyin dilim) barlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kurulum için konik fiber kaplama implantları. (A) microinjector konik fiber tutucu monte edilir ve konik lifler uygun fırlatma şırınga konumlandırılmış. (B) BEGIN geniş, (gömme) üzerine gelin ve küçük birimler fırlatma şırınganın konik noktaya doğru hareket ederken dışarı atmak. Konik uzunluğu boyunca sürekli bir kaplama sonuçlanır. (C) hızlı görselleştirme yardım etmek için yeşil karışık ipek ile kaplı temsilcisi konik lif. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kafatası windows kaplama. İpek/AAV el pipet kullanarak uygulamalı kafatası windows olabilir. Bir standart 3 mm çap pencere yavaş yavaş düz film izlemeye kuruyacak 5 µL damlacık ile kaplı. İç metin: kafatası windows ipek/AAV-kaplı olan ve olmayan durectomies implante kaynaklanan GCaMP6f ifadesi. Bu rakam Jackman ve ark. adapte edilmiş (2018) 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ipek/AAV depolama kaplamalı implantlar. (Kalan nem kaldırmak ve viral etkinliği, korumak için,A) implantlar kullanana kadar 4 ° C'de vakum altında depolanması gereken. Bu şekilde depolanan implantlar en az 7 gün için geçerli kalır. (B) ifadesi 4 ipek/AAV boyalı elyaf depolama 7 gün sonra implante kaynaklanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: ipek/AAV-GFP kaplamalı optik lifler güvenilir bir şekilde ifade sürücü. Floresan görüntü dilimleri üzerinden 24 ardışık striatal implantları. Her implant ile 1:1 100-400 nL ipek/AAV-GFP kaplanmış. Bu kohort implantları implant bölgesi (Bu durumda dorsal striatum) ifade kısıtlamak için ipek yeteneğini gösterir. GFP floresan yeşil renkle belirtilir; DAPI boyama mavi renkle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ifade optogentic proteinlerin hedeflemek için ipek/AAV kullanımı geçerli olarak kullanımda olan yaklaşımlar sınırlamalar üstesinden gelir. Birçok çalışmalar başarıyla AAV enjeksiyonları optogenetic proteinler ifade etmek için kullansa da, ifade optik lifler ucu, bölgeler konik elyaf uzunluğu çevresinde ve bir SIRITIŞ lens görüş bölgenin hizalamak için meydan okuyor. Kayma optik bileşenleri ve optogenetic ifade arasında nedeniyle stereotaksik enjeksiyonları güvenilmez olabilir ve birçok deney başarısız. Biz burada tarif yöntemi etiketleme ipek/AAV bu sorunu çözer. Ayrıca ikinci bir cerrahi adım ortadan kaldırarak ve ikinci bir ameliyat ihtiyacını ortadan kaldırarak bazı durumlarda prosedür kolaylaştırır. Aynı zamanda virüs kafatası windows altında yaygın ifade elde etmek için kullanmak zor olabilir ve deneyci genellikle birden fazla yerde virüs enjekte etmek uzun ameliyatları gerçekleştirin. Sadece kaplama kafatası windows ipek/AAV ile büyük kortikal bölgeleri üzerinde yaygın ifade almak için birçok invaziv enjeksiyonları ortadan kaldırır bir basitleştirme yeteneğidir.
Başka bir potansiyel ipek/AAV yöntemi için viral enjeksiyonları karşılaştırıldığında sinir dokularında daha az iltihap neden avantajdır. Yüksek-titresi AAV beyne enjekte (böyle potansiyel komplikasyonlar genellikle olmakla birlikte hücresel ve devre özellikleri14,15 değiştirme potansiyeline sahip reaktif GC gibi inflamatuar yanıt neden olabilir göz ardı). İpek filmleri küçük immünojenik yanıt kendi13 neden ve ipek/AAV filmleri virüs çevreleyen doku viral yük düşük ve immünojenik yanıt-e doğru azaltmak olabilir pek çok saat veya gün16, boyunca serbest bırakmak için bekleniyor. Bir cihazın implantasyonu AAV enjeksiyonu öncesinde geleneksel yaklaşımlar ile inflamatuar yanıt implantasyon ve enjeksiyon ortaya çıkabilir. Gelecekte sistematik olarak geleneksel yaklaşımlar ve ipek/AAV filmleri azaltır olup olmadığını genel olarak belirlemek için ipek/AAV yöntem karşılaştırmak için arzu olacaktır inflamatuar yanıt.
Birkaç adım ipek/AAV filmlerin başarılı kullanımı için kritik öneme sahiptir. En önemlisi, optik elyaf kaplama yöntemleri içinde açıklandığı gibi dikkatle yapılmalıdır ve kurutulmuş filmleri konumunu dikkatle filmleri kompakt, doğru konumda olduğundan emin olmak için mikroskop altında görsel denetim tarafından değerlendirilmesi, ve fiber optik yüze uygun. Fiber optik tarafında herhangi bir ipek/AAV ifade ilgi bölgenin dışında yol açacak ve implantasyon ve lider için güvenilir olmayan veya herhangi bir ifade sırasında lif yüz çıkıntı yediriyorlar filmleri kesiyorum. İpek/AAV implante edilebilir cihazlar için uygulama herhangi bir malzeme kullanmak için adapte edilebilir için tarif bu kolayca kullanılabilir ve ipek/AAV küçük hacimli hassas ifade izin tekniklerdir.
Uygulama biraz doğru tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. İfade lif parça gözlem yapılırsa ipek film fiber yüz yerine fiber kenarında kurumuş olasıdır. Üretim işlemi yineleyin ve filmler tarafında fiber kurutma işaretleri için kurutulmuş implantlar yakından incelemek. İpek/AAV filmleri optik şeffaf olduğu için (hızlı yeşil veya benzer bir boya) (şekil 2C) elde edilen filmlerin şekli daha iyi görselleştirmek için boya ile karışık ipek uygulamadan uygulamaya yardımcı olabilir. Herhangi bir ifade varsa, ipek film implantasyonu-fiber uç--dan yerinden muhtemeldir. İmplantlar yaparken stok-titresi virüs kullanımı öneririz. Optik lifler için bu küçük çaplı lifleri için uygulanması gereken toplam hacmi azaltır. Kaplama boyutu ise bir endişe düşünün artık tam yatırılan damlacık kurutma izin vermek için her 10 nL uygulama arasında bekliyor. İpek/AAV damlacıkları daha hızlı sıcak bir lamba altında kuru. Kafatası windows için yüksek-titresi virüs pia veya dura boyunca yeterli viral yük sağlamak gerekli olabilir. İmplantlar belirli türdeki ipek dağıtılması ve AAV daha kolay diğerlerine göre daha serbest bırakmak. Biz beyin yüzey üzerinde implante kafatası windows belki farklı beyin omurilik akışkanlar dinamiği veya proteaz aktivitesi sayesinde güvenilir ifade ulaşmak için ipek/virüs daha düşük bir oranı gerektiren bulduk. İfade etkili AAV konsantrasyonları artırarak yükseltilemez Eğer sulu ipek hacmi azalan makul bir alternatiftir.
Son olarak, optik bileşenleri düzgün depolamak ve onları çok yakında implant önemlidir onlar hazırlanan sonra. Vakum altında buzdolabında boyalı elyaf kullanmak pek çok gün önce saklanabilir göstermiştir. Vakum depolama ipek filmleri çözünürlük azaltmak, ve ayrıca viral etkinliği sağlamak artık nem17 kaldırır. İdeal olarak, optik elyaf üretim 24 saat içinde implante olması. Ancak, ipek/AAV-boyalı elyaf vakum sürücü 7 gün sonra imalat (şekil 4B) implante zaman ifade benzer düzeyde altında saklanan bulabilirsiniz. Buna ek olarak, ne zaman onlar oda sıcaklığında kurutulur ve hazırlık saat içinde kullanılan kaplanmış kafatası windows ve SIRITIŞ lensler en güvenilir ifade sürdü. Bu eşitsizlik nedeni belirsizdir. Daha fazla çalışmalar daha fazla depolama süresini uzatmak için hazırlık ve depolama koşulları iyileştirmek için gerekli olabilir.
İpek/AAV-kaplı kafatası windows önemli bir potansiyel büyük ölçüde cerrahi kez kısaltın ve üretmek son derece basit, ama şu anda bu yöntemi sınırlamaları vardır çünkü. Kaplamalı kafatası windows düzgün korteks geniş alanlar etiket ve yeterli ifade Katman 2/3 görüntüleme, biraz ile derin katmanları daha az ifade GCaMP için sürücü. Ancak, stereotaksik enjeksiyonları daha sağlam ifade sürücü ve ifade için hedeflenen katmanları üzerinde daha fazla denetim sağlar. Beyin zarı kaldırılır güvenilir ifade sadece sağlanır. Her ne kadar beyin zarı kez görüntü kalitesi8geliştirmek birçok 2-Foton görüntüleme deney için kaldırılır, birçok deney için daha az invazif bir şekilde etiketleme elde etmek için tercih edilir. Biz bu nedenle ipek/AAV dura kaldırmadan kortikal bölgelerde etiketlemek için kullanın yeteneğimizi incelemiş bulunuyoruz. Biz bazı etiketleme elde ancak bu kranyotomi hazırlama sürecinde dura zarar bir sonucu oldu mümkündür. İleri çalışmalar güvenilir korteks dura kaldırmadan etiketlemek için kullanılacak kaplamalı kafatası windows için gereklidir.
Sulu ipek fibroin Bombiks Mori koza üzerinden hazırlanması Rockwood vd ayrıntılarıyla anlatılan (2011) 18. sulu ipek fibroin şu anda piyasada bulunan (% 5 w/v). Her ne kadar bizim deneyler çoğunu bizim laboratuarımızda (% 5-7,5 w/v) hazırlanan sulu ipek fibroin hisse senetleri kullanarak gerçekleştirilen, ticari sulu fibroin kullanarak benzer sonuçlar elde etmiş olursunuz. Sulu fibroin ilâ 3 ay sonra bu kendiliğinden sıvıdan hidrojel18geçişler, 4 ° C'de stabil. Biz tavsiye fibroin hisse senedi ~ 1 mL aliquot bölünmüş ve-80 ° C'de depolanan 1 mL çalışma aliquot (implantlar yüzlerce kaplama için yeterli) 4 ° C'de saklanır ve jel başlayana kadar kullanılır. Dikkatli ol yok sallamak, girdap, tahrik veya kesme Kuvvetleri jelleşme19,20' ye yol açabilir gibi agresif sulu fibroin, pipet.
İpek/AAV filmleri kesin subcortical ifade bir küçük çaplı optik lifler için belgili tanımlık uç, kafatası windows altında yaygın kortikal ifadeden ifade desenleri, geniş bir izin verir. Bu teknikler yaygın AAV ifade vektörel çizimler yararlanmak için geliştirilen ama büyük olasılıkla diğer ifade vektörel çizimler gibi Lentiviruses ya da kuduz virüs beyine dağıtmak için kullanılabilir. İpek filmleri de doku içine viral sürüm geliştirmek için üç boyutlu şekiller halinde üretiliyor. Örneğin, bir durotomy kullanmaya gerek kalmadan kortikal windows altında sürücü güçlü ifade için sırayla, kafatası windows dura ve yayın virüs daha derin kortikal katmanları21' işlemek ipek microneedles dizileri ile kaplı olması. Daha fazla ayrıntılandırma büyük olasılıkla ve ipek/AAV filmleri için yeni uygulamalar virüs sürümü gelişmiş özellikleri sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar J. Vazquez resimler için D. Kaplan ve C. Preda'nın reaktifler ve yararlı rehberlik ve B. Sabatini ve C. Harvey labs vivo içinde görüntüleme için teşekkür etmek istiyorum. Mikroskopi M. Ocana ve kısmen bir bölümü, bir Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar olarak nöral görüntüleme Merkezi tarafından desteklenen Nörobiyoloji görüntüleme Merkezi tarafından mümkün yapıldı ve kontur (NINDS) P30 çekirdek Merkezi (NS072030) verin. Bu eser ve NIH hibe, NINDS R21NS093498, U01NS108177 ve NINDS R35NS097284 için W.G.R ve C.H.C. için bir NIH doktora sonrası bursu F32NS101889 GVR Khodadad Aile Vakfı, Nancy Lurie işaretleri Vakfı tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
References
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B.
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L.
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
